引用本文： 冉文瑛, 朱冬梅, 王媛. 基于絲裂原活化蛋白激酶信號通路燈盞細辛對大鼠急性高眼壓的緩解及視網膜神經節細胞的保護作用. 中華眼底病雜志, 2021, 37(6): 455-461. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210407-00181 復制
青光眼臨床主要特征是因眼壓增高、視神經供血不足而導致的視力下降及視野缺損，嚴重者可致永久性失明[1]。目前臨床所采用的治療方法不能恢復受損視神經組織。燈盞細辛（EBHM）又稱燈盞花，為傳統中草藥，其主要成分是4-羥基黃岑素，可以活血通絡，祛風散寒，民間常用于中風偏癱、胸痹心痛、頭痛等疾病的治療[2-3]。中醫理論認為肝主目，肝精血不足易導致眼病，眼壓升高即機體五臟六腑失衡所致[4]。但其在體內通路的作用機制尚不明確。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在急性高眼壓疾病過程中起到重要作用[5-6]。本研究通過構建急性高眼壓模型，觀察EBMH在緩解高眼壓及保護受損視網膜神經節細胞（RGC）的作用，通過MAPK通路闡述EBMH修護視網膜組織的作用機制，以期為臨床青光眼治療提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
EBHM膠囊（云南昊邦制藥有限公司，國藥準字Z53021653），兔抗鼠p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗體、羊抗兔半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（美國Thermo公司），羊抗兔p38MAPK、p-p38MAPK二抗、兔抗羊Caspase-3二抗、反轉錄試劑盒、SYBR Green 熒光染料（南京諾維贊生物有限公司），蘇木精-伊紅（HE）試劑盒（上海碧云天生物有限公司），蛋白定量試劑盒、顯影液（德國Merk公司）。IX53研究級倒置顯微鏡（日本Olympus公司），酶標儀（美國MD公司），大鼠眼壓計（上海玉研科學儀器有限公司），Veriti96實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR，美國Thermo公司）儀，Tanon4800全自動化學發光成像系統（上海天能有限公司）。
1.2 分組與建模
雄性Sprague-Dawley大鼠60只，5周齡，體重200～220 g，無特定病原體級，賽業模式生物研究中心提供［許可證號SCXK（蘇）2018-0003］。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得鄭州大學附屬鄭州中心醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：20190101）。實驗前大鼠虹膜紋理清晰、瞳孔對光反射正常。
采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、EBHM低劑量組（A組）、EBHM中劑量組（B組）、EBHM高劑量組（C組），每組均為12只。參照文獻[7]的方法建立急性高眼壓模型，以左眼為實驗眼。模型組、A組、B組、C組大鼠按體重0.4 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸奧布卡因點眼。生理鹽水液面與大鼠角膜頂點垂直距離約136 cm［相當于形成100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）眼壓］，將5號針頭連接生理鹽水輸液管，針頭斜面朝上，距角膜緣1.5 mm刺入前房，沿瞳孔方向迅速推入，針頭固定后打開輸液管開關，肉眼可見虹膜變白，檢眼鏡檢查可見視網膜供血完全受阻，1 h后緩慢降低輸液瓶并撤出針頭。眼壓≥22 mm Hg即為建模成功。對照組大鼠僅給予全身麻醉，不作其余操作。
建模后2 d，對照組、模型組大鼠每日灌胃3 ml生理鹽水；A組、B組、C組大鼠分別給予0.30、0.45、0.60 g/100 g EBHM灌胃（溶于3 ml生理鹽水），1次/d。均于至建模后30 d結束。建模前以及建模后1、14、30 d測量大鼠眼壓，每次測量3次，取平均值。
1.3 HE染色觀察大鼠視網膜整體結構
建模后30 d給藥結束后3 h，處死大鼠摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，切開眼球，取出晶狀體，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，HE染色。封片后光學顯微鏡下觀察視網膜組織變化；每張切片選取4個200倍高清視野計數RGC，取平均值。其余視網膜組織保存于－80 ℃，用于mRNA及蛋白相對表達量檢測。
1.4 免疫熒光法檢測RGC數量變化
取4 μm石蠟切片，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，置于5%山羊血清中封閉60 min；緩沖液沖洗后，4 ℃加入Brn3a抗體（1:100稀釋）孵育2 d，PBS沖洗后加入苯基吲哚熒光二抗（1:100稀釋），4 ℃孵育2 d，PBS沖洗后通過甘油封片。熒光顯微鏡觀察并統計RGC數量變化。
1.5 RT-qPCR檢測各組大鼠視網膜中p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量
應用Trizol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。RT-qPCR反應體系：SYBR預混液12.0 μl，10 μmol/L正向、反向引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 13.0 μl。反應條件：98 ℃預變性8 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復55個循環。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照，取3次重復實驗循環閾值（Ct）平均值，Ct值采用Light Cycle R 96軟件進行分析，結果以2?△△CT計算。
表1
引物序列
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量
視網膜組織于4 ℃條件下用PBS沖洗，勻漿后，4 ℃離心，取沉淀加入1 ml RIPA裂解液，4 ℃離心取上清，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，每孔加入60 μg樣品，跑膠結束后，22 V 30 min半干轉印至聚偏氟乙烯膜，脫脂奶粉搖床封閉2 h，加入一抗（1∶2000稀釋）搖床過夜孵育，二抗（1∶10 000）搖床孵育1 h，PBS與Twen-20混合液洗滌3次，加入顯影液，置于化學發光成像系統曝光，以β-actin為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量。
1.7 統計學分析
采用SPSS20.0軟件行統計學分析。符合正態分布的計量資料均以均數±標準差（
±s）表示。多樣本間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
建模后1 d，對照組大鼠均未出現急性高眼壓，其余各組均建模成功。與模型組比較，B組、C組建模后14 d急性高眼壓率較低，差異有統計學意義（χ2=98.701，P＜0.05）；A組、B組、C組建模后30 d急性高眼壓率均為0。A組、B組、C組建模后14、30 d之間急性高眼壓率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。
表2
建模后各組大鼠急性高眼壓率比較（眼數，%）
光學顯微鏡觀察發現，對照組大鼠視網膜結構完整，各層清晰可見；RGC計數未見異常，形態飽滿圓潤。模型組大鼠視網膜明顯變薄；RGC數量大量減少，形態空泡化，排列稀疏。A組、B組、C組大鼠視網膜變厚；RGC數量增多，其中C組視網膜結構恢復程度更好（圖1）。
圖1
給藥結束后各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=4）。1A～1E分別示對照組、模型組、A組、B組、C組。對照組大鼠視網膜結構完整，各層清晰，視網膜神經節細胞（RGC）形態及數量無異常；模型組大鼠視網膜厚度變薄，RGC空泡化嚴重，排列稀疏；A組、B組、C組大鼠視網膜厚度變厚，RGC數量增多，空泡化減輕，C組改善最為明顯 蘇木精-伊紅 ×200
熒光顯微鏡觀察發現，給藥結束后，與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠RGC計數降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組RGC計數升高，差異有統計學意義（F=297.514，P＜0.05），其中C組高于A組和B組（q=2.842、5.263），B組高于C組（q=2.457），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2，3）。
圖2
給藥結束后各組大鼠視網膜組織熒光顯微鏡像（n=4）。2A～2E分別示對照組、模型組、A組、B組、C組。模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜神經節細胞（RGC）計數（黃色）較對照組降低，A組、B組、C組大鼠RGC計數較模型組升高 Brn3b免疫熒光染色 ×400
圖3
各組大鼠給藥結束后視網膜神經節細胞（RGC）計數比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05
RT-qPCR檢測結果顯示，各組大鼠視網膜中p38MAPK mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量降低，差異均有統計學意義（F=267.912，P＜0.05）。大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量組間兩兩比較，C組低于A組和B組（q=6.977、15.642），B組低于A組（q=11.678），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組大鼠視網膜p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
Western blot檢測結果顯示，各組大鼠視網膜中p38MAPK蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量均降低（F=150.061、692.279，P＜0.05）。大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量組間兩兩比較，其中C組低于A組和B組（p-p38MAPK：q=12.443、24.358，Caspase-3：q=6.997、15.642），B組低于A組（p-p38MAPK：q=12.471，Caspase-3：q=10.204），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
給藥結束后各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白表達電泳像（n=4）。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK：磷酸化p38MAPK；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
圖6
給藥結束后各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK：磷酸化p38MAPK；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
3 討論
機械壓迫和視神經缺血引起的視神經損傷是目前青光眼、虹膜炎等眼部疾病發生的主要機制[8]。既往研究表明，RGC凋亡是青光眼的病理基礎，眼壓急劇升高可導致RGC選擇性丟失，視網膜神經病理學改變在高眼壓疾病進程中發揮重要作用[9]。MAPK通路受外界不同因素刺激，將信號從細胞外傳遞至細胞內。其介導眼部損傷，是視網膜病變及糖尿病白內障的重要信號傳導系統[10]。藥理研究表明，EBHM可以改善高眼壓疾病中腎臟結構，保護肝細胞及微血管內皮細胞，調節微循環[11]。但EBHM在急性高眼壓中的具體作用機制仍不明確。本研究通過探討MAPK通路闡述EBHM保護視網膜的作用機制，以期為進一步闡明EBHM修復視網膜損傷機制奠定基礎。
本研究結果顯示，模型組大鼠視網膜結構變薄，RGC排列紊亂稀疏，建模后1、14、30 d眼壓均升高，RGC計數明顯減少，提示大鼠急性高眼壓模型構建成功。前房加壓灌注是常用的大鼠急性高眼壓模型制作方法，操作簡單便捷，可控性強，可以即刻增加大鼠眼壓，造成視網膜損傷。本研究結果顯示，A組、B組、C組大鼠視網膜損傷明顯改善，RGC計數增多，其中C組視網膜結構恢復較好，提示EBHM可以改善視網膜組織病理損傷程度。與模型組大鼠比較，A組、B組、C組大鼠建模后14、30 d眼壓均降低，RGC計數升高，其中C組眼壓最低，RGC計數最高。此結果提示EBMH可以降低眼壓，增加RGC計數，改善視網膜結構。
MAPK通路被不同絲裂原激活后，通過三級激酶模式依次磷酸化，將信號傳遞至下游，主要包括c-Jun氨基末端激酶通路、p38MAPK通路及細胞外信號調節激酶5/BMK1通路[12]。其中p38MAPK通路是MAPK通路的重要組成部分，參與機體炎性因子、細胞凋亡、熱休克等一系列應激反應[13]。Caspase-3作為MAPK通路的下游信號，在細胞凋亡過程中處于重要地位。研究表明，p38MAPK通路的激活可以介導Caspase-3凋亡細胞的線粒體過程，加速細胞凋亡，RGC大量減少加速急性高眼壓相關疾病的發展[14]。MAPK通路在眼部組織中的表達與視網膜病變程度息息相關。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA、蛋白相對表達量上升，p-p38MAPK蛋白相對表達量上升；與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA、蛋白相對表達量降低，p-p38MAPK蛋白相對表達量降低，其中C組最低。這提示EBMH可以降低MAPK通路表達，抑制p38MAPK磷酸化激活，降低Caspase-3信號傳導，保護RGC；并且隨著劑量增加，進一步下調MAPK通路表達，促進視網膜恢復。
本研究結果表明，EBMH可能通過調控MAPK通路，逆轉視網膜結構損傷，提高RGC存活率。本研究不足之處在于未對EBMH干預后大鼠房水及玻璃體腔中EBHM濃度進行檢測。在進一步的研究中，應開展EBHM在大鼠房水及玻璃體腔中的藥代動力學變化，為本研究結論提供更多理論支持。此外，應深入研究EBMH是否存在其他信號通路影響大鼠急性高眼壓模型中RGC存活，為EBMH在眼部疾病中的科學使用提供更多依據。
青光眼臨床主要特征是因眼壓增高、視神經供血不足而導致的視力下降及視野缺損，嚴重者可致永久性失明[1]。目前臨床所采用的治療方法不能恢復受損視神經組織。燈盞細辛（EBHM）又稱燈盞花，為傳統中草藥，其主要成分是4-羥基黃岑素，可以活血通絡，祛風散寒，民間常用于中風偏癱、胸痹心痛、頭痛等疾病的治療[2-3]。中醫理論認為肝主目，肝精血不足易導致眼病，眼壓升高即機體五臟六腑失衡所致[4]。但其在體內通路的作用機制尚不明確。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在急性高眼壓疾病過程中起到重要作用[5-6]。本研究通過構建急性高眼壓模型，觀察EBMH在緩解高眼壓及保護受損視網膜神經節細胞（RGC）的作用，通過MAPK通路闡述EBMH修護視網膜組織的作用機制，以期為臨床青光眼治療提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
EBHM膠囊（云南昊邦制藥有限公司，國藥準字Z53021653），兔抗鼠p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗體、羊抗兔半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（美國Thermo公司），羊抗兔p38MAPK、p-p38MAPK二抗、兔抗羊Caspase-3二抗、反轉錄試劑盒、SYBR Green 熒光染料（南京諾維贊生物有限公司），蘇木精-伊紅（HE）試劑盒（上海碧云天生物有限公司），蛋白定量試劑盒、顯影液（德國Merk公司）。IX53研究級倒置顯微鏡（日本Olympus公司），酶標儀（美國MD公司），大鼠眼壓計（上海玉研科學儀器有限公司），Veriti96實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR，美國Thermo公司）儀，Tanon4800全自動化學發光成像系統（上海天能有限公司）。
1.2 分組與建模
雄性Sprague-Dawley大鼠60只，5周齡，體重200～220 g，無特定病原體級，賽業模式生物研究中心提供［許可證號SCXK（蘇）2018-0003］。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得鄭州大學附屬鄭州中心醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：20190101）。實驗前大鼠虹膜紋理清晰、瞳孔對光反射正常。
采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、EBHM低劑量組（A組）、EBHM中劑量組（B組）、EBHM高劑量組（C組），每組均為12只。參照文獻[7]的方法建立急性高眼壓模型，以左眼為實驗眼。模型組、A組、B組、C組大鼠按體重0.4 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，鹽酸奧布卡因點眼。生理鹽水液面與大鼠角膜頂點垂直距離約136 cm［相當于形成100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）眼壓］，將5號針頭連接生理鹽水輸液管，針頭斜面朝上，距角膜緣1.5 mm刺入前房，沿瞳孔方向迅速推入，針頭固定后打開輸液管開關，肉眼可見虹膜變白，檢眼鏡檢查可見視網膜供血完全受阻，1 h后緩慢降低輸液瓶并撤出針頭。眼壓≥22 mm Hg即為建模成功。對照組大鼠僅給予全身麻醉，不作其余操作。
建模后2 d，對照組、模型組大鼠每日灌胃3 ml生理鹽水；A組、B組、C組大鼠分別給予0.30、0.45、0.60 g/100 g EBHM灌胃（溶于3 ml生理鹽水），1次/d。均于至建模后30 d結束。建模前以及建模后1、14、30 d測量大鼠眼壓，每次測量3次，取平均值。
1.3 HE染色觀察大鼠視網膜整體結構
建模后30 d給藥結束后3 h，處死大鼠摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，切開眼球，取出晶狀體，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，HE染色。封片后光學顯微鏡下觀察視網膜組織變化；每張切片選取4個200倍高清視野計數RGC，取平均值。其余視網膜組織保存于－80 ℃，用于mRNA及蛋白相對表達量檢測。
1.4 免疫熒光法檢測RGC數量變化
取4 μm石蠟切片，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，置于5%山羊血清中封閉60 min；緩沖液沖洗后，4 ℃加入Brn3a抗體（1:100稀釋）孵育2 d，PBS沖洗后加入苯基吲哚熒光二抗（1:100稀釋），4 ℃孵育2 d，PBS沖洗后通過甘油封片。熒光顯微鏡觀察并統計RGC數量變化。
1.5 RT-qPCR檢測各組大鼠視網膜中p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量
應用Trizol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。RT-qPCR反應體系：SYBR預混液12.0 μl，10 μmol/L正向、反向引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 13.0 μl。反應條件：98 ℃預變性8 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復55個循環。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照，取3次重復實驗循環閾值（Ct）平均值，Ct值采用Light Cycle R 96軟件進行分析，結果以2?△△CT計算。
表1
引物序列
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量
視網膜組織于4 ℃條件下用PBS沖洗，勻漿后，4 ℃離心，取沉淀加入1 ml RIPA裂解液，4 ℃離心取上清，二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，每孔加入60 μg樣品，跑膠結束后，22 V 30 min半干轉印至聚偏氟乙烯膜，脫脂奶粉搖床封閉2 h，加入一抗（1∶2000稀釋）搖床過夜孵育，二抗（1∶10 000）搖床孵育1 h，PBS與Twen-20混合液洗滌3次，加入顯影液，置于化學發光成像系統曝光，以β-actin為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量。
1.7 統計學分析
采用SPSS20.0軟件行統計學分析。符合正態分布的計量資料均以均數±標準差（±s）表示。多樣本間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
建模后1 d，對照組大鼠均未出現急性高眼壓，其余各組均建模成功。與模型組比較，B組、C組建模后14 d急性高眼壓率較低，差異有統計學意義（χ2=98.701，P＜0.05）；A組、B組、C組建模后30 d急性高眼壓率均為0。A組、B組、C組建模后14、30 d之間急性高眼壓率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。
表2
建模后各組大鼠急性高眼壓率比較（眼數，%）
光學顯微鏡觀察發現，對照組大鼠視網膜結構完整，各層清晰可見；RGC計數未見異常，形態飽滿圓潤。模型組大鼠視網膜明顯變薄；RGC數量大量減少，形態空泡化，排列稀疏。A組、B組、C組大鼠視網膜變厚；RGC數量增多，其中C組視網膜結構恢復程度更好（圖1）。
圖1
給藥結束后各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=4）。1A～1E分別示對照組、模型組、A組、B組、C組。對照組大鼠視網膜結構完整，各層清晰，視網膜神經節細胞（RGC）形態及數量無異常；模型組大鼠視網膜厚度變薄，RGC空泡化嚴重，排列稀疏；A組、B組、C組大鼠視網膜厚度變厚，RGC數量增多，空泡化減輕，C組改善最為明顯 蘇木精-伊紅 ×200
熒光顯微鏡觀察發現，給藥結束后，與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠RGC計數降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組RGC計數升高，差異有統計學意義（F=297.514，P＜0.05），其中C組高于A組和B組（q=2.842、5.263），B組高于C組（q=2.457），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2，3）。
圖2
給藥結束后各組大鼠視網膜組織熒光顯微鏡像（n=4）。2A～2E分別示對照組、模型組、A組、B組、C組。模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜神經節細胞（RGC）計數（黃色）較對照組降低，A組、B組、C組大鼠RGC計數較模型組升高 Brn3b免疫熒光染色 ×400
圖3
各組大鼠給藥結束后視網膜神經節細胞（RGC）計數比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05
RT-qPCR檢測結果顯示，各組大鼠視網膜中p38MAPK mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量降低，差異均有統計學意義（F=267.912，P＜0.05）。大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA相對表達量組間兩兩比較，C組低于A組和B組（q=6.977、15.642），B組低于A組（q=11.678），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
各組大鼠視網膜p38MAPK、Caspase-3 mRNA相對表達量比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
Western blot檢測結果顯示，各組大鼠視網膜中p38MAPK蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組、A組、B組、C組大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量均降低（F=150.061、692.279，P＜0.05）。大鼠視網膜中p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量組間兩兩比較，其中C組低于A組和B組（p-p38MAPK：q=12.443、24.358，Caspase-3：q=6.997、15.642），B組低于A組（p-p38MAPK：q=12.471，Caspase-3：q=10.204），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
給藥結束后各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白表達電泳像（n=4）。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK：磷酸化p38MAPK；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
圖6
給藥結束后各組大鼠視網膜中p38MAPK、p-p38MAPK、Caspase-3蛋白相對表達量比較（n=4）。a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與A組比較，P＜0.05；d與B組比較，P＜0.05。p38MAPK：p38絲裂原活化蛋白激酶；p-p38MAPK：磷酸化p38MAPK；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
3 討論
機械壓迫和視神經缺血引起的視神經損傷是目前青光眼、虹膜炎等眼部疾病發生的主要機制[8]。既往研究表明，RGC凋亡是青光眼的病理基礎，眼壓急劇升高可導致RGC選擇性丟失，視網膜神經病理學改變在高眼壓疾病進程中發揮重要作用[9]。MAPK通路受外界不同因素刺激，將信號從細胞外傳遞至細胞內。其介導眼部損傷，是視網膜病變及糖尿病白內障的重要信號傳導系統[10]。藥理研究表明，EBHM可以改善高眼壓疾病中腎臟結構，保護肝細胞及微血管內皮細胞，調節微循環[11]。但EBHM在急性高眼壓中的具體作用機制仍不明確。本研究通過探討MAPK通路闡述EBHM保護視網膜的作用機制，以期為進一步闡明EBHM修復視網膜損傷機制奠定基礎。
本研究結果顯示，模型組大鼠視網膜結構變薄，RGC排列紊亂稀疏，建模后1、14、30 d眼壓均升高，RGC計數明顯減少，提示大鼠急性高眼壓模型構建成功。前房加壓灌注是常用的大鼠急性高眼壓模型制作方法，操作簡單便捷，可控性強，可以即刻增加大鼠眼壓，造成視網膜損傷。本研究結果顯示，A組、B組、C組大鼠視網膜損傷明顯改善，RGC計數增多，其中C組視網膜結構恢復較好，提示EBHM可以改善視網膜組織病理損傷程度。與模型組大鼠比較，A組、B組、C組大鼠建模后14、30 d眼壓均降低，RGC計數升高，其中C組眼壓最低，RGC計數最高。此結果提示EBMH可以降低眼壓，增加RGC計數，改善視網膜結構。
MAPK通路被不同絲裂原激活后，通過三級激酶模式依次磷酸化，將信號傳遞至下游，主要包括c-Jun氨基末端激酶通路、p38MAPK通路及細胞外信號調節激酶5/BMK1通路[12]。其中p38MAPK通路是MAPK通路的重要組成部分，參與機體炎性因子、細胞凋亡、熱休克等一系列應激反應[13]。Caspase-3作為MAPK通路的下游信號，在細胞凋亡過程中處于重要地位。研究表明，p38MAPK通路的激活可以介導Caspase-3凋亡細胞的線粒體過程，加速細胞凋亡，RGC大量減少加速急性高眼壓相關疾病的發展[14]。MAPK通路在眼部組織中的表達與視網膜病變程度息息相關。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA、蛋白相對表達量上升，p-p38MAPK蛋白相對表達量上升；與模型組比較，A組、B組、C組大鼠視網膜中Caspase-3 mRNA、蛋白相對表達量降低，p-p38MAPK蛋白相對表達量降低，其中C組最低。這提示EBMH可以降低MAPK通路表達，抑制p38MAPK磷酸化激活，降低Caspase-3信號傳導，保護RGC；并且隨著劑量增加，進一步下調MAPK通路表達，促進視網膜恢復。
本研究結果表明，EBMH可能通過調控MAPK通路，逆轉視網膜結構損傷，提高RGC存活率。本研究不足之處在于未對EBMH干預后大鼠房水及玻璃體腔中EBHM濃度進行檢測。在進一步的研究中，應開展EBHM在大鼠房水及玻璃體腔中的藥代動力學變化，為本研究結論提供更多理論支持。此外，應深入研究EBMH是否存在其他信號通路影響大鼠急性高眼壓模型中RGC存活，為EBMH在眼部疾病中的科學使用提供更多依據。
