引用本文： 殷慧文, 張寧, 尹伊, 張學寧, 劉建曉, 劉曉陽, 王曉莉, 趙巖松. N-乙酰-5-羥色胺對視網膜缺血再灌注損傷大鼠視網膜中腫瘤壞死因子-α表達的影響. 中華眼底病雜志, 2021, 37(6): 462-469. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210222-00091 復制
視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是眼科臨床疾病中常見的病理生理過程，也是目前致盲的主要原因之一[1]。但目前對RIRI尚缺乏有效的治療方案。研究表明，RIRI的發病機制與炎癥反應密切相關[2-3]，因而抑制炎癥反應成為RIRI治療的焦點。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是RIRI后的重要促炎因子，抑制TNF-α蛋白表達可減輕炎癥反應[4]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種抑制細胞應激損傷的轉錄因子，血紅素氧合酶1（HO-1）為其下游分子，二者與炎癥反應的負性調控密切相關[5]。N-乙酰-5-羥色胺（NAS）是褪黑素的前體物質，具有更強的抗凋亡、抗炎的生物活性作用[6-8]。本課題組前期研究發現，褪黑素可以通過上調Nrf2、HO-1蛋白的表達，抑制RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡[9]。既往研究證實，褪黑素可顯著上調Nrf2、HO-1蛋白表達，抑制脂多糖誘導的巨噬細胞分泌促炎介質，發揮抗炎作用[10]。我們推測NAS可通過Nrf2/HO-1通路抑制TNF-α蛋白表達，從而減輕RIRI。為此，本研究通過構建RIRI模型，觀察NAS對RIRI大鼠視網膜組織形態、TNF-α蛋白表達變化的影響，并從Nrf2/HO-1信號通路探討其機制，以期為NAS治療的臨床應用提供科學的理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗分組及建模
NAS（美國Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α（北京索萊寶科技有限公司），兔抗大鼠Nrf2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（武漢三鷹生物技術有限公司），HO-1（武漢博士德生物工程有限公司）一抗，兔抗TNF-α、Nrf2、HO-1（美國CST公司）一抗。兔抗二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），光學顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司），高性能成像分析系統（美國ProteinSimple公司）。
雄性Sprague-Dawley大鼠90只，7～8周齡，體重200～230 g，無特定病原體級，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：SCXK（魯）20190003]。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得濰坊醫學院動物倫理委員會許可（倫理編號：2019SDL099）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（10只）、RIRI組（40只）、NAS組（40只）。
參照文獻[11]的方法建立RIRI模型，以右眼為實驗眼。RIRI組、NAS組大鼠按體重0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼局部麻醉。27G針頭自顳側角膜緣刺入前房并固定，生理鹽水液面與大鼠角膜頂點垂直距離約150 cm，使眼壓升至110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），此時可見大鼠球結膜變蒼白，前房加深；直接檢眼鏡檢查可見視盤蒼白，視網膜血流中斷。維持前房加壓60 min后，逐漸恢復眼壓，可見眼底視網膜血流恢復，建模成功；蘇木精-伊紅（HE）染色組織學驗證模型。假手術組大鼠僅將針頭自顳側角膜緣刺入右眼前房，不做其他處理。NAS組大鼠于建模前及建模后30 min腹腔注射NAS，10 mg/（kg·次）；假手術組、RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。
1.2 HE染色觀察大鼠視網膜組織病理變化并計數視網膜神經節細胞（RGC）
建模后6、12、24、72 h，各組取6只大鼠腹腔麻醉處死，摘除眼球并置于眼球固定液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋。平行于眼球矢狀軸行非連續切片，每3～4張切片取1張，厚度約4 μm。HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜細胞形態學變化。應用CellSens Dimension 1.6圖像分析軟件于視盤兩側100～300 μm內，隨機取4點測量視網膜厚度，即視網膜內界膜至色素上皮層間的距離，計算平均視網膜厚度[9]；并計數視盤外200 μm內神經節細胞層（GCL）單位面積RGC。
1.3 免疫組織化學染色及蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠視網膜中Nrf2、HO-1、TNF-α蛋白表達
建模后12 h，大鼠視網膜石蠟切片脫蠟、梯度乙醇水合至水，水浴加熱修復抗原，3% H2O2去除內源性過氧化物酶。正常山羊血清 37 ℃封閉60 min，棄封閉液，分別滴加兔抗大鼠TNF-α（1∶100）、Nrf2（1∶300）和HO-1（1∶100）一抗，0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照，4 ℃過夜。沖洗后，滴加山羊抗兔二抗，二氨基聯苯胺顯色，光學顯微鏡下觀察。TNF-α+、HO-1+細胞胞漿及Nrf2+細胞胞漿或胞核呈棕黃色。蘇木素染核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察、拍照并計數各組大鼠視網膜單位面積TNF-α+、Nrf2+、HO-1+細胞。
建模后6、12、24、72 h，取各組3只大鼠視網膜新鮮組織，二喹啉甲酸法檢測Nrf2、HO-1、TNF-α蛋白含量。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移（200 mA）1 h（TNF-α、HO-1、GAPDH）或1 h 50 min（Nrf2）至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h，分別加入兔抗TNF-α（1∶500）、兔抗Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶500）和GAPDH一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）封閉1.5 h，電化學發光試劑盒顯影，化學發光儀拍照，Image J軟件進行條帶灰度分析。以GAPDH為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學分析
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間差異采用單因素方差分析。方差齊性時，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；一般線性回歸法分析建模后12 h時，RIRI組與NAS組TNF-α+細胞數差值與活性Nrf2+、HO-1+細胞數差值的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，假手術組大鼠視網膜各層細胞形態規則，排列整齊，可見較多RGC。建模后6、12、24 h，RIRI組大鼠視網膜細胞排列紊亂，視網膜細胞嚴重水腫；NAS組大鼠視網膜各層細胞形態較規則，排列較整齊，仍可見視網膜細胞水腫（圖1）。
圖1
建模后12 h各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。1A示假手術組，視網膜各層形態完整，細胞排列有序；1B示RIRI組，視網膜水腫，細胞排列紊亂；1C示NAS組，視網膜各層細胞排列較整齊 蘇木精-伊紅 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺
建模后6、12、24 h，RIRI組大鼠視網膜厚度較假手術組明顯增厚，差異有統計學意義（F=251.240、1 107.798、39.864，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜厚度顯著薄于RIRI組（F=9.645、477.150、2.432），但仍厚于假手術組（F=101.548、183.117、113.489），差異均有統計學意義（P＜0.05）。建模后72 h，RIRI組大鼠視網膜萎縮，其厚度顯著薄于NAS組，差異有統計學意義（F=123.408，P＜0.01）（表1，圖2）。
表1
建模后不同時間各組大鼠視網膜厚度比較（μm，
±s）
圖2
建模后不同時間假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜厚度比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺
建模后6、12、24、72 h，RIRI組大鼠視網膜RGC計數顯著低于假手術組，差異有統計學意義（F=34.321、122.740、187.234、317.675，P＜0.01）。建模后6 h，NAS組大鼠視網膜RGC計數開始降低，至建模后12 h達較低水平，其后逐漸增加，均顯著高于RIRI組（F=12.225、12.848、117.655、306.394），但仍低于假手術組（F=11.667、46.025、35.659、30.991），差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2，圖3）。
表2
建模后不同時間各組大鼠視網膜RGC計數比較（個/mm2，
±s）
圖3
建模后不同時間各組大鼠視網膜RGC計數比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；RGC：視網膜神經節細胞
免疫組織化學染色結果顯示，假手術組大鼠視網膜各層偶見少量TNF-α+細胞，胞漿呈棕黃色；建模后6、12、24、72 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織均可見TNF-α+細胞，多位于GCL、內核層（INL）（圖4）。建模后不同時間，RIRI組（F=105.893、1 356.076、434.026、337.351）、NAS組（F=40.709、151.032、156.321、216.035）大鼠視網膜TNF-α+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數明顯少于RIRI組，差異有統計學意義（F=15.408、570.482、21.070、13.767，P＜0.05）（表3，圖5）。
圖4
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。4A～4D、4E～4H、4I～4L分別示假手術組、RIRI組、NAS組建模后6、12、24、72 h。假手術組視網膜各層可見少量TNF-α+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜TNF-α+細胞數明顯增多（紅箭）；NAS組視網膜TNF-α+細胞數明顯降低（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
表3
建模后不同時間各組大鼠視網膜TNF-α+細胞數比較（個/mm2，
±s）
圖5
建模后不同時間假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
假手術組大鼠視網膜各層均可見Nrf2+細胞，胞漿呈棕黃色。建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜GCL、INL均可見較多Nrf2+細胞，細胞核呈棕黃色（圖6）。假手術組大鼠視網膜Nrf2+細胞數為（184.27±20.49）個/mm2；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜Nrf2+細胞數分別為（389.67±43.76）、（565.89±77.34）個/mm2。RIRI組大鼠視網膜Nrf2+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（F=170.354，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜Nrf2+細胞數明顯多于RIRI組，差異有統計學意義（F=51.122，P＜0.01）。
圖6
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。6A～6C分別示假手術組、RIRI組、NAS組。假手術組視網膜各層偶見少量Nrf2+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜Nrf2+細胞數增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）；NAS組視網膜Nrf2+細胞數明顯增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；Nrf2：核因子E2相關因子2；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
假手術組大鼠視網膜各層偶見少量HO-1+細胞；建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜HO-1+細胞數顯著多于假手術組；NAS組大鼠視網膜GCL、INL可見大量HO-1+細胞（圖7）。假手術組大鼠視網膜HO-1+細胞數為（161.01±13.25）個/mm2；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜HO-1+細胞數分別為（275.05±29.46）、（339.05±29.38）個/mm2。RIRI組大鼠視網膜HO-1+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（F=105.083，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜HO-1+細胞數明顯多于RIRI組，差別有統計學意義（F=30.750，P＜0.01）。
圖7
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。7A～7C分別示假手術組、RIRI組、NAS組。假手術組視網膜各層偶見少量HO-1+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜HO-1+細胞數增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）；NAS組視網膜Nrf2+細胞數顯著增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；HO-1：血紅素氧合酶1；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
Western blot檢測結果顯示，假手術組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量較低。建模后6 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量開始升高，其中RIRI組至12 h達較高水平后下降，NAS組至建模后24 h達較高水平后下降；與假手術組比較，差異均有統計學意義（RIRI組：F=92.906、534.948、327.600、385.324，P＜0.01；NAS組：F=33.943、79.729、74.057、64.488，P＜0.01）（圖8）。
圖8
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量比較（ n =4）。8A示電泳圖，1～9分別示假手術組、RIRI組6 h、NAS組6 h、RIRI組12 h、NAS組12 h、RIRI組24 h、NAS組24 h、RIRI組72 h、NAS組72 h。8B示建模后不同時間各組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
假手術組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量為0.377±0.015；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量分別為0.760±0.031、0.980±0.058。假手術組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量較少；建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量明顯高于假手術組，差異有統計學意義（F=371.932，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量明顯高于RIRI、假手術組，差異均有統計學意義（F=33.972、307.200，P＜0.05、＜0.01）（圖9）。
圖9
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量比較（n=4）。9A示電泳圖，1～3分別示假手術組、RIRI組、NAS組。9B示各組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；Nrf2：核因子E2相關因子2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶
假手術組視網膜中HO-1蛋白相對表達量為0.375±0.009；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量分別為0.702±0.090、0.932±0.025。假手術組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量較少；RIRI組視網膜HO-1相對蛋白表達量明顯高于假手術組，差別有統計學意義（F=39.557，P＜0.05）；NAS組大鼠視網膜HO-1相對蛋白表達量明顯高于RIRI組、假手術組，差異均有統計學意義（F=18.283、1 361.927，P＜0.05、＜0.01）（圖10）。
圖10
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量比較（n=4）。10A示電泳圖，1～3分別示假手術組、RIRI組、NAS組。10B示各組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；HO-1：血紅素氧合酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶
一般線性回歸分析結果顯示，建模后12 h，RIRI組、NAS組TNF-α+細胞數差值與Nrf2+（r2=0.923）、HO-1+（r2=0.936）細胞數差值均呈負相關（P＜0.01）（圖11）。
圖11
建模后12 h大鼠視網膜TNF-α+細胞數差值與各相關指標的相關性分析圖。11A示TNF-α+細胞數差值與Nrf2+細胞數差值呈負相關；11B示TNF-α+細胞數差值與HO-1+細胞數差值呈負相關。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；Nrf2：核因子E2相關因子2；HO-1：血紅素氧合酶1
3 討論
RIRI常見于青光眼、糖尿病視網膜病變、視網膜血管阻塞等，可導致患者視力障礙甚至喪失[1]。本研究結果顯示，RIRI后6、12、24 h，視網膜細胞水腫且排列紊亂，視網膜厚度增加；RIRI后72 h，視網膜萎縮、變薄且RGC計數顯著降低，RIRI建模成功。在此基礎上，經NAS干預，RIRI后6、12、24 h，大鼠視網膜水腫減輕；而在RIRI后72 h，其視網膜厚度較RIRI組增厚。這提示NAS可改善RIRI大鼠視網膜細胞形態學，減輕RIRI，具有神經保護作用。
炎癥反應在RIRI的病理發展過程中發揮極其重要的作用，TNF-α是重要的促炎因子之一，可引發組織細胞水腫，形成并加重氧化應激反應，從而導致組織損傷[12]。本研究動態觀察結果顯示，建模后6 h，RIRI組大鼠視網膜GCL、INL可見較多TNF-α+細胞，12 h達到較高水平，且數量多于假手術組，其后下降，結果與文獻報道結果一致[13]；建模后6 h，NAS組大鼠視網膜GCL、INL可見TNF-α+細胞，24 h達到較高水平，72 h后降低，各時間點均少于RIRI組；Western blot檢測結果顯示，建模后不同時間點NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量均低于RIRI組。這提示RIRI可促進大鼠視網膜細胞促炎因子TNF-α的表達，以建模后12 h為著；NAS可抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白的表達，但其機制尚有待于進一步研究。
Nrf2/HO-1信號通路在調控炎癥反應及氧化應激中占有重要地位。研究發現，RIRI早期，炎癥反應可活化Nrf2/HO-1通路，表現為Nrf2被激活，由胞漿入核啟動下游的HO-1表達[14]，進而可抑制TNF-α蛋白的表達，減輕炎癥反應[15]。本研究結果顯示，建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜中Nrf2、HO-1蛋白表達較假手術組增加，結果與文獻報道結果一致[16]。Yoo等[17]發現，NAS可促進氧化應激引起的小鼠海馬神經元細胞中Nrf2核轉位，激活Nrf2信號通路，對海馬神經元發揮神經保護作用，但NAS經Nrf2/HO-1通路對視網膜的保護作用尚未見報道。本研究Western blot檢測結果顯示，NAS組大鼠視網膜中Nrf2、HO-1蛋白水平均高于RIRI組；免疫組織化學染色結果也顯示NAS組大鼠視網膜胞核內Nrf2+、HO-1+細胞數多于RIRI組。這提示在RIRI中，NAS可通過促進視網膜Nrf2核轉位，上調Nrf2、HO-1蛋白的表達，進而抑制TNF-α蛋白表達水平，從而減輕RIRI。為進一步驗證此結果，本研究對建模后12 h時RIRI組、NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數差值與Nrf2+、HO-1+細胞數差值進行相關性分析，發現兩組TNF-α+細胞數差值均與Nrf2+、HO-1+細胞數差值呈負相關，提示NAS可能通過Nrf2/HO-1通路抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白表達，從而減輕RIRI，發揮保護作用。
本研究結果表明，NAS可抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白表達，進而減輕RIRI，其機制可能與Nrf2/HO-1通路有關，具有神經保護作用。但有關NAS對大鼠視網膜電生理反應的影響、NAS治療的時效及其副作用以及NAS如何經Nrf2/HO-1通路調控炎性介質的表達，從而減輕RIRI，尚有待于進一步探究。
視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是眼科臨床疾病中常見的病理生理過程，也是目前致盲的主要原因之一[1]。但目前對RIRI尚缺乏有效的治療方案。研究表明，RIRI的發病機制與炎癥反應密切相關[2-3]，因而抑制炎癥反應成為RIRI治療的焦點。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是RIRI后的重要促炎因子，抑制TNF-α蛋白表達可減輕炎癥反應[4]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種抑制細胞應激損傷的轉錄因子，血紅素氧合酶1（HO-1）為其下游分子，二者與炎癥反應的負性調控密切相關[5]。N-乙酰-5-羥色胺（NAS）是褪黑素的前體物質，具有更強的抗凋亡、抗炎的生物活性作用[6-8]。本課題組前期研究發現，褪黑素可以通過上調Nrf2、HO-1蛋白的表達，抑制RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡[9]。既往研究證實，褪黑素可顯著上調Nrf2、HO-1蛋白表達，抑制脂多糖誘導的巨噬細胞分泌促炎介質，發揮抗炎作用[10]。我們推測NAS可通過Nrf2/HO-1通路抑制TNF-α蛋白表達，從而減輕RIRI。為此，本研究通過構建RIRI模型，觀察NAS對RIRI大鼠視網膜組織形態、TNF-α蛋白表達變化的影響，并從Nrf2/HO-1信號通路探討其機制，以期為NAS治療的臨床應用提供科學的理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗分組及建模
NAS（美國Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α（北京索萊寶科技有限公司），兔抗大鼠Nrf2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（武漢三鷹生物技術有限公司），HO-1（武漢博士德生物工程有限公司）一抗，兔抗TNF-α、Nrf2、HO-1（美國CST公司）一抗。兔抗二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），光學顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司），高性能成像分析系統（美國ProteinSimple公司）。
雄性Sprague-Dawley大鼠90只，7～8周齡，體重200～230 g，無特定病原體級，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：SCXK（魯）20190003]。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得濰坊醫學院動物倫理委員會許可（倫理編號：2019SDL099）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（10只）、RIRI組（40只）、NAS組（40只）。
參照文獻[11]的方法建立RIRI模型，以右眼為實驗眼。RIRI組、NAS組大鼠按體重0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼局部麻醉。27G針頭自顳側角膜緣刺入前房并固定，生理鹽水液面與大鼠角膜頂點垂直距離約150 cm，使眼壓升至110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），此時可見大鼠球結膜變蒼白，前房加深；直接檢眼鏡檢查可見視盤蒼白，視網膜血流中斷。維持前房加壓60 min后，逐漸恢復眼壓，可見眼底視網膜血流恢復，建模成功；蘇木精-伊紅（HE）染色組織學驗證模型。假手術組大鼠僅將針頭自顳側角膜緣刺入右眼前房，不做其他處理。NAS組大鼠于建模前及建模后30 min腹腔注射NAS，10 mg/（kg·次）；假手術組、RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。
1.2 HE染色觀察大鼠視網膜組織病理變化并計數視網膜神經節細胞（RGC）
建模后6、12、24、72 h，各組取6只大鼠腹腔麻醉處死，摘除眼球并置于眼球固定液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋。平行于眼球矢狀軸行非連續切片，每3～4張切片取1張，厚度約4 μm。HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜細胞形態學變化。應用CellSens Dimension 1.6圖像分析軟件于視盤兩側100～300 μm內，隨機取4點測量視網膜厚度，即視網膜內界膜至色素上皮層間的距離，計算平均視網膜厚度[9]；并計數視盤外200 μm內神經節細胞層（GCL）單位面積RGC。
1.3 免疫組織化學染色及蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠視網膜中Nrf2、HO-1、TNF-α蛋白表達
建模后12 h，大鼠視網膜石蠟切片脫蠟、梯度乙醇水合至水，水浴加熱修復抗原，3% H2O2去除內源性過氧化物酶。正常山羊血清 37 ℃封閉60 min，棄封閉液，分別滴加兔抗大鼠TNF-α（1∶100）、Nrf2（1∶300）和HO-1（1∶100）一抗，0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照，4 ℃過夜。沖洗后，滴加山羊抗兔二抗，二氨基聯苯胺顯色，光學顯微鏡下觀察。TNF-α+、HO-1+細胞胞漿及Nrf2+細胞胞漿或胞核呈棕黃色。蘇木素染核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察、拍照并計數各組大鼠視網膜單位面積TNF-α+、Nrf2+、HO-1+細胞。
建模后6、12、24、72 h，取各組3只大鼠視網膜新鮮組織，二喹啉甲酸法檢測Nrf2、HO-1、TNF-α蛋白含量。15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移（200 mA）1 h（TNF-α、HO-1、GAPDH）或1 h 50 min（Nrf2）至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h，分別加入兔抗TNF-α（1∶500）、兔抗Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶500）和GAPDH一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）封閉1.5 h，電化學發光試劑盒顯影，化學發光儀拍照，Image J軟件進行條帶灰度分析。以GAPDH為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學分析
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析。方差齊性時，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；一般線性回歸法分析建模后12 h時，RIRI組與NAS組TNF-α+細胞數差值與活性Nrf2+、HO-1+細胞數差值的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，假手術組大鼠視網膜各層細胞形態規則，排列整齊，可見較多RGC。建模后6、12、24 h，RIRI組大鼠視網膜細胞排列紊亂，視網膜細胞嚴重水腫；NAS組大鼠視網膜各層細胞形態較規則，排列較整齊，仍可見視網膜細胞水腫（圖1）。
圖1
建模后12 h各組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。1A示假手術組，視網膜各層形態完整，細胞排列有序；1B示RIRI組，視網膜水腫，細胞排列紊亂；1C示NAS組，視網膜各層細胞排列較整齊 蘇木精-伊紅 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺
建模后6、12、24 h，RIRI組大鼠視網膜厚度較假手術組明顯增厚，差異有統計學意義（F=251.240、1 107.798、39.864，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜厚度顯著薄于RIRI組（F=9.645、477.150、2.432），但仍厚于假手術組（F=101.548、183.117、113.489），差異均有統計學意義（P＜0.05）。建模后72 h，RIRI組大鼠視網膜萎縮，其厚度顯著薄于NAS組，差異有統計學意義（F=123.408，P＜0.01）（表1，圖2）。
表1
建模后不同時間各組大鼠視網膜厚度比較（μm，±s）
圖2
建模后不同時間假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜厚度比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺
建模后6、12、24、72 h，RIRI組大鼠視網膜RGC計數顯著低于假手術組，差異有統計學意義（F=34.321、122.740、187.234、317.675，P＜0.01）。建模后6 h，NAS組大鼠視網膜RGC計數開始降低，至建模后12 h達較低水平，其后逐漸增加，均顯著高于RIRI組（F=12.225、12.848、117.655、306.394），但仍低于假手術組（F=11.667、46.025、35.659、30.991），差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2，圖3）。
表2
建模后不同時間各組大鼠視網膜RGC計數比較（個/mm2，±s）
圖3
建模后不同時間各組大鼠視網膜RGC計數比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；RGC：視網膜神經節細胞
免疫組織化學染色結果顯示，假手術組大鼠視網膜各層偶見少量TNF-α+細胞，胞漿呈棕黃色；建模后6、12、24、72 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織均可見TNF-α+細胞，多位于GCL、內核層（INL）（圖4）。建模后不同時間，RIRI組（F=105.893、1 356.076、434.026、337.351）、NAS組（F=40.709、151.032、156.321、216.035）大鼠視網膜TNF-α+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數明顯少于RIRI組，差異有統計學意義（F=15.408、570.482、21.070、13.767，P＜0.05）（表3，圖5）。
圖4
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。4A～4D、4E～4H、4I～4L分別示假手術組、RIRI組、NAS組建模后6、12、24、72 h。假手術組視網膜各層可見少量TNF-α+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜TNF-α+細胞數明顯增多（紅箭）；NAS組視網膜TNF-α+細胞數明顯降低（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
表3
建模后不同時間各組大鼠視網膜TNF-α+細胞數比較（個/mm2，±s）
圖5
建模后不同時間假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數比較（n=6）。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
假手術組大鼠視網膜各層均可見Nrf2+細胞，胞漿呈棕黃色。建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜GCL、INL均可見較多Nrf2+細胞，細胞核呈棕黃色（圖6）。假手術組大鼠視網膜Nrf2+細胞數為（184.27±20.49）個/mm2；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜Nrf2+細胞數分別為（389.67±43.76）、（565.89±77.34）個/mm2。RIRI組大鼠視網膜Nrf2+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（F=170.354，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜Nrf2+細胞數明顯多于RIRI組，差異有統計學意義（F=51.122，P＜0.01）。
圖6
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。6A～6C分別示假手術組、RIRI組、NAS組。假手術組視網膜各層偶見少量Nrf2+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜Nrf2+細胞數增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）；NAS組視網膜Nrf2+細胞數明顯增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；Nrf2：核因子E2相關因子2；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
假手術組大鼠視網膜各層偶見少量HO-1+細胞；建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜HO-1+細胞數顯著多于假手術組；NAS組大鼠視網膜GCL、INL可見大量HO-1+細胞（圖7）。假手術組大鼠視網膜HO-1+細胞數為（161.01±13.25）個/mm2；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜HO-1+細胞數分別為（275.05±29.46）、（339.05±29.38）個/mm2。RIRI組大鼠視網膜HO-1+細胞數明顯多于假手術組，差異有統計學意義（F=105.083，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜HO-1+細胞數明顯多于RIRI組，差別有統計學意義（F=30.750，P＜0.01）。
圖7
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（n=6）。7A～7C分別示假手術組、RIRI組、NAS組。假手術組視網膜各層偶見少量HO-1+細胞（紅箭）；RIRI組視網膜HO-1+細胞數增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）；NAS組視網膜Nrf2+細胞數顯著增多，主要分布于GCL、INL（紅箭）免疫組織化學染色 標尺：20 μm。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；HO-1：血紅素氧合酶1；GCL：神經節細胞層；INL：內核層
Western blot檢測結果顯示，假手術組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量較低。建模后6 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量開始升高，其中RIRI組至12 h達較高水平后下降，NAS組至建模后24 h達較高水平后下降；與假手術組比較，差異均有統計學意義（RIRI組：F=92.906、534.948、327.600、385.324，P＜0.01；NAS組：F=33.943、79.729、74.057、64.488，P＜0.01）（圖8）。
圖8
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量比較（ n =4）。8A示電泳圖，1～9分別示假手術組、RIRI組6 h、NAS組6 h、RIRI組12 h、NAS組12 h、RIRI組24 h、NAS組24 h、RIRI組72 h、NAS組72 h。8B示建模后不同時間各組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；TNF-α：腫瘤壞死因子-α
假手術組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量為0.377±0.015；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量分別為0.760±0.031、0.980±0.058。假手術組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量較少；建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量明顯高于假手術組，差異有統計學意義（F=371.932，P＜0.01）；NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量明顯高于RIRI、假手術組，差異均有統計學意義（F=33.972、307.200，P＜0.05、＜0.01）（圖9）。
圖9
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達量比較（n=4）。9A示電泳圖，1～3分別示假手術組、RIRI組、NAS組。9B示各組大鼠視網膜中Nrf2蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；Nrf2：核因子E2相關因子2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶
假手術組視網膜中HO-1蛋白相對表達量為0.375±0.009；建模后12 h，RIRI組、NAS組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量分別為0.702±0.090、0.932±0.025。假手術組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量較少；RIRI組視網膜HO-1相對蛋白表達量明顯高于假手術組，差別有統計學意義（F=39.557，P＜0.05）；NAS組大鼠視網膜HO-1相對蛋白表達量明顯高于RIRI組、假手術組，差異均有統計學意義（F=18.283、1 361.927，P＜0.05、＜0.01）（圖10）。
圖10
假手術組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達量比較（n=4）。10A示電泳圖，1～3分別示假手術組、RIRI組、NAS組。10B示各組大鼠視網膜中HO-1蛋白相對表達結果。*與假手術組比較，P＜0.05；#與RIRI組比較，P＜0.05。RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；HO-1：血紅素氧合酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶
一般線性回歸分析結果顯示，建模后12 h，RIRI組、NAS組TNF-α+細胞數差值與Nrf2+（r2=0.923）、HO-1+（r2=0.936）細胞數差值均呈負相關（P＜0.01）（圖11）。
圖11
建模后12 h大鼠視網膜TNF-α+細胞數差值與各相關指標的相關性分析圖。11A示TNF-α+細胞數差值與Nrf2+細胞數差值呈負相關；11B示TNF-α+細胞數差值與HO-1+細胞數差值呈負相關。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；Nrf2：核因子E2相關因子2；HO-1：血紅素氧合酶1
3 討論
RIRI常見于青光眼、糖尿病視網膜病變、視網膜血管阻塞等，可導致患者視力障礙甚至喪失[1]。本研究結果顯示，RIRI后6、12、24 h，視網膜細胞水腫且排列紊亂，視網膜厚度增加；RIRI后72 h，視網膜萎縮、變薄且RGC計數顯著降低，RIRI建模成功。在此基礎上，經NAS干預，RIRI后6、12、24 h，大鼠視網膜水腫減輕；而在RIRI后72 h，其視網膜厚度較RIRI組增厚。這提示NAS可改善RIRI大鼠視網膜細胞形態學，減輕RIRI，具有神經保護作用。
炎癥反應在RIRI的病理發展過程中發揮極其重要的作用，TNF-α是重要的促炎因子之一，可引發組織細胞水腫，形成并加重氧化應激反應，從而導致組織損傷[12]。本研究動態觀察結果顯示，建模后6 h，RIRI組大鼠視網膜GCL、INL可見較多TNF-α+細胞，12 h達到較高水平，且數量多于假手術組，其后下降，結果與文獻報道結果一致[13]；建模后6 h，NAS組大鼠視網膜GCL、INL可見TNF-α+細胞，24 h達到較高水平，72 h后降低，各時間點均少于RIRI組；Western blot檢測結果顯示，建模后不同時間點NAS組大鼠視網膜中TNF-α蛋白相對表達量均低于RIRI組。這提示RIRI可促進大鼠視網膜細胞促炎因子TNF-α的表達，以建模后12 h為著；NAS可抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白的表達，但其機制尚有待于進一步研究。
Nrf2/HO-1信號通路在調控炎癥反應及氧化應激中占有重要地位。研究發現，RIRI早期，炎癥反應可活化Nrf2/HO-1通路，表現為Nrf2被激活，由胞漿入核啟動下游的HO-1表達[14]，進而可抑制TNF-α蛋白的表達，減輕炎癥反應[15]。本研究結果顯示，建模后12 h，RIRI組大鼠視網膜中Nrf2、HO-1蛋白表達較假手術組增加，結果與文獻報道結果一致[16]。Yoo等[17]發現，NAS可促進氧化應激引起的小鼠海馬神經元細胞中Nrf2核轉位，激活Nrf2信號通路，對海馬神經元發揮神經保護作用，但NAS經Nrf2/HO-1通路對視網膜的保護作用尚未見報道。本研究Western blot檢測結果顯示，NAS組大鼠視網膜中Nrf2、HO-1蛋白水平均高于RIRI組；免疫組織化學染色結果也顯示NAS組大鼠視網膜胞核內Nrf2+、HO-1+細胞數多于RIRI組。這提示在RIRI中，NAS可通過促進視網膜Nrf2核轉位，上調Nrf2、HO-1蛋白的表達，進而抑制TNF-α蛋白表達水平，從而減輕RIRI。為進一步驗證此結果，本研究對建模后12 h時RIRI組、NAS組大鼠視網膜TNF-α+細胞數差值與Nrf2+、HO-1+細胞數差值進行相關性分析，發現兩組TNF-α+細胞數差值均與Nrf2+、HO-1+細胞數差值呈負相關，提示NAS可能通過Nrf2/HO-1通路抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白表達，從而減輕RIRI，發揮保護作用。
本研究結果表明，NAS可抑制RIRI大鼠視網膜中TNF-α蛋白表達，進而減輕RIRI，其機制可能與Nrf2/HO-1通路有關，具有神經保護作用。但有關NAS對大鼠視網膜電生理反應的影響、NAS治療的時效及其副作用以及NAS如何經Nrf2/HO-1通路調控炎性介質的表達，從而減輕RIRI，尚有待于進一步探究。
