引用本文： 趙琦, 安偉婷, 劉勃實, 徐嫚鴻, 東莉潔, 李筱榮, 韓金棟. miR-191抑制視網膜血管內皮細胞增生和血管形成. 中華眼底病雜志, 2022, 38(1): 49-55. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210406-00176 復制
視網膜新生血管（RNV）多因視網膜缺血缺氧造成新生血管生成因子與抑制因子表達失衡[1-2]，并進一步促進血管內皮細胞的分裂與增生而引起，因此抑制血管內皮細胞的增生與遷移有助于抑制新生血管的生成。miRNA是一類小分子非編碼 RNA。作為一種新型的基因表達調控因子，miRNA與腫瘤、糖尿病和心血管病變等多種疾病密切相關，參與細胞增生、遷移、凋亡及新生血管生成等一系列生物學過程[3-4]。研究發現，miR-191可通過靶向重要轉錄因子、染色質重塑和細胞周期相關基因調控細胞的生物學過程[5]。前期miRNA芯片分析發現氧誘導視網膜病變小鼠視網膜組織中miR-191表達明顯下調，推測miR-191降低可能參與了RNV的發生。本研究通過慢病毒載體將miR-191轉染至人視網膜血管內皮細胞（hREC），觀察其對細胞增生及遷移的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、分組及建模
攜帶miR-191的慢病毒載體（LV-191）、空白慢病毒載體（LV-vector）（上海漢恒生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（AE301，北京全式金生生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）；hREC（美國Sciencell公司）；缺氧誘導裝置（美國Billups-Rothenberg公司）；7900HT實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）儀（美國ABI公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。
取6~8代對數生長期hREC，將其分為對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。對照組細胞正常條件培養；缺氧組細胞置于2%O2、98%N2的密閉缺氧誘導裝置中，37 ℃培養3 h后再放回正常氧濃度繼續培養24 h；LV-vector組、LV-191組細胞在相應慢病毒載體轉染48 h后置于2%O2、98%N2的密閉缺氧誘導裝置中，37 ℃培養3 h后再放回正常氧濃度繼續培養24 h。
1.2 慢病毒轉染hREC
將hREC以5×105個/孔的細胞密度接種于細胞培養板中，待細胞融合度為50%時，進行慢病毒轉染。1 ml內皮細胞完全培養基、足以轉染目的細胞體積的慢病毒（LV-191、LV-vector）和6 μg/ml聚凝胺助轉劑充分混合均勻，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞1次，將混合物添加至各孔細胞中。4 h后補足完全培養基，20 h后更換完全培養基，每天換液1次。轉染后24、48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。
1.3 流式細胞儀檢測細胞轉染率
慢病毒轉染48 h后，LV-vector組、LV-191組、對照組細胞胰酶消化液消化，離心棄上清，500 μl PBS重懸成單細胞懸液加入到流式管中進行檢測。LV-vector組、LV-191組均表達GFP，波長488 nm藍光激發下發出綠色熒光。采用FL-1通道檢測熒光信號，首先檢測對照組，調節電壓使細胞群處于陰性區；再檢測LV-vector組、LV-191組，調節補償使陽性區細胞處于合適位置。每組樣品獲取50 000個微粒信號。檢測結果通過Flowjo 7.6 軟件進行分析。
1.4 CCK-8細胞增生實驗檢測各組細胞增生能力
倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的增生情況并拍照。各組細胞接種于96孔板中，加入100 μl基礎培養基和10 μl CCK-8溶液，孵育2～4 h后，酶標儀讀取450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。每組各設3個復孔。
1.5 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移率
各組細胞以5×105個/孔的細胞密度接種于12孔板中，使用1 000 μl吸頭劃出垂直的兩條無細胞的細痕，倒置相差顯微鏡下隨機選取3個視野分別測量劃痕后0（初始時間）、9 h的無細胞部分面積，計算細胞遷移率。每組各設3個復孔。細胞遷移率計算公式：細胞遷移率=（最初劃痕面積－劃痕后各時間點無細胞區域面積）/最初劃痕面積。
1.6 侵襲小室（Transwell）細胞遷移實驗檢測各組細胞遷移能力
各組細胞消化后錐蟲藍染色計數，無血清培養基以1.5×105個細胞接種于Transwell小室上室內，下室加入100%胎牛血清，37 ℃細胞培養箱培養10 h后吸出小室和24孔板內液體，擦掉小室上表面細胞，4%多聚甲醛固定下表面細胞15 min，PBS洗滌細胞3次，常規結晶紫溶液避光染色20 min，清水沖洗3次。小室倒置晾干后，無菌尖刀片將其表面切下并封片，光學顯微鏡下觀察拍照。每組隨機選取6～8個視野以計數小室底膜上、下室側附著的細胞，即為發生遷移的細胞數。每組各設3個復孔，重復3次。
1.7 Matrigel實驗檢測各組細胞管腔形成情況
各組細胞消化并接種于預先包被Matrigel基質膠的12孔板內，接種后8 h觀察細胞管腔形成情況，ImageJ軟件計數成形管腔數量。每組各設3個復孔。
1.8 qPCR檢測LV-vector組、LV-191組、對照組細胞miR-191相對表達量以及各組細胞中p21、血管內皮生長因子（VEGF）、細胞分裂蛋白激酶6（CDK6）、細胞周期蛋白-D1（Cyclin D1）mRNA相對表達量
Trizol一步法提取各組細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉為cDNA。反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。利用美國國家生物技術信息中心數據庫提供的Blast引物設計工具設計特異性引物，得到約100～300堿基對的擴增產物，以150 ng的cDNA為模板，依次加入正反向引物和FastStart Universal SYBR Green Master mix試劑，55℃退火溫度擴增30個循環。擴增曲線用于確定DNA質量和基因表達水平。
1.9 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行統計學處理。所有數據以均數±標準差（
±s）表示。數據符合正態分布且方差齊性，組間比較采用單因素方差分析檢驗，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；數據不符合正態分布或方差不齊，組間比較采用Krustal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
倒置熒光顯微鏡觀察發現，慢病毒轉染24 h，LV-vector組、LV-191組部分細胞呈綠色熒光（圖1A，1B）；慢病毒轉染48 h，大量細胞呈綠色熒光（圖1C，1D）。流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、LV-191組細胞轉染率分別為0.615%、99.400%（圖2）。qPCR檢測結果顯示，與對照組、LV-vector組比較，LV-191組細胞中miR-191相對表達量明顯上調（圖3），差異有統計學意義（t=44.110、42.680，P<0.01）。
圖1
倒置熒光顯微鏡像。1A、1B分別示LV-vector組、LV-191組細胞慢病毒轉染24 h，部分細胞呈綠色熒光；1C、1D分別示LV-vector組、LV-191組細胞慢病毒轉染48 h，大量細胞呈綠色熒光 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖2
流式細胞儀細胞計數結果。LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖3
對照組、LV-vector組、LV-191組細胞中miR-191相對表達量比較（n=3）。 ***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
倒置相差顯微鏡觀察發現，LV-191組細胞增生數量明顯低于對照組、缺氧組、LV-vector組（圖4）。CCK-8細胞增生實驗結果發現，與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞A值明顯升高，LV-191組細胞A值明顯下降，差異有統計學意義（t=6.130、4.606、14.710，P≤0.01）（圖5）。
圖4
細胞增生實驗倒置相差顯微鏡像。4A～4D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。LV-191組細胞增生數量明顯低于對照組、缺氧組、LV-vector組 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖5
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞波長450 nm處A值比較（n=3）。**P<0.05，***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體；A值：舊稱光密度（OD）值
細胞劃痕實驗結果顯示，細胞培養9 h后，對照組、LV-191組僅有少量細胞遷移進入裸區，缺氧組、LV-vector組可見大量細胞遷移進入裸區（圖6）。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞遷移率明顯增高，LV-191組細胞遷移率明顯降低，差異有統計學意義（t=4.910、6.702、6.245，P<0.01） （圖7）。
圖6
細胞劃痕實驗倒置相差顯微鏡像。6A～6D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞培養9 h。對照組、LV-191組僅有少量細胞遷移進入裸區，缺氧組、LV-vector組可見大量細胞遷移進入裸區 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖7
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞遷移率比較（n=3）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
Transwell細胞遷移實驗結果顯示，與對照組比較，缺氧組、LV-vector組微孔膜上染色的細胞數量明顯增多，LV-191組微孔膜上染色的細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（t=7.244、6.724、5.333，P<0.01）（圖8，9）。
圖8
Transwell實驗hREC細胞光學顯微鏡像。8A～8D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組染色細胞數量明顯增多，LV-191組染色數量明顯減少 結晶紫 ×20。Transwell：侵襲小室；hREC：人視網膜血管內皮細胞；LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖9
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞遷移數量比較（n=4）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
Matrigel實驗結果顯示，細胞接種后8 h，對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞成形管腔數量分別為（10±1）、（20±2）、（19±1）、（5±1）個。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組可明顯促進細胞管腔形成能力，LV-191組可明顯抑制細胞管腔形成能力，差異有統計學意義（t=8.345、9.859、5.892，P<0.01）（圖10，11）。
圖10
細胞接種后8 h Matrigel實驗像。10A～10D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞成形管腔數量增加，LV-191組細胞成形管腔數量減少 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖11
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞接種后8 h成形管腔數量比較（n=4）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
qPCR檢測結果顯示，與對照組、缺氧組、LV-vector組比較，LV-191組細胞p21 mRNA相對表達量增高，但差異無統計學意義（t=2.013、2.543、2.755，P>0.05）；Cyclin D1（t=29.940、16.410、14.010）、CDK6（t=15.200、5.863、7.645）mRNA相對表達量明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。4組細胞中VEGF mRNA比較，差異無統計學意義（F=0.966，P>0.01）（圖12）。
圖12
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組（n=3）細胞中p21、Cyclin D1、CDK6、VEGF mRNA相對表達量比較。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體；Cyclin D1：細胞周期蛋白-D1；CDK：細胞周期蛋白依賴性激酶；VEGF：血管內皮生長因子
3 討論
hREC是研究RNV性疾病的經典細胞系。慢病毒載體介導的基因轉移具有高轉染率、穩定表達及良好的靶向性等特性，已成為基因治療的有效方法[6]。本研究選用hREC細胞系作為實驗對象，通過慢病毒載體介導miR-191轉染該細胞，觀察miR-191對細胞增生、遷移和管腔形成的影響。其中管腔形成實驗采用操作簡單、重復性好的Matrigel實驗[7]完成。
細胞周期即細胞增生，是一種精密調控的細胞分裂過程，也是任何細胞生命活動的基本特征。細胞周期分為4個時相，即Gl期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂前期）、M期（有絲分裂期）。各時相間存在調控點，包括G1/S期調控點、G2/M期調控點，其通過Cyclin、CDK和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）組成的細胞周期調控系統進行調控[8]。CDK6是細胞周期的核心調控者，能調控細胞周期各階段的轉變，也是多數惡性腫瘤發生發展的關鍵蛋白激酶，因此成為抗腫瘤藥物的重要作用靶點之一。在正常細胞中，CDK能與Cyclin D結合形成復合物，進而啟動細胞周期轉變信號，正反饋調控細胞周期從G1期向S期轉變來促進細胞增生[9]。p21是一種重要的CKI，主要參與調控細胞在G1/S期的轉變，可以通過抑制CDK的活性，使細胞阻滯于G1期，抑制細胞增生[10]。因此，異常表達的細胞周期相關因子通過影響細胞周期信號通路促使RNV的發生發展。
研究發現多種miRNA可影響細胞增生、遷移，甚至可以通過抑制內皮細胞的有絲分裂影響血管生成。miR-188-3p可促進結直腸癌細胞的增生和遷移[11]；在甲狀腺癌中，上調miR-150-5p可促進細胞增生，抑制細胞凋亡[12]；miRNA-370可通過上調p21抑制血管內皮細胞的生長，防止新生血管生成[13]；miR-129-5p可通過轉化生長因子-β-誘導2途徑抑制膠質瘤細胞的增生和遷移，并使細胞有絲分裂停留在G0/G1期[14]，還可調控Hedgehog信號通路相關因子VEGF、促血管生成素2、p21的表達，抑制腫瘤血管的生成[15]。
miR-191作為miRNA的一種，通過調控細胞增生、分化、凋亡以及遷移，參與多種疾病的發生和發展[5]。Tian等[16]研究發現，miR-191在肝癌組織中表達異常，參與調控肝癌細胞的細胞周期。miR-191在調控血管生成，尤其是病理性血管生成中作用的研究較少。Gu等[17]研究發現，miR-191模擬物（miR-191 mimic）轉染人真皮微血管內皮細胞（hDMEC）可以抑制其增生、遷移和成管；同時還發現，轉染miR-191 mimic的小鼠其主動脈環的血管發芽明顯減少，而轉染miR-191抑制劑可誘導血管生成。此外，miR-191可下調CDK6來抑制角質形成細胞的增生[18]和甲狀腺癌細胞的增生[19]，可下調Cyclin D2來抑制乳腺癌細胞的增生[20]，還能上調hDMEC中的p21，使其周期停滯，抑制血管生成。Kim等[21]研究發現，hDMEC經迷迭香酸處理后p21表達增高，細胞的管腔形成能力明顯減弱，RNV的生成受到抑制。Han和Li[22]研究發現，上調p21可以降低CDK2的表達，從而抑制hREC的增生。本研究結果顯示，LV-191組miR-191相對表達量明顯高于其他組，說明慢病毒可成功轉染miR-191至靶細胞并穩定表達。LV-191組hREC增生明顯減低，成形管腔數量較對照組和LV-vector組明顯減少，表明miR-191可以抑制hREC增生。同時，本研究進一步證實缺氧狀態下hREC轉染miR-191后，CDK6、Cyclin D1 mRNA表達明顯下調，p21的mRNA表達上調。這說明miR-191可能通過p21、CDK6、Cyclin D1影響細胞周期，進而抑制hREC增生、遷移，達到抑制RNV的目的。各組間細胞中VEGF表達無明顯差異，說明miR-191并不是通過抑制VEGF減少新生血管生成。這提示，miR-191應用于RNV防治還具有避免VEGF過度降低而導致心腦血管和視網膜的缺血、新生血管纖維化等優勢，為今后防治RNV開辟了新的途徑。
miR-191通過多種途徑參與調控細胞的增生和遷移，包括核因子-κB信號途徑、細胞周期調控通路等。本研究結果提示慢病毒介導miR-191可以通過細胞周期調控通路抑制hREC增生和遷移。但病毒介導基因轉染的安全性以及miR-191抑制細胞增生的具體機制仍需進一步探索。
視網膜新生血管（RNV）多因視網膜缺血缺氧造成新生血管生成因子與抑制因子表達失衡[1-2]，并進一步促進血管內皮細胞的分裂與增生而引起，因此抑制血管內皮細胞的增生與遷移有助于抑制新生血管的生成。miRNA是一類小分子非編碼 RNA。作為一種新型的基因表達調控因子，miRNA與腫瘤、糖尿病和心血管病變等多種疾病密切相關，參與細胞增生、遷移、凋亡及新生血管生成等一系列生物學過程[3-4]。研究發現，miR-191可通過靶向重要轉錄因子、染色質重塑和細胞周期相關基因調控細胞的生物學過程[5]。前期miRNA芯片分析發現氧誘導視網膜病變小鼠視網膜組織中miR-191表達明顯下調，推測miR-191降低可能參與了RNV的發生。本研究通過慢病毒載體將miR-191轉染至人視網膜血管內皮細胞（hREC），觀察其對細胞增生及遷移的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、分組及建模
攜帶miR-191的慢病毒載體（LV-191）、空白慢病毒載體（LV-vector）（上海漢恒生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（AE301，北京全式金生生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）；hREC（美國Sciencell公司）；缺氧誘導裝置（美國Billups-Rothenberg公司）；7900HT實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）儀（美國ABI公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。
取6~8代對數生長期hREC，將其分為對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。對照組細胞正常條件培養；缺氧組細胞置于2%O2、98%N2的密閉缺氧誘導裝置中，37 ℃培養3 h后再放回正常氧濃度繼續培養24 h；LV-vector組、LV-191組細胞在相應慢病毒載體轉染48 h后置于2%O2、98%N2的密閉缺氧誘導裝置中，37 ℃培養3 h后再放回正常氧濃度繼續培養24 h。
1.2 慢病毒轉染hREC
將hREC以5×105個/孔的細胞密度接種于細胞培養板中，待細胞融合度為50%時，進行慢病毒轉染。1 ml內皮細胞完全培養基、足以轉染目的細胞體積的慢病毒（LV-191、LV-vector）和6 μg/ml聚凝胺助轉劑充分混合均勻，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞1次，將混合物添加至各孔細胞中。4 h后補足完全培養基，20 h后更換完全培養基，每天換液1次。轉染后24、48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。
1.3 流式細胞儀檢測細胞轉染率
慢病毒轉染48 h后，LV-vector組、LV-191組、對照組細胞胰酶消化液消化，離心棄上清，500 μl PBS重懸成單細胞懸液加入到流式管中進行檢測。LV-vector組、LV-191組均表達GFP，波長488 nm藍光激發下發出綠色熒光。采用FL-1通道檢測熒光信號，首先檢測對照組，調節電壓使細胞群處于陰性區；再檢測LV-vector組、LV-191組，調節補償使陽性區細胞處于合適位置。每組樣品獲取50 000個微粒信號。檢測結果通過Flowjo 7.6 軟件進行分析。
1.4 CCK-8細胞增生實驗檢測各組細胞增生能力
倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的增生情況并拍照。各組細胞接種于96孔板中，加入100 μl基礎培養基和10 μl CCK-8溶液，孵育2～4 h后，酶標儀讀取450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。每組各設3個復孔。
1.5 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移率
各組細胞以5×105個/孔的細胞密度接種于12孔板中，使用1 000 μl吸頭劃出垂直的兩條無細胞的細痕，倒置相差顯微鏡下隨機選取3個視野分別測量劃痕后0（初始時間）、9 h的無細胞部分面積，計算細胞遷移率。每組各設3個復孔。細胞遷移率計算公式：細胞遷移率=（最初劃痕面積－劃痕后各時間點無細胞區域面積）/最初劃痕面積。
1.6 侵襲小室（Transwell）細胞遷移實驗檢測各組細胞遷移能力
各組細胞消化后錐蟲藍染色計數，無血清培養基以1.5×105個細胞接種于Transwell小室上室內，下室加入100%胎牛血清，37 ℃細胞培養箱培養10 h后吸出小室和24孔板內液體，擦掉小室上表面細胞，4%多聚甲醛固定下表面細胞15 min，PBS洗滌細胞3次，常規結晶紫溶液避光染色20 min，清水沖洗3次。小室倒置晾干后，無菌尖刀片將其表面切下并封片，光學顯微鏡下觀察拍照。每組隨機選取6～8個視野以計數小室底膜上、下室側附著的細胞，即為發生遷移的細胞數。每組各設3個復孔，重復3次。
1.7 Matrigel實驗檢測各組細胞管腔形成情況
各組細胞消化并接種于預先包被Matrigel基質膠的12孔板內，接種后8 h觀察細胞管腔形成情況，ImageJ軟件計數成形管腔數量。每組各設3個復孔。
1.8 qPCR檢測LV-vector組、LV-191組、對照組細胞miR-191相對表達量以及各組細胞中p21、血管內皮生長因子（VEGF）、細胞分裂蛋白激酶6（CDK6）、細胞周期蛋白-D1（Cyclin D1）mRNA相對表達量
Trizol一步法提取各組細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉為cDNA。反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。利用美國國家生物技術信息中心數據庫提供的Blast引物設計工具設計特異性引物，得到約100～300堿基對的擴增產物，以150 ng的cDNA為模板，依次加入正反向引物和FastStart Universal SYBR Green Master mix試劑，55℃退火溫度擴增30個循環。擴增曲線用于確定DNA質量和基因表達水平。
1.9 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行統計學處理。所有數據以均數±標準差（±s）表示。數據符合正態分布且方差齊性，組間比較采用單因素方差分析檢驗，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；數據不符合正態分布或方差不齊，組間比較采用Krustal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
倒置熒光顯微鏡觀察發現，慢病毒轉染24 h，LV-vector組、LV-191組部分細胞呈綠色熒光（圖1A，1B）；慢病毒轉染48 h，大量細胞呈綠色熒光（圖1C，1D）。流式細胞儀檢測結果顯示，對照組、LV-191組細胞轉染率分別為0.615%、99.400%（圖2）。qPCR檢測結果顯示，與對照組、LV-vector組比較，LV-191組細胞中miR-191相對表達量明顯上調（圖3），差異有統計學意義（t=44.110、42.680，P<0.01）。
圖1
倒置熒光顯微鏡像。1A、1B分別示LV-vector組、LV-191組細胞慢病毒轉染24 h，部分細胞呈綠色熒光；1C、1D分別示LV-vector組、LV-191組細胞慢病毒轉染48 h，大量細胞呈綠色熒光 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖2
流式細胞儀細胞計數結果。LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖3
對照組、LV-vector組、LV-191組細胞中miR-191相對表達量比較（n=3）。 ***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
倒置相差顯微鏡觀察發現，LV-191組細胞增生數量明顯低于對照組、缺氧組、LV-vector組（圖4）。CCK-8細胞增生實驗結果發現，與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞A值明顯升高，LV-191組細胞A值明顯下降，差異有統計學意義（t=6.130、4.606、14.710，P≤0.01）（圖5）。
圖4
細胞增生實驗倒置相差顯微鏡像。4A～4D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。LV-191組細胞增生數量明顯低于對照組、缺氧組、LV-vector組 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖5
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞波長450 nm處A值比較（n=3）。**P<0.05，***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體；A值：舊稱光密度（OD）值
細胞劃痕實驗結果顯示，細胞培養9 h后，對照組、LV-191組僅有少量細胞遷移進入裸區，缺氧組、LV-vector組可見大量細胞遷移進入裸區（圖6）。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞遷移率明顯增高，LV-191組細胞遷移率明顯降低，差異有統計學意義（t=4.910、6.702、6.245，P<0.01） （圖7）。
圖6
細胞劃痕實驗倒置相差顯微鏡像。6A～6D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞培養9 h。對照組、LV-191組僅有少量細胞遷移進入裸區，缺氧組、LV-vector組可見大量細胞遷移進入裸區 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖7
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞遷移率比較（n=3）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
Transwell細胞遷移實驗結果顯示，與對照組比較，缺氧組、LV-vector組微孔膜上染色的細胞數量明顯增多，LV-191組微孔膜上染色的細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（t=7.244、6.724、5.333，P<0.01）（圖8，9）。
圖8
Transwell實驗hREC細胞光學顯微鏡像。8A～8D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組染色細胞數量明顯增多，LV-191組染色數量明顯減少 結晶紫 ×20。Transwell：侵襲小室；hREC：人視網膜血管內皮細胞；LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖9
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞遷移數量比較（n=4）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
Matrigel實驗結果顯示，細胞接種后8 h，對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞成形管腔數量分別為（10±1）、（20±2）、（19±1）、（5±1）個。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組可明顯促進細胞管腔形成能力，LV-191組可明顯抑制細胞管腔形成能力，差異有統計學意義（t=8.345、9.859、5.892，P<0.01）（圖10，11）。
圖10
細胞接種后8 h Matrigel實驗像。10A～10D分別示對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組。與對照組比較，缺氧組、LV-vector組細胞成形管腔數量增加，LV-191組細胞成形管腔數量減少 ×10。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
圖11
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組細胞接種后8 h成形管腔數量比較（n=4）。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體
qPCR檢測結果顯示，與對照組、缺氧組、LV-vector組比較，LV-191組細胞p21 mRNA相對表達量增高，但差異無統計學意義（t=2.013、2.543、2.755，P>0.05）；Cyclin D1（t=29.940、16.410、14.010）、CDK6（t=15.200、5.863、7.645）mRNA相對表達量明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。4組細胞中VEGF mRNA比較，差異無統計學意義（F=0.966，P>0.01）（圖12）。
圖12
對照組、缺氧組、LV-vector組、LV-191組（n=3）細胞中p21、Cyclin D1、CDK6、VEGF mRNA相對表達量比較。***P<0.01。LV-vector：空白慢病毒載體；LV-191：攜帶miR-191的慢病毒載體；Cyclin D1：細胞周期蛋白-D1；CDK：細胞周期蛋白依賴性激酶；VEGF：血管內皮生長因子
3 討論
hREC是研究RNV性疾病的經典細胞系。慢病毒載體介導的基因轉移具有高轉染率、穩定表達及良好的靶向性等特性，已成為基因治療的有效方法[6]。本研究選用hREC細胞系作為實驗對象，通過慢病毒載體介導miR-191轉染該細胞，觀察miR-191對細胞增生、遷移和管腔形成的影響。其中管腔形成實驗采用操作簡單、重復性好的Matrigel實驗[7]完成。
細胞周期即細胞增生，是一種精密調控的細胞分裂過程，也是任何細胞生命活動的基本特征。細胞周期分為4個時相，即Gl期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂前期）、M期（有絲分裂期）。各時相間存在調控點，包括G1/S期調控點、G2/M期調控點，其通過Cyclin、CDK和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）組成的細胞周期調控系統進行調控[8]。CDK6是細胞周期的核心調控者，能調控細胞周期各階段的轉變，也是多數惡性腫瘤發生發展的關鍵蛋白激酶，因此成為抗腫瘤藥物的重要作用靶點之一。在正常細胞中，CDK能與Cyclin D結合形成復合物，進而啟動細胞周期轉變信號，正反饋調控細胞周期從G1期向S期轉變來促進細胞增生[9]。p21是一種重要的CKI，主要參與調控細胞在G1/S期的轉變，可以通過抑制CDK的活性，使細胞阻滯于G1期，抑制細胞增生[10]。因此，異常表達的細胞周期相關因子通過影響細胞周期信號通路促使RNV的發生發展。
研究發現多種miRNA可影響細胞增生、遷移，甚至可以通過抑制內皮細胞的有絲分裂影響血管生成。miR-188-3p可促進結直腸癌細胞的增生和遷移[11]；在甲狀腺癌中，上調miR-150-5p可促進細胞增生，抑制細胞凋亡[12]；miRNA-370可通過上調p21抑制血管內皮細胞的生長，防止新生血管生成[13]；miR-129-5p可通過轉化生長因子-β-誘導2途徑抑制膠質瘤細胞的增生和遷移，并使細胞有絲分裂停留在G0/G1期[14]，還可調控Hedgehog信號通路相關因子VEGF、促血管生成素2、p21的表達，抑制腫瘤血管的生成[15]。
miR-191作為miRNA的一種，通過調控細胞增生、分化、凋亡以及遷移，參與多種疾病的發生和發展[5]。Tian等[16]研究發現，miR-191在肝癌組織中表達異常，參與調控肝癌細胞的細胞周期。miR-191在調控血管生成，尤其是病理性血管生成中作用的研究較少。Gu等[17]研究發現，miR-191模擬物（miR-191 mimic）轉染人真皮微血管內皮細胞（hDMEC）可以抑制其增生、遷移和成管；同時還發現，轉染miR-191 mimic的小鼠其主動脈環的血管發芽明顯減少，而轉染miR-191抑制劑可誘導血管生成。此外，miR-191可下調CDK6來抑制角質形成細胞的增生[18]和甲狀腺癌細胞的增生[19]，可下調Cyclin D2來抑制乳腺癌細胞的增生[20]，還能上調hDMEC中的p21，使其周期停滯，抑制血管生成。Kim等[21]研究發現，hDMEC經迷迭香酸處理后p21表達增高，細胞的管腔形成能力明顯減弱，RNV的生成受到抑制。Han和Li[22]研究發現，上調p21可以降低CDK2的表達，從而抑制hREC的增生。本研究結果顯示，LV-191組miR-191相對表達量明顯高于其他組，說明慢病毒可成功轉染miR-191至靶細胞并穩定表達。LV-191組hREC增生明顯減低，成形管腔數量較對照組和LV-vector組明顯減少，表明miR-191可以抑制hREC增生。同時，本研究進一步證實缺氧狀態下hREC轉染miR-191后，CDK6、Cyclin D1 mRNA表達明顯下調，p21的mRNA表達上調。這說明miR-191可能通過p21、CDK6、Cyclin D1影響細胞周期，進而抑制hREC增生、遷移，達到抑制RNV的目的。各組間細胞中VEGF表達無明顯差異，說明miR-191并不是通過抑制VEGF減少新生血管生成。這提示，miR-191應用于RNV防治還具有避免VEGF過度降低而導致心腦血管和視網膜的缺血、新生血管纖維化等優勢，為今后防治RNV開辟了新的途徑。
miR-191通過多種途徑參與調控細胞的增生和遷移，包括核因子-κB信號途徑、細胞周期調控通路等。本研究結果提示慢病毒介導miR-191可以通過細胞周期調控通路抑制hREC增生和遷移。但病毒介導基因轉染的安全性以及miR-191抑制細胞增生的具體機制仍需進一步探索。
