引用本文： 王珊珊, 徐仙珍, 廖星, 賴美辰, 付書華. 黃連素抑制高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞凋亡. 中華眼底病雜志, 2021, 37(10): 790-794. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210225-00100 復制
視網膜血管內皮損傷是糖尿病視網膜病變（DR）的主要發病機制[1]。因此，研究如何保護糖尿病引起的視網膜血管內皮損傷是預防和治療DR的重要方法。血管內皮功能障礙與肥胖、糖尿病、心血管疾病和高血壓等疾病發病機制密切相關[2]。黃連素即小劈堿（BBR）是一種異喹啉生物堿提取物，機制研究表明其對糖尿病相關并發癥具有有益作用，在調節和改善糖脂代謝中的作用已得到證實[3]。然而關于BBR在DR中的作用卻鮮見報道。目前已有研究發現，BBR能夠抑制PM2.5誘導的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡，能減少糖尿病小鼠主動脈血管內皮細胞的損傷[4-5]。視網膜血管內皮細胞（REC）凋亡在DR進展中發揮重要作用[6]。為研究BBR是否對高糖誘導的REC凋亡具有保護作用，本研究利用人REC（hREC）高糖條件培養模擬高糖環境，觀察高糖及BBR對hREC凋亡的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
hREC（美國ATCC公司）；BBR（北京索萊寶科技有限公司）；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、細胞色素C（Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（英國Abcam公司）；β-肌動蛋白（actin）抗體（武漢博士德公司）；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（BCA）試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM培養基，北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibico公司）；膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）（北京索萊寶科技有限公司）；電泳儀、流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；超凈工作臺（上海智能分析儀器設備有限公司）。
將hREC分為空白對照組（NC組）、高糖組（HG組）、BBR處理組（BN組）、BBR+高糖處理組（BH組）。各組細胞均置于含10%胎牛血清和2%青霉素、鏈霉素溶液雙抗的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。選取生長狀態良好、處于對數生長期4～6代hREC進行后續實驗。NC組培養基中加入5.5 mmol/L葡萄糖；高糖組培養基中加入30.0 mmol/L葡萄糖；BN組培養基中加入5.0 mmol/L葡萄糖和5.0 mmol/LBBR；BH組培養基中加入30.0 mmol/L葡萄糖和5.0 mmol/L BBR。參照文獻[7]，本研究選擇高糖及BBR處理24 h后行細胞凋亡及蛋白表達量檢測。
采用流式細胞儀檢測各組hREC凋亡情況。細胞培養24 h后，小心收集細胞培養液到1.5 ml離心管內備用。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，至細胞可以被移液管或槍頭輕輕吹打下來時，加入收集的細胞培養液，吹打下所有貼壁細胞并輕輕吹散。再次收集到離心管內離心3～5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液，加入約1 ml 4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液，重懸細胞，離心沉淀細胞；重復該操作1次。用100 μl凋亡檢測試劑盒中結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應管中加400 μl 結合緩沖液，流式細胞儀分析并計算各組細胞凋亡率，重復3次，取平均值。
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組hREC中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt-C蛋白相對表達量。細胞培養24 h后，裂解液充分裂解細胞，收集裂解液離心后測上清液中總蛋白濃度，每一樣品用裂解液補齊至同質同體積，BCA定量加入蛋白緩沖液煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt-C、β-actin一抗孵育過夜，1倍洗滌緩沖液沖洗膜4次，10 min/次；二抗室溫孵育1 h。1倍洗膜緩沖液洗膜4次，10 min/次。增強化學發光試劑盒顯色溫育后暗室顯影。顯影后用Image J圖像分析系統對Bcl-2、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白灰度值進行分析。以目標蛋白灰度值/β-actin灰度值為目標蛋白的相對表達量。重復3次，取平均值。
采用SPSS19.0、GraphPad Prism軟件進行統計學分析。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 高糖誘導hREC凋亡
NC組、HG組細胞凋亡率分別為4.77%、11.81%；與NC組比較，HG組細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。與NC組比較，HG組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。
圖1
HG組、NC組流式細胞儀像。1A示NC組；1B組示HG組。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；PI：碘化丙啶；Annexin Ⅴ：膜聯蛋白Ⅴ
圖2
NC組、HG組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=3）。與NC組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2基因；Bax：Bcl-2相關X蛋白
2.2 BBR抑制高糖誘導的hREC凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，NC組、HG組、BN組、BH組細胞凋亡率分別為6.23%、19.80%、7.56%、10.52%。HG組細胞凋亡率高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.001）；BH組細胞凋亡率較HG組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；BN組凋亡率與NC組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）。
圖3
HG組、NC組、BN組、BH組細胞凋亡率情況（n=3）。3A～3D示分別示NC組、HG組、BN組、BH組流式細胞儀像；3E示各組細胞凋亡率比較。*P＜0.05，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；PI：碘化丙啶；Annexin Ⅴ：膜聯蛋白Ⅴ
Western blot檢測結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與HG組比較，BH組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量降低，Bcl-2蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。
圖4
NC組、HG組、BN組、BH組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=3）。**P＜0.01，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白
2.3 BBR抑制高糖誘導的hREC中Cyt-C釋放
Western blot檢測結果顯示，與NC組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較，HG組升高，BH組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。BN組與NC組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5）。
圖5
NC組、HG組、BN組、BH組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較（n=3）。*P＜0.05。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；Cyt-C：細胞色素C
3 討論
DR是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，藥物及手術治療均不能很好改善患者生活質量。因此，尋求新的分子靶點，為DR靶向干預及治療提供更多依據。本研究采用的藥物BBR是一種異喹啉生物堿提取物，作為黃連的主要成分，其毒性低、成本低。機制研究表明，BBR在調節和改善糖脂代謝中的作用明確[3]。既往研究證實，小鼠主動脈環中BBR可引起內皮依賴性血管舒張并減輕高糖介導的內皮功能障礙[7-8]，但其在糖尿病微血管中保護作用機制尚未明確。
糖尿病條件下視網膜內屏障即血管內皮細胞損傷是領域內研究的熱點和難點[9-10]。其早期階段的特征是在凋亡性視網膜血管細胞死亡之后，存在無細胞毛細血管和周細胞丟失[11]。有研究表明，高糖可誘導氧化應激，導致線粒體產生過量活性氧而導致血管損傷[12]。本研究結果顯示，HG組細胞凋亡率明顯升高，證實高糖環境增加hREC凋亡，是導致血管損傷的標志。這提示糖尿病導致視網膜病變特征性改變的機制可能是引起hREC死亡。
既往研究表明，細胞凋亡與原癌基因和抑癌基因異常表達密切相關[13-14]。Bcl-2最初于血液淋巴細胞中發現其能抑制細胞死亡[15]。本研究結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，證實高糖環境可影響凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而促進hREC凋亡。我們推測高糖是影響視網膜血管發生病變的重要因素，同時高糖能使促凋亡蛋白Bax的表達升高。Caspase-3作為Caspase家族中的重要成員，在加速細胞程序性死亡的內在和外在途徑中起著至關重要的作用[16]。本研究結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高，證實高糖能夠促進hREC凋亡蛋白的表達。Cyt-C是第一個被發現的線粒體釋放至胞質的促凋亡因子，是細胞凋亡信號傳導過程的關鍵因素。正常情況下，Cyt-C定位于線粒體膜間隙，呈電穩定性地結合于線粒體內膜，不能通過外膜。當細胞受到凋亡刺激時，線粒體膜通透性發生改變，Cyt-C從線粒體膜間隙進入胞質，釋放入胞質的Cyt-C最終引發凋亡蛋白酶Caspase的級聯反應，導致細胞凋亡[17-18]。本研究結果顯示，HG組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量顯著升高，進一步證實高糖可影響相關凋亡蛋白的表達，從而促進hREC凋亡。
本研究結果表明，BH組細胞凋亡率較HG組明顯降低，促凋亡蛋白Caspase-3、Cyt-C、Bax相對表達量顯著降低，而抑制凋亡蛋白Bcl-2相對表達量升高。據此我們推測，BBR可能通過影響高糖誘導的hREC凋亡蛋白表達，抑制高糖誘導hREC凋亡。這提示糖尿病進程中使用BBR對DR的保護作用可能是通過抑制高糖誘導hREC凋亡，對糖尿病相關并發癥具有有益作用，可為DR的預防及治療提供靶點。然而，有關BBR對DR中hREC凋亡的具體作用機制仍有待深入研究和挖掘。
視網膜血管內皮損傷是糖尿病視網膜病變（DR）的主要發病機制[1]。因此，研究如何保護糖尿病引起的視網膜血管內皮損傷是預防和治療DR的重要方法。血管內皮功能障礙與肥胖、糖尿病、心血管疾病和高血壓等疾病發病機制密切相關[2]。黃連素即小劈堿（BBR）是一種異喹啉生物堿提取物，機制研究表明其對糖尿病相關并發癥具有有益作用，在調節和改善糖脂代謝中的作用已得到證實[3]。然而關于BBR在DR中的作用卻鮮見報道。目前已有研究發現，BBR能夠抑制PM2.5誘導的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡，能減少糖尿病小鼠主動脈血管內皮細胞的損傷[4-5]。視網膜血管內皮細胞（REC）凋亡在DR進展中發揮重要作用[6]。為研究BBR是否對高糖誘導的REC凋亡具有保護作用，本研究利用人REC（hREC）高糖條件培養模擬高糖環境，觀察高糖及BBR對hREC凋亡的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
hREC（美國ATCC公司）；BBR（北京索萊寶科技有限公司）；B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、細胞色素C（Cyt-C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（英國Abcam公司）；β-肌動蛋白（actin）抗體（武漢博士德公司）；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸（BCA）試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM培養基，北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibico公司）；膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）（北京索萊寶科技有限公司）；電泳儀、流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；超凈工作臺（上海智能分析儀器設備有限公司）。
將hREC分為空白對照組（NC組）、高糖組（HG組）、BBR處理組（BN組）、BBR+高糖處理組（BH組）。各組細胞均置于含10%胎牛血清和2%青霉素、鏈霉素溶液雙抗的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。選取生長狀態良好、處于對數生長期4～6代hREC進行后續實驗。NC組培養基中加入5.5 mmol/L葡萄糖；高糖組培養基中加入30.0 mmol/L葡萄糖；BN組培養基中加入5.0 mmol/L葡萄糖和5.0 mmol/LBBR；BH組培養基中加入30.0 mmol/L葡萄糖和5.0 mmol/L BBR。參照文獻[7]，本研究選擇高糖及BBR處理24 h后行細胞凋亡及蛋白表達量檢測。
采用流式細胞儀檢測各組hREC凋亡情況。細胞培養24 h后，小心收集細胞培養液到1.5 ml離心管內備用。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，至細胞可以被移液管或槍頭輕輕吹打下來時，加入收集的細胞培養液，吹打下所有貼壁細胞并輕輕吹散。再次收集到離心管內離心3～5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液，加入約1 ml 4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液，重懸細胞，離心沉淀細胞；重復該操作1次。用100 μl凋亡檢測試劑盒中結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應管中加400 μl 結合緩沖液，流式細胞儀分析并計算各組細胞凋亡率，重復3次，取平均值。
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組hREC中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt-C蛋白相對表達量。細胞培養24 h后，裂解液充分裂解細胞，收集裂解液離心后測上清液中總蛋白濃度，每一樣品用裂解液補齊至同質同體積，BCA定量加入蛋白緩沖液煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyt-C、β-actin一抗孵育過夜，1倍洗滌緩沖液沖洗膜4次，10 min/次；二抗室溫孵育1 h。1倍洗膜緩沖液洗膜4次，10 min/次。增強化學發光試劑盒顯色溫育后暗室顯影。顯影后用Image J圖像分析系統對Bcl-2、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白灰度值進行分析。以目標蛋白灰度值/β-actin灰度值為目標蛋白的相對表達量。重復3次，取平均值。
采用SPSS19.0、GraphPad Prism軟件進行統計學分析。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 高糖誘導hREC凋亡
NC組、HG組細胞凋亡率分別為4.77%、11.81%；與NC組比較，HG組細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。與NC組比較，HG組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）（圖2）。
圖1
HG組、NC組流式細胞儀像。1A示NC組；1B組示HG組。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；PI：碘化丙啶；Annexin Ⅴ：膜聯蛋白Ⅴ
圖2
NC組、HG組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=3）。與NC組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2基因；Bax：Bcl-2相關X蛋白
2.2 BBR抑制高糖誘導的hREC凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，NC組、HG組、BN組、BH組細胞凋亡率分別為6.23%、19.80%、7.56%、10.52%。HG組細胞凋亡率高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.001）；BH組細胞凋亡率較HG組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；BN組凋亡率與NC組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）。
圖3
HG組、NC組、BN組、BH組細胞凋亡率情況（n=3）。3A～3D示分別示NC組、HG組、BN組、BH組流式細胞儀像；3E示各組細胞凋亡率比較。*P＜0.05，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；PI：碘化丙啶；Annexin Ⅴ：膜聯蛋白Ⅴ
Western blot檢測結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與HG組比較，BH組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量降低，Bcl-2蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）（圖4）。
圖4
NC組、HG組、BN組、BH組細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=3）。**P＜0.01，***P＜0.001。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；Bax：Bcl-2相關X蛋白
2.3 BBR抑制高糖誘導的hREC中Cyt-C釋放
Western blot檢測結果顯示，與NC組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較，HG組升高，BH組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。BN組與NC組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5）。
圖5
NC組、HG組、BN組、BH組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量比較（n=3）。*P＜0.05。NC組：空白對照組；HG組：高糖培養組；BN組：黃連素（BBR）處理組；BH組；BBR+高糖處理組；Cyt-C：細胞色素C
3 討論
DR是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，藥物及手術治療均不能很好改善患者生活質量。因此，尋求新的分子靶點，為DR靶向干預及治療提供更多依據。本研究采用的藥物BBR是一種異喹啉生物堿提取物，作為黃連的主要成分，其毒性低、成本低。機制研究表明，BBR在調節和改善糖脂代謝中的作用明確[3]。既往研究證實，小鼠主動脈環中BBR可引起內皮依賴性血管舒張并減輕高糖介導的內皮功能障礙[7-8]，但其在糖尿病微血管中保護作用機制尚未明確。
糖尿病條件下視網膜內屏障即血管內皮細胞損傷是領域內研究的熱點和難點[9-10]。其早期階段的特征是在凋亡性視網膜血管細胞死亡之后，存在無細胞毛細血管和周細胞丟失[11]。有研究表明，高糖可誘導氧化應激，導致線粒體產生過量活性氧而導致血管損傷[12]。本研究結果顯示，HG組細胞凋亡率明顯升高，證實高糖環境增加hREC凋亡，是導致血管損傷的標志。這提示糖尿病導致視網膜病變特征性改變的機制可能是引起hREC死亡。
既往研究表明，細胞凋亡與原癌基因和抑癌基因異常表達密切相關[13-14]。Bcl-2最初于血液淋巴細胞中發現其能抑制細胞死亡[15]。本研究結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，證實高糖環境可影響凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而促進hREC凋亡。我們推測高糖是影響視網膜血管發生病變的重要因素，同時高糖能使促凋亡蛋白Bax的表達升高。Caspase-3作為Caspase家族中的重要成員，在加速細胞程序性死亡的內在和外在途徑中起著至關重要的作用[16]。本研究結果顯示，與NC組比較，HG組細胞中Caspase-3蛋白相對表達量明顯升高，證實高糖能夠促進hREC凋亡蛋白的表達。Cyt-C是第一個被發現的線粒體釋放至胞質的促凋亡因子，是細胞凋亡信號傳導過程的關鍵因素。正常情況下，Cyt-C定位于線粒體膜間隙，呈電穩定性地結合于線粒體內膜，不能通過外膜。當細胞受到凋亡刺激時，線粒體膜通透性發生改變，Cyt-C從線粒體膜間隙進入胞質，釋放入胞質的Cyt-C最終引發凋亡蛋白酶Caspase的級聯反應，導致細胞凋亡[17-18]。本研究結果顯示，HG組細胞中Cyt-C蛋白相對表達量顯著升高，進一步證實高糖可影響相關凋亡蛋白的表達，從而促進hREC凋亡。
本研究結果表明，BH組細胞凋亡率較HG組明顯降低，促凋亡蛋白Caspase-3、Cyt-C、Bax相對表達量顯著降低，而抑制凋亡蛋白Bcl-2相對表達量升高。據此我們推測，BBR可能通過影響高糖誘導的hREC凋亡蛋白表達，抑制高糖誘導hREC凋亡。這提示糖尿病進程中使用BBR對DR的保護作用可能是通過抑制高糖誘導hREC凋亡，對糖尿病相關并發癥具有有益作用，可為DR的預防及治療提供靶點。然而，有關BBR對DR中hREC凋亡的具體作用機制仍有待深入研究和挖掘。
