引用本文： 洪亞茹, 姚旭陽, 李輝, 曹靖靖, 白小妹, 安偉婷, 徐釗, 東莉潔, 李筱榮, 劉巨平. 增生型糖尿病視網膜病變患者外周血差異基因轉錄組學與基因表達總庫的聯合分析與驗證研究. 中華眼底病雜志, 2022, 38(3): 225-234. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210119-00031 復制
增生型糖尿病視網膜病變（DR）臨床特征為視網膜和視盤新生血管形成，易導致視網膜前纖維化和牽拉性視網膜脫離（TRD）[1]。手術是治療增生型DR（PDR）患者TRD的有效手段[2]。但因手術難度大、恢復時間長、預后效果差等問題[3]，尋找新的靶點有效抑制PDR進展十分必要。轉錄組學是一種生物信息分析手段，可從整體上研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律[4]。基因表達總庫（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由研究界提交的高通量微陣列和下一代序列功能基因組數據集的國際公共信息庫，通過此數據庫對高通量數據進行檢索分析，可以幫助用戶查詢、分析和可視化數據，是檢索分析數據過程中一種必不可少的信息庫[5]。高通量微陣列平臺成為檢測致癌過程中的基因改變和發現多種疾病的生物標記物的一種有用工具，可應用于差異表達基因（DEG）與癌癥相關性的研究[6-7]。然而，單獨微陣列調查往往顯示出由于樣本數量不足而偏向于高豐度分子鑒定[8]。因此，我們通過整合多個微陣列數據集即GEO，聯合轉錄組學（RNAseq）分析PDR患者外周血RNA序列表達，以期為PDR治療提供更為全面的分子生物學依據。現將結果報道如下。
1 對象和方法
基礎研究。本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審批［批準號：2020 KY（L）-42］。遵循《赫爾辛基宣言》原則，患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2020年10月于天津醫科大學眼科醫院檢查確診并住院治療的PDR患者3例（PDR組）及非糖尿病患者3例（對照組）納入本研究。PDR組患者均符合中華醫學會眼科學會眼底病學組制定的PDR診斷標準[9]，DR分期為5、6期，存在視盤新生血管、視網膜新生血管伴或不伴TRD；除糖尿病外無其他全身性疾病。對照組患者參照糖尿病診斷標準[10]排除糖尿病；無其他全身性疾病。
PDR組3例患者中，男性1例，女性2例；年齡（62.67±6.69）歲；糖尿病病程（11.33±6.98）年；糖化血紅蛋白（HbA1c）（8.567±0.897）%；空腹血糖（8.067±1.217）mmol/L。對照組3例患者中，男性1例，女性2例；年齡（72.67±5.81）歲；HbA1c（4.567±0.219）%；空腹血糖（4.267±0.882）mmol/L。兩組患者HbA1c、空腹血糖比較，差異均有統計學意義（t=4.333、3.114，P=0.012、0.036）。另外分別選取同期PDR、非糖尿病患者各40例行外周血驗證試驗，并據此分為PDR驗證組、對照驗證組。PDR驗證組40例患者中，男女性各20例；年齡（61.60±1.52）歲；糖尿病病程（10.00±1.70）年；HbA1c（7.945±0.257）%；空腹血糖（7.710±0.364）mmol/L。對照驗證組40例患者中，男女性各20例；年齡（69.65±1.59）歲；HbA1c（4.590±0.107）%；空腹血糖（4.620±0.899）mmol/L。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義（t=1.843，P=0.073）；HbA1c、空腹血糖比較，差異有統計學意義（t=12.050、8.244，P＜0.001）。
采用所有患者空腹外周靜脈血3～5 ml。其中，PDR驗證組、對照驗證組標本行外周血驗證試驗。PDR組、對照組標本妥善處理保存后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行RNA測序。按標準方法提取各組患者外周血總RNA，檢測其是否降解或被污染；測定RNA純度、濃度以及測定RNA是否完整。質檢合格的RNA進行轉錄組樣品制備、聚類和重新測序；對原始數據進行質量控制；將讀段與人類參考基因組和注釋的轉錄本進行比對；最后進行DEG的檢測。
采用RNAseq測序技術篩選PDR組、對照組DEG；篩選標準為差異表達倍數（FC）≥2且校正后q值≤0.05[11]。對于具有生物學重復的樣本，使用DESeq分析DEG；無生物學重復的樣本，通過R語言修改程序包分析DEG。均通過Benjamini-Hochberg（BH）法對P值進行矯正以控制假陽性率，校正后P＜0.05的基因被認定為DEG。
使用David（https://david.ncifcrf.gov/）平臺對DEG進行基因注釋（GO）功能富集分析，包括生物學過程、細胞成分、分子功能。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1）平臺進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析，結合KEGG功能注釋，選擇富集程度最高的20個條目繪制富集柱狀圖。對DEG行蛋白-蛋白互作網絡（PPI）分析，使用STRING 11.0數據庫查找1 337個DEG關聯蛋白，根據現有數據庫和實驗驗證的證據篩選出前100個關聯節點，應用Cytoscape 3.5.1軟件網絡分析工具繪制PPI圖（圖1）。
圖1
差異表達基因蛋白-蛋白互作網絡圖。節點越大表示關聯節點數量越多
應用美國國立生物技術信息中心的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）查找DR相關高通量數據，選擇多個隊列集合后的結果進行分析。通過GEO自帶分析工具GEO2R對數據自行分組并選擇相應的樣本入組，根據P＜0.05進行篩選，多重假設檢驗得到的adj.P.Val值默認通過BH法進行矯正，差異最顯著（即adj.P.Val值最小）排列首位，最后得到差異數據。通過Targetscan平臺對差異表達的miRNA進行靶基因預測。
采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中與PDR相關的DEG mRNA相對表達量。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA試劑盒說明書進行逆轉錄得到cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設計相關引物，內參照為磷酸甘油醛脫氫酶（表1）。使用FastStart Universal SYBRGreen Master試劑盒進行qRT-PCR擴增，并輸出循環閾值（Ct值）。每個擴增體系體積為20 μl，每組行3～4個生物學重復，每個樣本設3個復孔。采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達情況。
表1
基因測序引物
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中與PDR相關的DEG蛋白相對表達量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白復合物，轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍三羥甲基氨甲烷緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次；辣根過氧化物酶標記的二抗繼續孵育1 h后，再以1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入超敏化學發光液曝光底物，測定目標蛋白的表達。實驗重復3次。
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示。PDR驗證組、對照驗證組間各項指標比較行配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RNAseq測序共篩選出1 337個DEG，上調基因419個，下調基因918個。其中，DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3等基因在PDR組患者中差異表達。
GO功能富集分析結果顯示，細胞成分方面，膜的固有成分、細胞外基質（ECM）、胞外區、細胞外周、細胞外間隙、質膜的組成部分、膠原三聚體被顯著富集（q＜0.05）；分子功能方面，氧化還原酶活性、氧化金屬離子、G蛋白偶聯受體活性、前列腺素受體活性、糖皮質激素受體活性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或NAD磷酸（NADP）作為受體、生長因子結合被顯著富集（q＜0.05）；生物學過程方面，細胞黏附、生物調節、細胞分化、血管系統發育、細胞增生調節、細胞遷移、細胞對細胞因子刺激的反應、血管形態發生等被顯著富集（q＜0.05）（圖2）。
圖2
基因注釋（GO）功能顯著富集分析柱狀圖。柱狀代表富集GO條目的q值，柱線越高表示q值越小，富集越顯著。1～25為生物學進程；26～43為細胞成分；44～57為分子功能。1. 行為；2. 生物黏附；3. 生物學階段；4. 生物調節；5. 細胞殺傷；6. 細胞成分的組織或生物發生；7. 細胞過程；8. 發育過程；9. 生長；10. 激素分泌；11. 免疫系統過程；12. 定位；13. 運動；14. 代謝過程；15. 多生物過程；16. 多細胞有機體過程；17. 生物過程的負調節；18. 生物過程的正調節；19. 生物過程的調節；20. 生殖；21. 生殖過程；22. 對刺激的反應；23. 節律過程；24. 信號；25. 單體過程；26. 細胞；27. 細胞連接；28. 細胞部分；29. 膠原三聚體；30. 細胞外基質；31. 細胞外基質部分；32. 細胞外區域；33. 細胞外區域部分；34. 大分子復合物膜；35. 膜部分；36. 膜包圍腔；37. 細胞器；38. 細胞器部分；39. 突觸；40. 突觸部分；41. 病毒離子；42. 病毒；43. 離子部分；44. 抗氧化活性；45. 結合；46. 催化活性；47. 通道調節活性；48. 電子載體活性；49. 酶調節活性；50. 鳥苷酸交換因子活性；51. 分子傳感器活性；52. 核酸結合轉錄因子活性；53. 蛋白質結合轉錄因子活性；54. 受體活性；55. 結構分子活性；56. 翻譯調節活性；57. 轉運體活性
KEGG信號通路富集分析結果顯示，黏附斑通路、軸突傳導、神經活性受體配體作用、煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸生物合成被顯著富集。主要富集通路為ECM受體作用、細胞因子調控通路、p53信號通路、半乳糖代謝等糖代謝途徑（q＜0.05）（圖3）。
圖3
京都基因與基因組百科全書的信號通路富集分析氣泡圖。氣泡越大富集越顯著，顏色越深，q值越大
PDR組DEG中，DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1為上調基因，BTG3為下調基因。GO功能富集分析結果顯示，DIABLO參與了氧化應激和細胞凋亡等生物學過程；ZBTB10參與了轉錄生物學過程；PLK3參與了細胞增生過程；PIK3R1具有蛋白激酶活性和參與氧化應激、細胞凋亡和細胞內信號傳遞過程；BTG3參與了磷脂酰肌醇3激酶（P13K）復合物構成，具有激酶調節器的分子功能，參與了ECM黏附的調節和葡萄糖轉運的正調節（表2）。
表2
PDR組差異基因及其GO注釋
PPI分析結果顯示，DEG關聯蛋白節點越大，關聯的節點數量越多，其中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3對該作用網絡形成作用顯著（圖4）。
圖4
PPI分析圖。4A～4E示分別DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3基因。紅色代表查詢蛋白；彩色代表與查詢蛋白直接作用蛋白。PPI：蛋白-蛋白互作網絡；DEG：差異表達基因
Targetscan平臺預測發現，正常人和DR患者間房水、玻璃體、血漿中hsa-miR-586、hsa-miR-3163、hsa-miR-3654、hsa-miR-4780、hsa-miR-206、hsa-miR-4313、hsa-miR-4284、hsa-miR-620、hsa-miR-3654、hsa-miR-3201、hsa-miR-578、hsa-miR-4464、hsa-miR-600、hsa-miR-4488、hsa-miR-4506存在差異表達[12] 。DEG DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3為該研究差異下游調控靶基因（圖5）。
圖5
差異miRNA預測基因。房水、玻璃體、血漿差異miRNA預測基因交集
qRT-PCR檢測結果顯示，以對照驗證組為“1”，PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3 mRNA相對表達量分別為12.50±0.58、18.00±0.56、16.00± 0.58、16.17±0.60、0.10±0.03。與對照驗證組比較，PDR驗證組DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1 mRNA相對表達量明顯升高，BTG3 mRNA相對表達明顯降低，差異均有統計學意義（t=19.92、29.44、25.98、25.24、31.18，P＜0.000 1）（圖6）。
圖6
PDR驗證組（n=20）、對照驗證組（n=20）患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3 mRNA相對表達量比較，****P＜0.000 1。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；DEG：差異表達基因
Western blot檢測結果顯示，PDR驗證組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3蛋白相對表達量分別為0.87±0.02、0.70±0.01、1.96±0.03、0.86± 0.01、0.64±0.02；對照驗證組分別為0.12±0.00、0.47±0.01、0.87±0.01、0.54±0.00、1.14±0.01。PDR組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1蛋白相對表達量明顯高于對照組，BTG3蛋白相對表達量明顯低于對照組，差異均有統計學意義（t=35.46、16.79、37.97、23.94、21.87，P＜0.000 1）（圖7）。
圖7
PDR驗證組（n=20）、對照驗證組（n=20）患者外周血單個核細胞中各DEG蛋白相對表達量比較。7A～7E分別示DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3。****P＜0.000 1。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；DEG：差異表達基因
3 討論
炎癥、缺血誘導的血管生成，ECM的擴張與玻璃體視網膜界面纖維血管膜的生長是PDR的病理特征[13-14]。PDR的發展涉及氧化應激、糖代謝反應、炎癥反應等[15-17]。各種反應相互促進、影響并最終導致新生血管、纖維膜生成和細胞損傷。其中氧化應激反應被認為是DR發展主要的致病機制[18-19]。氧化應激反應導致視網膜細胞凋亡，血管內皮生長因子表達上調[20-22]，促進和加重PDR的發生發展。并且高糖環境下生成的不可逆糖基化終末產物也可以誘導活性氧產生從而導致組織損傷[23]。本研究對3例PDR患者進行外周血轉錄組測序分析，共篩選到相關DEG 1 337個，其中表達上調基因419個，表達下調基因918個。GO功能富集結果顯示，細胞成分方面，膜的固有成分、ECM、胞外區、細胞外周、細胞外間隙、質膜的組成部分、膠原三聚體被顯著富集，在PDR發生發展過程中，高糖介導的細胞-細胞通訊障礙促進視網膜內穩態的破壞，而細胞膜作為細胞間通信的重要成分，在維持視網膜穩態方面具有重要意義[24]；分子功能方面，氧化還原酶活性、氧化金屬離子、G蛋白偶聯受體活性、前列腺素受體活性、糖皮質激素受體活性、NAD或NADP作為受體、生長因子結合等被顯著富集，氧化應激反應作為DR的主要發病機制之一，除有氧化成分的過量聚集，還可與其他細胞因子、細胞受體相互作用共同參與PDR的驅動[25]；生物學過程方面，細胞黏附、生物調節、細胞分化、血管系統發育、細胞增生調節、細胞遷移、細胞對細胞因子刺激的反應、血管形態發生等被顯著富集，PDR的發生發展涉及多個生物進程，其中新生血管和纖維化進程最為明顯[26-27]。KEGG通路富集分析結果顯示，p53通路、ECM受體信號通路、細胞因子受體通路、代謝通路與炎癥反應、血管纖維化反應、細胞損傷過程相關。Smit-McBride等[12]實驗結果為研究PDR患者視網膜細胞代謝改變、細胞異常增生和炎癥氧化損傷提供了理論依據。根據RNAseq分析，預測基因DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3在PDR患者外周血差異表達，涉及到氧化應激、細胞凋亡、細胞增生、信號傳導等進程，對于PDR的發病有著潛在作用。借助PPI分析篩選得到關鍵蛋白, 前100個關鍵蛋白主要參與細胞凋亡、代謝相關生物過程。本研究結果顯示，PDR患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1基因表達上調，而BTG3基因表達下調。
第二線粒體源性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）激活劑/凋亡直接抑制劑結合蛋白（Smac/DIABLO）是一種促凋亡的線粒體蛋白，在多種凋亡刺激下釋放到胞漿中，并拮抗凋亡抑制蛋白，從而激活Caspase[28]。Smac/DIABLO在胃癌和大腸癌中均顯著表達，參與細胞凋亡，可作為癌癥標記物[29]。ZBTB10作為Sp的抑制因子，受miR-17-92簇miRs調控，并且已知microRNA-27a:ZBTB10-SP1信號通路在細胞增生等方面具有重要意義[30-31]。PLK3作為細胞凋亡和各種細胞應激的介質參與細胞周期控制和進展，在不同類型腫瘤中均有異常表達[32]。PLK3通過M期參與細胞周期進程的調節，在調節細胞微管動力學和中心體功能中起著重要作用，并且不受調控表達導致細胞周期停滯和凋亡[33]。有研究首次證明PLK3是缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）穩定性的負調節因子，與PI3K、蛋白激酶B、糖原合成酶激酶3β信號成分以一種協調和整合的方式發揮作用，相互調控和調節下游成分HIF-1α[34]。PLK3在內的調控信號網絡不僅對HIF-1α的動態平衡至關重要，而且對惡性細胞的存活和增生也至關重要[35]。有研究發現，PIK3R1在肝癌組織中高表達[36]。PIK3R1基因敲除可抑制肝癌細胞的增生、遷移和凋亡[37]。PIK3R1編碼PI3K的調節亞單位，而PI3K途徑是腫瘤發生的關鍵因素，也是腫瘤中普遍存在的過度激活的信號通路，因此PIK3R1對于腫瘤的發生有重要意義[38]。以上4種基因在PDR組均表達上調，促進細胞增生、遷移和凋亡，加速PDR進展。BTG3是一種通過抑制細胞增生、遷移和調節細胞周期進程的腫瘤抑制劑[39]。BTG3基因敲除可能增強侵襲性結直腸癌的行為[40]。Majid等[41]發現，BTG3作為細胞周期負調控因子在腎癌中明顯下調，導致癌細胞增生，故該基因的表達下調可能參與PDR的發生發展過程。
GEO作為一個儲存芯片、二代測序以及其他高通量測序數據的數據庫，可以檢索到目前已有并上傳網絡共享實驗測序數據，有研究組為觀察DR患者眼內液和血漿中miRNA的獨特分子特征，收集了73份樣本進行高通量測序，我們將本研究結果與之進行隊列集合后聯合分析，再根據TragetScan（http.//www.targetscan.org/vert_72/）預測下游靶基因，取交集發現血漿hsa-miR-586、玻璃體hsa-miR-3163預測靶基因為BTG3，房水hsa-miR-3654、玻璃體hsa-miR-4780、血漿hsa-miR-206預測下游靶基因為PIK3R1，房水hsa-miR-4313、玻璃體hsa-miR-4284、血漿hsa-miR-620預測靶基因為PLK3，房水hsa-miR-3654、玻璃體hsa-miR-3201、血漿hsa-miR-578預測靶基因為ZBTB10，房水hsa-miR-4464和hsa-miR-600、玻璃體hsa-miR-4488、血漿hsa-miR-4506預測靶基因為DIABLO。該結論為本研究DEG分析結果提供了良好質控保證，為進一步探索DEG在PDR中的潛在作用提供堅實的信用支持。
本研究的不足是樣本量少，今后研究中需進一步擴大樣本量以確保研究結論的穩定性。另外，本研究對照組為非PDR患者，非年齡、性別匹配的正常志愿者，可能會對樣本的均一性產生一定程度影響，有關此點在未來擴大樣本研究中我們會同時予以關注。最后，本研究得出的DEG具體致病機制不清晰，有待進一步在人源樣本以及體外細胞模型中予以深入探討。
增生型糖尿病視網膜病變（DR）臨床特征為視網膜和視盤新生血管形成，易導致視網膜前纖維化和牽拉性視網膜脫離（TRD）[1]。手術是治療增生型DR（PDR）患者TRD的有效手段[2]。但因手術難度大、恢復時間長、預后效果差等問題[3]，尋找新的靶點有效抑制PDR進展十分必要。轉錄組學是一種生物信息分析手段，可從整體上研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律[4]。基因表達總庫（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由研究界提交的高通量微陣列和下一代序列功能基因組數據集的國際公共信息庫，通過此數據庫對高通量數據進行檢索分析，可以幫助用戶查詢、分析和可視化數據，是檢索分析數據過程中一種必不可少的信息庫[5]。高通量微陣列平臺成為檢測致癌過程中的基因改變和發現多種疾病的生物標記物的一種有用工具，可應用于差異表達基因（DEG）與癌癥相關性的研究[6-7]。然而，單獨微陣列調查往往顯示出由于樣本數量不足而偏向于高豐度分子鑒定[8]。因此，我們通過整合多個微陣列數據集即GEO，聯合轉錄組學（RNAseq）分析PDR患者外周血RNA序列表達，以期為PDR治療提供更為全面的分子生物學依據。現將結果報道如下。
1 對象和方法
基礎研究。本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審批［批準號：2020 KY（L）-42］。遵循《赫爾辛基宣言》原則，患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2020年10月于天津醫科大學眼科醫院檢查確診并住院治療的PDR患者3例（PDR組）及非糖尿病患者3例（對照組）納入本研究。PDR組患者均符合中華醫學會眼科學會眼底病學組制定的PDR診斷標準[9]，DR分期為5、6期，存在視盤新生血管、視網膜新生血管伴或不伴TRD；除糖尿病外無其他全身性疾病。對照組患者參照糖尿病診斷標準[10]排除糖尿病；無其他全身性疾病。
PDR組3例患者中，男性1例，女性2例；年齡（62.67±6.69）歲；糖尿病病程（11.33±6.98）年；糖化血紅蛋白（HbA1c）（8.567±0.897）%；空腹血糖（8.067±1.217）mmol/L。對照組3例患者中，男性1例，女性2例；年齡（72.67±5.81）歲；HbA1c（4.567±0.219）%；空腹血糖（4.267±0.882）mmol/L。兩組患者HbA1c、空腹血糖比較，差異均有統計學意義（t=4.333、3.114，P=0.012、0.036）。另外分別選取同期PDR、非糖尿病患者各40例行外周血驗證試驗，并據此分為PDR驗證組、對照驗證組。PDR驗證組40例患者中，男女性各20例；年齡（61.60±1.52）歲；糖尿病病程（10.00±1.70）年；HbA1c（7.945±0.257）%；空腹血糖（7.710±0.364）mmol/L。對照驗證組40例患者中，男女性各20例；年齡（69.65±1.59）歲；HbA1c（4.590±0.107）%；空腹血糖（4.620±0.899）mmol/L。兩組患者年齡比較，差異無統計學意義（t=1.843，P=0.073）；HbA1c、空腹血糖比較，差異有統計學意義（t=12.050、8.244，P＜0.001）。
采用所有患者空腹外周靜脈血3～5 ml。其中，PDR驗證組、對照驗證組標本行外周血驗證試驗。PDR組、對照組標本妥善處理保存后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行RNA測序。按標準方法提取各組患者外周血總RNA，檢測其是否降解或被污染；測定RNA純度、濃度以及測定RNA是否完整。質檢合格的RNA進行轉錄組樣品制備、聚類和重新測序；對原始數據進行質量控制；將讀段與人類參考基因組和注釋的轉錄本進行比對；最后進行DEG的檢測。
采用RNAseq測序技術篩選PDR組、對照組DEG；篩選標準為差異表達倍數（FC）≥2且校正后q值≤0.05[11]。對于具有生物學重復的樣本，使用DESeq分析DEG；無生物學重復的樣本，通過R語言修改程序包分析DEG。均通過Benjamini-Hochberg（BH）法對P值進行矯正以控制假陽性率，校正后P＜0.05的基因被認定為DEG。
使用David（https://david.ncifcrf.gov/）平臺對DEG進行基因注釋（GO）功能富集分析，包括生物學過程、細胞成分、分子功能。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1）平臺進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析，結合KEGG功能注釋，選擇富集程度最高的20個條目繪制富集柱狀圖。對DEG行蛋白-蛋白互作網絡（PPI）分析，使用STRING 11.0數據庫查找1 337個DEG關聯蛋白，根據現有數據庫和實驗驗證的證據篩選出前100個關聯節點，應用Cytoscape 3.5.1軟件網絡分析工具繪制PPI圖（圖1）。
圖1
差異表達基因蛋白-蛋白互作網絡圖。節點越大表示關聯節點數量越多
應用美國國立生物技術信息中心的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）查找DR相關高通量數據，選擇多個隊列集合后的結果進行分析。通過GEO自帶分析工具GEO2R對數據自行分組并選擇相應的樣本入組，根據P＜0.05進行篩選，多重假設檢驗得到的adj.P.Val值默認通過BH法進行矯正，差異最顯著（即adj.P.Val值最小）排列首位，最后得到差異數據。通過Targetscan平臺對差異表達的miRNA進行靶基因預測。
采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中與PDR相關的DEG mRNA相對表達量。按照RevertAidTMFirst Strand cDNA試劑盒說明書進行逆轉錄得到cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件設計相關引物，內參照為磷酸甘油醛脫氫酶（表1）。使用FastStart Universal SYBRGreen Master試劑盒進行qRT-PCR擴增，并輸出循環閾值（Ct值）。每個擴增體系體積為20 μl，每組行3～4個生物學重復，每個樣本設3個復孔。采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達情況。
表1
基因測序引物
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中與PDR相關的DEG蛋白相對表達量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白復合物，轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍三羥甲基氨甲烷緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次；辣根過氧化物酶標記的二抗繼續孵育1 h后，再以1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入超敏化學發光液曝光底物，測定目標蛋白的表達。實驗重復3次。
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。PDR驗證組、對照驗證組間各項指標比較行配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RNAseq測序共篩選出1 337個DEG，上調基因419個，下調基因918個。其中，DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3等基因在PDR組患者中差異表達。
GO功能富集分析結果顯示，細胞成分方面，膜的固有成分、細胞外基質（ECM）、胞外區、細胞外周、細胞外間隙、質膜的組成部分、膠原三聚體被顯著富集（q＜0.05）；分子功能方面，氧化還原酶活性、氧化金屬離子、G蛋白偶聯受體活性、前列腺素受體活性、糖皮質激素受體活性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或NAD磷酸（NADP）作為受體、生長因子結合被顯著富集（q＜0.05）；生物學過程方面，細胞黏附、生物調節、細胞分化、血管系統發育、細胞增生調節、細胞遷移、細胞對細胞因子刺激的反應、血管形態發生等被顯著富集（q＜0.05）（圖2）。
圖2
基因注釋（GO）功能顯著富集分析柱狀圖。柱狀代表富集GO條目的q值，柱線越高表示q值越小，富集越顯著。1～25為生物學進程；26～43為細胞成分；44～57為分子功能。1. 行為；2. 生物黏附；3. 生物學階段；4. 生物調節；5. 細胞殺傷；6. 細胞成分的組織或生物發生；7. 細胞過程；8. 發育過程；9. 生長；10. 激素分泌；11. 免疫系統過程；12. 定位；13. 運動；14. 代謝過程；15. 多生物過程；16. 多細胞有機體過程；17. 生物過程的負調節；18. 生物過程的正調節；19. 生物過程的調節；20. 生殖；21. 生殖過程；22. 對刺激的反應；23. 節律過程；24. 信號；25. 單體過程；26. 細胞；27. 細胞連接；28. 細胞部分；29. 膠原三聚體；30. 細胞外基質；31. 細胞外基質部分；32. 細胞外區域；33. 細胞外區域部分；34. 大分子復合物膜；35. 膜部分；36. 膜包圍腔；37. 細胞器；38. 細胞器部分；39. 突觸；40. 突觸部分；41. 病毒離子；42. 病毒；43. 離子部分；44. 抗氧化活性；45. 結合；46. 催化活性；47. 通道調節活性；48. 電子載體活性；49. 酶調節活性；50. 鳥苷酸交換因子活性；51. 分子傳感器活性；52. 核酸結合轉錄因子活性；53. 蛋白質結合轉錄因子活性；54. 受體活性；55. 結構分子活性；56. 翻譯調節活性；57. 轉運體活性
KEGG信號通路富集分析結果顯示，黏附斑通路、軸突傳導、神經活性受體配體作用、煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸生物合成被顯著富集。主要富集通路為ECM受體作用、細胞因子調控通路、p53信號通路、半乳糖代謝等糖代謝途徑（q＜0.05）（圖3）。
圖3
京都基因與基因組百科全書的信號通路富集分析氣泡圖。氣泡越大富集越顯著，顏色越深，q值越大
PDR組DEG中，DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1為上調基因，BTG3為下調基因。GO功能富集分析結果顯示，DIABLO參與了氧化應激和細胞凋亡等生物學過程；ZBTB10參與了轉錄生物學過程；PLK3參與了細胞增生過程；PIK3R1具有蛋白激酶活性和參與氧化應激、細胞凋亡和細胞內信號傳遞過程；BTG3參與了磷脂酰肌醇3激酶（P13K）復合物構成，具有激酶調節器的分子功能，參與了ECM黏附的調節和葡萄糖轉運的正調節（表2）。
表2
PDR組差異基因及其GO注釋
PPI分析結果顯示，DEG關聯蛋白節點越大，關聯的節點數量越多，其中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3對該作用網絡形成作用顯著（圖4）。
圖4
PPI分析圖。4A～4E示分別DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3基因。紅色代表查詢蛋白；彩色代表與查詢蛋白直接作用蛋白。PPI：蛋白-蛋白互作網絡；DEG：差異表達基因
Targetscan平臺預測發現，正常人和DR患者間房水、玻璃體、血漿中hsa-miR-586、hsa-miR-3163、hsa-miR-3654、hsa-miR-4780、hsa-miR-206、hsa-miR-4313、hsa-miR-4284、hsa-miR-620、hsa-miR-3654、hsa-miR-3201、hsa-miR-578、hsa-miR-4464、hsa-miR-600、hsa-miR-4488、hsa-miR-4506存在差異表達[12] 。DEG DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3為該研究差異下游調控靶基因（圖5）。
圖5
差異miRNA預測基因。房水、玻璃體、血漿差異miRNA預測基因交集
qRT-PCR檢測結果顯示，以對照驗證組為“1”，PDR驗證組、對照驗證組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3 mRNA相對表達量分別為12.50±0.58、18.00±0.56、16.00± 0.58、16.17±0.60、0.10±0.03。與對照驗證組比較，PDR驗證組DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1 mRNA相對表達量明顯升高，BTG3 mRNA相對表達明顯降低，差異均有統計學意義（t=19.92、29.44、25.98、25.24、31.18，P＜0.000 1）（圖6）。
圖6
PDR驗證組（n=20）、對照驗證組（n=20）患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3 mRNA相對表達量比較，****P＜0.000 1。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；DEG：差異表達基因
Western blot檢測結果顯示，PDR驗證組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3蛋白相對表達量分別為0.87±0.02、0.70±0.01、1.96±0.03、0.86± 0.01、0.64±0.02；對照驗證組分別為0.12±0.00、0.47±0.01、0.87±0.01、0.54±0.00、1.14±0.01。PDR組患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1蛋白相對表達量明顯高于對照組，BTG3蛋白相對表達量明顯低于對照組，差異均有統計學意義（t=35.46、16.79、37.97、23.94、21.87，P＜0.000 1）（圖7）。
圖7
PDR驗證組（n=20）、對照驗證組（n=20）患者外周血單個核細胞中各DEG蛋白相對表達量比較。7A～7E分別示DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3。****P＜0.000 1。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；DEG：差異表達基因
3 討論
炎癥、缺血誘導的血管生成，ECM的擴張與玻璃體視網膜界面纖維血管膜的生長是PDR的病理特征[13-14]。PDR的發展涉及氧化應激、糖代謝反應、炎癥反應等[15-17]。各種反應相互促進、影響并最終導致新生血管、纖維膜生成和細胞損傷。其中氧化應激反應被認為是DR發展主要的致病機制[18-19]。氧化應激反應導致視網膜細胞凋亡，血管內皮生長因子表達上調[20-22]，促進和加重PDR的發生發展。并且高糖環境下生成的不可逆糖基化終末產物也可以誘導活性氧產生從而導致組織損傷[23]。本研究對3例PDR患者進行外周血轉錄組測序分析，共篩選到相關DEG 1 337個，其中表達上調基因419個，表達下調基因918個。GO功能富集結果顯示，細胞成分方面，膜的固有成分、ECM、胞外區、細胞外周、細胞外間隙、質膜的組成部分、膠原三聚體被顯著富集，在PDR發生發展過程中，高糖介導的細胞-細胞通訊障礙促進視網膜內穩態的破壞，而細胞膜作為細胞間通信的重要成分，在維持視網膜穩態方面具有重要意義[24]；分子功能方面，氧化還原酶活性、氧化金屬離子、G蛋白偶聯受體活性、前列腺素受體活性、糖皮質激素受體活性、NAD或NADP作為受體、生長因子結合等被顯著富集，氧化應激反應作為DR的主要發病機制之一，除有氧化成分的過量聚集，還可與其他細胞因子、細胞受體相互作用共同參與PDR的驅動[25]；生物學過程方面，細胞黏附、生物調節、細胞分化、血管系統發育、細胞增生調節、細胞遷移、細胞對細胞因子刺激的反應、血管形態發生等被顯著富集，PDR的發生發展涉及多個生物進程，其中新生血管和纖維化進程最為明顯[26-27]。KEGG通路富集分析結果顯示，p53通路、ECM受體信號通路、細胞因子受體通路、代謝通路與炎癥反應、血管纖維化反應、細胞損傷過程相關。Smit-McBride等[12]實驗結果為研究PDR患者視網膜細胞代謝改變、細胞異常增生和炎癥氧化損傷提供了理論依據。根據RNAseq分析，預測基因DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1、BTG3在PDR患者外周血差異表達，涉及到氧化應激、細胞凋亡、細胞增生、信號傳導等進程，對于PDR的發病有著潛在作用。借助PPI分析篩選得到關鍵蛋白, 前100個關鍵蛋白主要參與細胞凋亡、代謝相關生物過程。本研究結果顯示，PDR患者外周血單個核細胞中DIABLO、ZBTB10、PLK3、PIK3R1基因表達上調，而BTG3基因表達下調。
第二線粒體源性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）激活劑/凋亡直接抑制劑結合蛋白（Smac/DIABLO）是一種促凋亡的線粒體蛋白，在多種凋亡刺激下釋放到胞漿中，并拮抗凋亡抑制蛋白，從而激活Caspase[28]。Smac/DIABLO在胃癌和大腸癌中均顯著表達，參與細胞凋亡，可作為癌癥標記物[29]。ZBTB10作為Sp的抑制因子，受miR-17-92簇miRs調控，并且已知microRNA-27a:ZBTB10-SP1信號通路在細胞增生等方面具有重要意義[30-31]。PLK3作為細胞凋亡和各種細胞應激的介質參與細胞周期控制和進展，在不同類型腫瘤中均有異常表達[32]。PLK3通過M期參與細胞周期進程的調節，在調節細胞微管動力學和中心體功能中起著重要作用，并且不受調控表達導致細胞周期停滯和凋亡[33]。有研究首次證明PLK3是缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）穩定性的負調節因子，與PI3K、蛋白激酶B、糖原合成酶激酶3β信號成分以一種協調和整合的方式發揮作用，相互調控和調節下游成分HIF-1α[34]。PLK3在內的調控信號網絡不僅對HIF-1α的動態平衡至關重要，而且對惡性細胞的存活和增生也至關重要[35]。有研究發現，PIK3R1在肝癌組織中高表達[36]。PIK3R1基因敲除可抑制肝癌細胞的增生、遷移和凋亡[37]。PIK3R1編碼PI3K的調節亞單位，而PI3K途徑是腫瘤發生的關鍵因素，也是腫瘤中普遍存在的過度激活的信號通路，因此PIK3R1對于腫瘤的發生有重要意義[38]。以上4種基因在PDR組均表達上調，促進細胞增生、遷移和凋亡，加速PDR進展。BTG3是一種通過抑制細胞增生、遷移和調節細胞周期進程的腫瘤抑制劑[39]。BTG3基因敲除可能增強侵襲性結直腸癌的行為[40]。Majid等[41]發現，BTG3作為細胞周期負調控因子在腎癌中明顯下調，導致癌細胞增生，故該基因的表達下調可能參與PDR的發生發展過程。
GEO作為一個儲存芯片、二代測序以及其他高通量測序數據的數據庫，可以檢索到目前已有并上傳網絡共享實驗測序數據，有研究組為觀察DR患者眼內液和血漿中miRNA的獨特分子特征，收集了73份樣本進行高通量測序，我們將本研究結果與之進行隊列集合后聯合分析，再根據TragetScan（http.//www.targetscan.org/vert_72/）預測下游靶基因，取交集發現血漿hsa-miR-586、玻璃體hsa-miR-3163預測靶基因為BTG3，房水hsa-miR-3654、玻璃體hsa-miR-4780、血漿hsa-miR-206預測下游靶基因為PIK3R1，房水hsa-miR-4313、玻璃體hsa-miR-4284、血漿hsa-miR-620預測靶基因為PLK3，房水hsa-miR-3654、玻璃體hsa-miR-3201、血漿hsa-miR-578預測靶基因為ZBTB10，房水hsa-miR-4464和hsa-miR-600、玻璃體hsa-miR-4488、血漿hsa-miR-4506預測靶基因為DIABLO。該結論為本研究DEG分析結果提供了良好質控保證，為進一步探索DEG在PDR中的潛在作用提供堅實的信用支持。
本研究的不足是樣本量少，今后研究中需進一步擴大樣本量以確保研究結論的穩定性。另外，本研究對照組為非PDR患者，非年齡、性別匹配的正常志愿者，可能會對樣本的均一性產生一定程度影響，有關此點在未來擴大樣本研究中我們會同時予以關注。最后，本研究得出的DEG具體致病機制不清晰，有待進一步在人源樣本以及體外細胞模型中予以深入探討。
