引用本文： 陳亦棋, 陳煥, 王辰茜, 余嘉峰, 高微茜, 周聰穎, 陶繼偉, 毛劍波, 沈麗君. 糖尿病黃斑水腫患眼內界膜標本血管內皮生長因子和水通道蛋白4的表達. 中華眼底病雜志, 2021, 37(8): 617-622. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201228-00643 復制
糖尿病黃斑水腫（DME）是導致糖尿病視網膜病變（DR）患者視力下降最常見的原因，其主要是由于內、外血視網膜屏障受損所導致[1]。多數DME患眼通過抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療后水腫可有效消退，視力也得到改善，但部分患眼治療后水腫控制不夠理想[2-5]。對于這些臨床上難治性DME，玻璃體切割手術（PPV）聯合內界膜（ILM）剝除可改善其視網膜組織供氧以及減輕視網膜表面“微妙”牽拉以達到緩解水腫的目的，手術后多數患眼水腫消退[6-9]。但目前具體機制仍未完全明確。既往研究發現，人ILM中可以檢測到水通道蛋白（AQP）[10]。作為一類依賴滲透梯度和靜水壓力來調控水跨細胞膜雙向運動的膜蛋白，動物模型研究證實AQP在多種玻璃體視網膜疾病的發病機制中起重要作用[10-16]。VEGF表達量上調是DME發病機制中的關鍵環節，尤其是在發病早期[17]。Kida等[16]在糖尿病大鼠模型中證實VEGF和AQP4參與介導Müller細胞腫脹的發生。另有學者也發現VEGF和AQP4均與DR有關，兩者均在視網膜組織中表達[14,18]。而ILM作為Müller細胞的基底膜，關于DR患眼ILM中VEGF和AQP4表達研究則鮮見報道。為此，我們對比觀察了有DME、無DME的DR患眼及特發性黃斑裂孔（iMH）患眼ILM標本中VEGF與AQP4的表達，初步分析VEGF與AQP4表達量的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
橫斷面研究。本研究經溫州醫科大學附屬眼視光醫院倫理委員會批準（批準號：2019-168-K-160）；遵循《赫爾辛基宣言》原則，所有患者手術前均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年9月至2020年9月于溫州醫科大學附屬眼視光醫院杭州院區接受PPV聯合ILM剝除治療的DR和iMH患者38例38只眼納入本研究。其中，男性25例，女性13例；年齡37～76歲，平均年齡（59±10）歲；右眼15只，左眼23只。iMH、DR分別為9例9只眼和29例29只眼，并據此分為iMH組、DR組。所有患眼均行最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、前置鏡、B型超聲、眼底彩色照相、光相干斷層掃描（OCT）檢查。根據有無DME將DR組患眼再分為DME組、無DME組，分別為14例14只眼和15例15只眼。iMH組9例9只眼中，男性3例，女性6例；年齡48～72歲，平均年齡（63±10）歲；右眼3只，左眼6只。無DME組15例15只眼中，男性12例，女性3例；年齡37～76歲，平均年齡（58±11）歲；右眼6只，左眼9只；DR、增生型DR（PDR）分別為6、9只眼；伴玻璃體積血（VH）12只眼，其中DR、PDR分別為5、7只眼。DME組14例14只眼中，男性10例，女性4例；年齡31～68歲，平均年齡（59±10）歲；右眼6只，左眼8只；DR、PDR分別為6、8只眼；伴VH 10只眼，其中DR、PDR各5只眼。
DR納入標準：Ⅳ期及以上，因VH、牽拉性視網膜脫離等行PPV治療。iMH納入標準：（1）OCT檢查確診為黃斑全層裂孔；（2）無全身其他器官疾病適宜手術者。排除標準：（1）既往曾行抗VEGF藥物治療或黃斑區激光光凝治療；（2）既往曾行PPV治療。
所有患眼均接受標準經睫狀體平坦部三通道PPV。手術由同一位經驗豐富的眼底病外科醫生完成。DR患眼，已有DME或有增生膜牽拉者以及無DME或增生膜牽拉，但后脫離后仍有條索狀后皮質粘連者，為防止手術后增生發生，均行ILM剝除。手術中設置眼內照明強度＜40%，充分切除玻璃體后，0.1 ml曲安奈德（0.1 ml/ 4 mg）染色輔助清除玻璃體后皮質，0.02 ml（0.17%）吲哚青綠輔助染色，剝除黃斑區ILM。
收集手術中剝除的ILM標本，置于載玻片上，體視顯微鏡下，應用玻璃移液管將ILM在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）中充分鋪展，4 ℃、4%多聚甲醛固定時間≥24 h。0.3%牛血清白蛋白+1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100孵育30 min，加入30 μl適當稀釋（1:240）的AQP4一抗（AQP4多克隆抗體）和1:30濃度的VEGF一抗（VEGF單克隆抗體），4 ℃孵育過夜；用0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。吸除PBS，加入30 μl稀釋（1:300）的AQP4（山羊抗兔IgG/藻紅蛋白抗體）二抗和1:300濃度的VEGF二抗（山羊抗小鼠 IgG/異硫氰酸熒光素抗體），37 ℃條件下避光孵育1.5 h；避光條件下0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。指甲油封片后－20 ℃保存過夜。iMH組、無DME組、DME組各隨機抽取1份標本做無一抗處理，即應用一抗稀釋液代替一抗，其余操作步驟相同。
激光共聚焦顯微鏡下進行圖片觀察與采集，每個標本分別獲取AQP4熒光模式與VEGF熒光模式圖片各1張。所有采集參數始終保持不變。通過顯微鏡配套軟件ZEN獲得免疫熒光圖像后，應用Image J測量ILM標本中AQP4或VEGF熒光強度。將所有圖像格式轉換為8-bit并設定統一閾值，盡可能大面積的在圖片中框定鋪平ILM組織，測量熒光強度值（圖1）。
圖1
Image J軟件內界膜組織熒光強度測量示意圖 ×400
采用SPSS 22.0軟件行統計學分析。所有數據經正態性檢驗后均符合正態分布，以均數±標準差（
±s）表示。組間標本VEGF、AQP4免疫熒光值比較采用單因素方差分析；AQP4熒光強度值與VEGF熒光強度值之間的相關性采用Pearson相關性分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，DR組ILM標本中均觀察到明顯AQP4、VEGF熒光陽性反應，且兩者分布形態具有一定的相似性。其中，DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布不均勻，呈聚集成簇狀分布；無DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布相對均勻；iMH組ILM標本中也觀察到均勻的AQP4、VEGF陽性反應（圖2）。3組無一抗的ILM標本中未觀察到明顯陽性免疫反應。
圖2
各組ILM標本激光共聚焦顯微鏡像。2A～2C、2D～2F分別示DME組、無DME、iMH組ILM標本中AQP4、VEGF陽性熒光分布。DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布不均勻，呈聚集成簇狀分布（2A、2D）；無DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布較均勻（2B、2E）；iMH組ILM標本中AQP4、VEGF分布均勻（2C、2F）。2A～2C：藻紅蛋白 ×400；2D～2F：異硫氰酸熒光素 ×400。ILM：內界膜；DME：糖尿病黃斑水腫；iMH：特發性黃斑裂孔；AQP4：水通道蛋白4；VEGF：血管內皮生長因子
DME組ILM標本中VEGF、AQP4平均熒光強度值顯著高于無DME組、iMH組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而無DME組與iMH組之間VEGF、AQP4平均熒光強度值差異均無統計學意義（F=13.977、9.454，P=0.443、0.969）（表1）。
表1
3組ILM標本中VEGF、AQP4熒光強度值比較（
±s）
DR組IML標本中VEGF、AQP4平均熒光強度值分別為33.80±7.91、43.76±9.44。Pearson相關性分析結果顯示，兩者具有顯著正相關（r=0.597，P=0.003）（圖3）。
圖3
DR患眼ILM標本中VEGF與AQP4熒光強度值相關性分析結果（n=27）。DR：糖尿病視網膜病變；ILM：內界膜；VEGF：血管內皮生長因子；AQP4：水通道蛋白4
3 討論
DME發病機制主要是由于糖尿病患者長期高血糖引起的周細胞減少、基底膜增厚以及視網膜毛細血管內皮緊密連接的喪失而引起的液體從視網膜毛細血管滲入黃斑[19-20]。內、外血視網膜屏障的破壞均可能導致黃斑水腫的發生。多種生化途徑在DME的發生和進展中發揮作用[17,21-25]。其中，VEGF是破壞血視網膜屏障的重要介質，其表達量的上調是DME發病機制中的關鍵環節，尤其是在發病早期[17, 26]。Müller細胞主要通過產生VEGF或VEGF-A參與視網膜炎癥、新生血管的形成、血管滲漏和損傷，也是與DR相關的關鍵病理過程[18]。早前許多研究證實，Müller細胞可能是DR發生過程中VEGF的主要來源之一[27-30]。由此推測，DR患者Müller細胞中VEGF表達量會增加；而作為Müller細胞基底膜，ILM中的VEGF表達量也會增高，這與本研究的結果相印證。
盡管多數患者通過抗VEGF藥物治療可以有效消退DME以及改善視力，但仍有部分患者未能達到最佳的水腫控制效果[31]。有學者提出PPV可減少玻璃體對黃斑區的牽引，減少VEGF含量，提高視網膜的氧飽和度[32]；而ILM剝除可改善玻璃體與視網膜之間的流體動力學性質和效率[33]。因此，通過PPV聯合ILM剝除手術可能改善視網膜組織的供氧以及減輕視網膜表面的“微妙”牽拉作用以達到治療DME的效果。然而，本研究結果顯示，DME患眼ILM標本中VEGF表達量較iMH、無DME患眼顯著增高，提示人ILM組織中存在VEGF，且DME患者ILM中VEGF表達量上升。因此，對于伴有DME的DR患者采用PPV聯合剝除ILM治療，可以用低粘性的電解質水溶液代替粘性的凝膠狀玻璃體，能更有效地從視網膜上清除VEGF和其他細胞因子，且可以使更多的氧氣從前節進入缺血的視網膜組織，從而減輕黃斑水腫[34]。
既往研究發現，人類ILM中可檢測出AQP4、AQP47、AQP411[10]；而AQP4僅存在于Müller細胞和星形膠質細胞中，且在Müller細胞中呈極化分布[35]。本研究結果顯示，DME組ILM標本中AQP4免疫熒光強度值顯著高于iMH組、無DME組，表明DR伴DME患者ILM中AQP4表達量增加。既往研究發現，視網膜血管完全被Müller細胞足端包繞，與足端接觸的毛細血管內皮可釋放K+、酸性物質和水，而Müller細胞大量表達AQP4，進而協同維持神經元活動期間細胞外的滲透壓[36]。但具體調控機制有待進一步證實。
本研究結果證實VEGF和AQP4在人類活體ILM組織中均可表達，且兩者在DME患者ILM中表達量顯著增加；此外，DR患者ILM中VEGF和AQP4表達呈正相關。這說明兩者在DR病理過程中可能具有協同作用，但具體調控機制有待進一步明確。
本研究存在的局限性：（1）僅按照DR是否伴DME進行分組，后續可進行更細化的分組研究；（2）未能對黃斑水腫程度進行量化從而與AQP4和VEGF的表達量進行明確計量分析；（3）僅局限于ILM標本，后續可結合患者玻璃體液以及基因層面的研究，更進一步探討發病機制。
糖尿病黃斑水腫（DME）是導致糖尿病視網膜病變（DR）患者視力下降最常見的原因，其主要是由于內、外血視網膜屏障受損所導致[1]。多數DME患眼通過抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療后水腫可有效消退，視力也得到改善，但部分患眼治療后水腫控制不夠理想[2-5]。對于這些臨床上難治性DME，玻璃體切割手術（PPV）聯合內界膜（ILM）剝除可改善其視網膜組織供氧以及減輕視網膜表面“微妙”牽拉以達到緩解水腫的目的，手術后多數患眼水腫消退[6-9]。但目前具體機制仍未完全明確。既往研究發現，人ILM中可以檢測到水通道蛋白（AQP）[10]。作為一類依賴滲透梯度和靜水壓力來調控水跨細胞膜雙向運動的膜蛋白，動物模型研究證實AQP在多種玻璃體視網膜疾病的發病機制中起重要作用[10-16]。VEGF表達量上調是DME發病機制中的關鍵環節，尤其是在發病早期[17]。Kida等[16]在糖尿病大鼠模型中證實VEGF和AQP4參與介導Müller細胞腫脹的發生。另有學者也發現VEGF和AQP4均與DR有關，兩者均在視網膜組織中表達[14,18]。而ILM作為Müller細胞的基底膜，關于DR患眼ILM中VEGF和AQP4表達研究則鮮見報道。為此，我們對比觀察了有DME、無DME的DR患眼及特發性黃斑裂孔（iMH）患眼ILM標本中VEGF與AQP4的表達，初步分析VEGF與AQP4表達量的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
橫斷面研究。本研究經溫州醫科大學附屬眼視光醫院倫理委員會批準（批準號：2019-168-K-160）；遵循《赫爾辛基宣言》原則，所有患者手術前均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年9月至2020年9月于溫州醫科大學附屬眼視光醫院杭州院區接受PPV聯合ILM剝除治療的DR和iMH患者38例38只眼納入本研究。其中，男性25例，女性13例；年齡37～76歲，平均年齡（59±10）歲；右眼15只，左眼23只。iMH、DR分別為9例9只眼和29例29只眼，并據此分為iMH組、DR組。所有患眼均行最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、前置鏡、B型超聲、眼底彩色照相、光相干斷層掃描（OCT）檢查。根據有無DME將DR組患眼再分為DME組、無DME組，分別為14例14只眼和15例15只眼。iMH組9例9只眼中，男性3例，女性6例；年齡48～72歲，平均年齡（63±10）歲；右眼3只，左眼6只。無DME組15例15只眼中，男性12例，女性3例；年齡37～76歲，平均年齡（58±11）歲；右眼6只，左眼9只；DR、增生型DR（PDR）分別為6、9只眼；伴玻璃體積血（VH）12只眼，其中DR、PDR分別為5、7只眼。DME組14例14只眼中，男性10例，女性4例；年齡31～68歲，平均年齡（59±10）歲；右眼6只，左眼8只；DR、PDR分別為6、8只眼；伴VH 10只眼，其中DR、PDR各5只眼。
DR納入標準：Ⅳ期及以上，因VH、牽拉性視網膜脫離等行PPV治療。iMH納入標準：（1）OCT檢查確診為黃斑全層裂孔；（2）無全身其他器官疾病適宜手術者。排除標準：（1）既往曾行抗VEGF藥物治療或黃斑區激光光凝治療；（2）既往曾行PPV治療。
所有患眼均接受標準經睫狀體平坦部三通道PPV。手術由同一位經驗豐富的眼底病外科醫生完成。DR患眼，已有DME或有增生膜牽拉者以及無DME或增生膜牽拉，但后脫離后仍有條索狀后皮質粘連者，為防止手術后增生發生，均行ILM剝除。手術中設置眼內照明強度＜40%，充分切除玻璃體后，0.1 ml曲安奈德（0.1 ml/ 4 mg）染色輔助清除玻璃體后皮質，0.02 ml（0.17%）吲哚青綠輔助染色，剝除黃斑區ILM。
收集手術中剝除的ILM標本，置于載玻片上，體視顯微鏡下，應用玻璃移液管將ILM在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）中充分鋪展，4 ℃、4%多聚甲醛固定時間≥24 h。0.3%牛血清白蛋白+1%聚乙二醇辛基苯基醚X-100孵育30 min，加入30 μl適當稀釋（1:240）的AQP4一抗（AQP4多克隆抗體）和1:30濃度的VEGF一抗（VEGF單克隆抗體），4 ℃孵育過夜；用0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。吸除PBS，加入30 μl稀釋（1:300）的AQP4（山羊抗兔IgG/藻紅蛋白抗體）二抗和1:300濃度的VEGF二抗（山羊抗小鼠 IgG/異硫氰酸熒光素抗體），37 ℃條件下避光孵育1.5 h；避光條件下0.01 mol/L PBS漂洗5 min，3次。指甲油封片后－20 ℃保存過夜。iMH組、無DME組、DME組各隨機抽取1份標本做無一抗處理，即應用一抗稀釋液代替一抗，其余操作步驟相同。
激光共聚焦顯微鏡下進行圖片觀察與采集，每個標本分別獲取AQP4熒光模式與VEGF熒光模式圖片各1張。所有采集參數始終保持不變。通過顯微鏡配套軟件ZEN獲得免疫熒光圖像后，應用Image J測量ILM標本中AQP4或VEGF熒光強度。將所有圖像格式轉換為8-bit并設定統一閾值，盡可能大面積的在圖片中框定鋪平ILM組織，測量熒光強度值（圖1）。
圖1
Image J軟件內界膜組織熒光強度測量示意圖 ×400
采用SPSS 22.0軟件行統計學分析。所有數據經正態性檢驗后均符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示。組間標本VEGF、AQP4免疫熒光值比較采用單因素方差分析；AQP4熒光強度值與VEGF熒光強度值之間的相關性采用Pearson相關性分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，DR組ILM標本中均觀察到明顯AQP4、VEGF熒光陽性反應，且兩者分布形態具有一定的相似性。其中，DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布不均勻，呈聚集成簇狀分布；無DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布相對均勻；iMH組ILM標本中也觀察到均勻的AQP4、VEGF陽性反應（圖2）。3組無一抗的ILM標本中未觀察到明顯陽性免疫反應。
圖2
各組ILM標本激光共聚焦顯微鏡像。2A～2C、2D～2F分別示DME組、無DME、iMH組ILM標本中AQP4、VEGF陽性熒光分布。DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布不均勻，呈聚集成簇狀分布（2A、2D）；無DME組ILM標本中AQP4、VEGF分布較均勻（2B、2E）；iMH組ILM標本中AQP4、VEGF分布均勻（2C、2F）。2A～2C：藻紅蛋白 ×400；2D～2F：異硫氰酸熒光素 ×400。ILM：內界膜；DME：糖尿病黃斑水腫；iMH：特發性黃斑裂孔；AQP4：水通道蛋白4；VEGF：血管內皮生長因子
DME組ILM標本中VEGF、AQP4平均熒光強度值顯著高于無DME組、iMH組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而無DME組與iMH組之間VEGF、AQP4平均熒光強度值差異均無統計學意義（F=13.977、9.454，P=0.443、0.969）（表1）。
表1
3組ILM標本中VEGF、AQP4熒光強度值比較（±s）
DR組IML標本中VEGF、AQP4平均熒光強度值分別為33.80±7.91、43.76±9.44。Pearson相關性分析結果顯示，兩者具有顯著正相關（r=0.597，P=0.003）（圖3）。
圖3
DR患眼ILM標本中VEGF與AQP4熒光強度值相關性分析結果（n=27）。DR：糖尿病視網膜病變；ILM：內界膜；VEGF：血管內皮生長因子；AQP4：水通道蛋白4
3 討論
DME發病機制主要是由于糖尿病患者長期高血糖引起的周細胞減少、基底膜增厚以及視網膜毛細血管內皮緊密連接的喪失而引起的液體從視網膜毛細血管滲入黃斑[19-20]。內、外血視網膜屏障的破壞均可能導致黃斑水腫的發生。多種生化途徑在DME的發生和進展中發揮作用[17,21-25]。其中，VEGF是破壞血視網膜屏障的重要介質，其表達量的上調是DME發病機制中的關鍵環節，尤其是在發病早期[17, 26]。Müller細胞主要通過產生VEGF或VEGF-A參與視網膜炎癥、新生血管的形成、血管滲漏和損傷，也是與DR相關的關鍵病理過程[18]。早前許多研究證實，Müller細胞可能是DR發生過程中VEGF的主要來源之一[27-30]。由此推測，DR患者Müller細胞中VEGF表達量會增加；而作為Müller細胞基底膜，ILM中的VEGF表達量也會增高，這與本研究的結果相印證。
盡管多數患者通過抗VEGF藥物治療可以有效消退DME以及改善視力，但仍有部分患者未能達到最佳的水腫控制效果[31]。有學者提出PPV可減少玻璃體對黃斑區的牽引，減少VEGF含量，提高視網膜的氧飽和度[32]；而ILM剝除可改善玻璃體與視網膜之間的流體動力學性質和效率[33]。因此，通過PPV聯合ILM剝除手術可能改善視網膜組織的供氧以及減輕視網膜表面的“微妙”牽拉作用以達到治療DME的效果。然而，本研究結果顯示，DME患眼ILM標本中VEGF表達量較iMH、無DME患眼顯著增高，提示人ILM組織中存在VEGF，且DME患者ILM中VEGF表達量上升。因此，對于伴有DME的DR患者采用PPV聯合剝除ILM治療，可以用低粘性的電解質水溶液代替粘性的凝膠狀玻璃體，能更有效地從視網膜上清除VEGF和其他細胞因子，且可以使更多的氧氣從前節進入缺血的視網膜組織，從而減輕黃斑水腫[34]。
既往研究發現，人類ILM中可檢測出AQP4、AQP47、AQP411[10]；而AQP4僅存在于Müller細胞和星形膠質細胞中，且在Müller細胞中呈極化分布[35]。本研究結果顯示，DME組ILM標本中AQP4免疫熒光強度值顯著高于iMH組、無DME組，表明DR伴DME患者ILM中AQP4表達量增加。既往研究發現，視網膜血管完全被Müller細胞足端包繞，與足端接觸的毛細血管內皮可釋放K+、酸性物質和水，而Müller細胞大量表達AQP4，進而協同維持神經元活動期間細胞外的滲透壓[36]。但具體調控機制有待進一步證實。
本研究結果證實VEGF和AQP4在人類活體ILM組織中均可表達，且兩者在DME患者ILM中表達量顯著增加；此外，DR患者ILM中VEGF和AQP4表達呈正相關。這說明兩者在DR病理過程中可能具有協同作用，但具體調控機制有待進一步明確。
本研究存在的局限性：（1）僅按照DR是否伴DME進行分組，后續可進行更細化的分組研究；（2）未能對黃斑水腫程度進行量化從而與AQP4和VEGF的表達量進行明確計量分析；（3）僅局限于ILM標本，后續可結合患者玻璃體液以及基因層面的研究，更進一步探討發病機制。
