前列腺素E2受體對高糖環境中人視網膜微血管內皮細胞炎癥小體活化和細胞損傷作用_《中華眼底病雜志》

作者：

張忠紅 ^1,2 , 姚勇 ¹ , 謝田華 ¹ , 吳美麗 ^1,3 , 鄒健 ³ ,  王曉露 ^1,3

1. 南京醫科大學附屬無錫人民醫院眼科 214023;
2. 東南大學附屬中大醫院眼科，南京 210009;
3. 南京醫科大學附屬無錫人民醫院臨床研究中心 214023;

關鍵詞：

受體，前列腺素E 視網膜微血管內皮細胞 NLRP3炎癥小體

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20201028-00514

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目的觀察前列腺素E2（PGE2）4種受體（EP_1-4R）對高糖環境中人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）中炎癥小體活化和細胞損傷作用。方法將hRMEC分為正常組、高糖組，分別置于含5.5、30.0 mmol/L葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培養基中培養。采用流式細胞儀觀察高糖組、正常組的細胞凋亡率；酶鏈免疫吸附試驗（ELISA）檢測hRMEC細胞培養上清液中PGE2水平；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細胞環氧化酶2（COX2）、EP_1-4R的蛋白表達；實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測hRMEC中EP_1-4R mRNA的表達。高糖組細胞培養后72 h后，將其再分為對照組、PGE2組、EP_1-4R激動劑組、PGE2+EP_1-4R抑制劑組、二甲基亞砜組。根據組別，各組給予相應的激動劑或抑制劑繼續培養24 h。采用qRT-PCR檢測各組細胞核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白（NLRP3）、白細胞介素（IL）-1β前體（pro-IL-1β）mRNA的表達；ELISA檢測細胞培養上清液中IL-1β、乳酸脫氫酶（LDH）的含量；Western blot檢測各組細胞活化的半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-1蛋白表達。同時對高糖環境的hRMEC給予IL-1β刺激24 h，檢測其細胞培養上清液中LDH的活性。結果高糖組hRMEC細胞凋亡率、COX2蛋白表達、PGE2蛋白含量較正常組明顯升高，并呈時間依賴性。與正常組比較，高糖組hRMEC中EP₁R、EP₂R、EP₄R蛋白及mRNA表達水平較正常組升高（P＜0.05）。與對照組比較，PGE2組（t=4.627，P＜0.01）、EP_1-4R激動劑組（t=3.889、3.583、2.445、3.216，P＜0.05）hRMEC中NLRP3 mRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義；pro-IL-1β mRNA表達水平有所升高，但差異無統計學意義（PGE2組：t=1.807，P＞0.05；EP_1-4R激動劑組：t=1.807、1.477、0.302、1.926，P＞0.05）。與PGE2組比較，PGE2+EP₂R抑制劑組hRMEC中NLRP3 mRNA表達水平明顯降低，差異有統計學意義（t=2.812，P＜0.05）；PGE2+EP₃R抑制劑組hRMEC中pro-IL-1β mRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義（t=4.113，P＜0.01）。PGE2組、EP₁R激動劑組、EP₂R激動劑組細胞培養上清液中IL-1β的蛋白含量較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=5.155、4.136、4.817，P＜0.01）；PGE2+EP₂R抑制劑組和PGE2+EP₄R抑制劑組細胞培養上清液中IL-1β的蛋白含量較PGE2組明顯降低，差異有統計學意義（t=1.964、4.765，P＜0.05）。PGE2組和EP₂R激動劑組hRMEC中活化的Caspase-1蛋白表達較對照組明顯增多，差異有統計學意義（t=5.332、4.889，P＜0.05）；PGE2+EP₂R抑制劑組hRMEC中活化的Caspase-1蛋白表達較PGE2組明顯降低，差異有統計學意義（t=6.699，P＜0.01）。PGE2組和EP₂R激動劑組細胞培養上清液中LDH活性較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=4.908、4.225，P＜0.05）；PGE2+EP₂R抑制劑組細胞培養上清液中LDH活性較PGE2組明顯降低，差異有統計學意義（t=5.301，P＜0.01）。與對照組比較，高糖環境hRMEC細胞培養上清液中LDH活性明顯升高，差異有統計學意義（t=3.499，P＜0.05）。結論 PGE2的4種受體對NLRP3及其效應分子均有不同程度活化作用，其中EP₂R主要介導了高糖環境下hRMEC的損傷。

引用本文： 張忠紅, 姚勇, 謝田華, 吳美麗, 鄒健, 王曉露. 前列腺素E2受體對高糖環境中人視網膜微血管內皮細胞炎癥小體活化和細胞損傷作用. 中華眼底病雜志, 2021, 37(8): 623-631. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201028-00514 復制

目前認為糖尿病視網膜病變（DR）是免疫、微血管病變、神經變性、炎癥等多種因素相互作用的一個復雜過程，但其發病機制尚未完全闡明^[1]。已有研究表明，慢性炎癥在視網膜微血管內皮細胞（RMEC）的損傷和DR病程中起重要作用^[2]。炎癥小體是炎性免疫反應的核心，也是炎性反應的“調節器”和“感受器”^[3]。核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白（NLRP3）是目前研究最為廣泛的炎癥小體；前列腺素E2（PGE2）是經典的促炎因子。有研究表明，PGE2/PGE2受體1～4（EP_1-4R）信號通路參與調控NLRP3炎癥小體的激活，在炎癥、腫瘤生長過程和免疫性疾病中發揮重要作用^[4]。但關于高糖刺激下RMEC表面EP_1-4R的表達及其對NLRP3的活化作用、內皮細胞的損傷作用尚不清楚。為此，本研究觀察了PGE2對高糖環境中人RMEC（hRMEC）的炎癥小體活化和細胞損傷作用。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和分組

hRMEC細胞株（北京北納創聯生物技術研究院）。兔抗EP₁R、EP₂R、EP₃R多抗及EP₂R抑制劑AH6809、EP₃R激動劑Sulprostone、EP₄R激動劑Cay10598、EP₄R抑制劑AH23848、PGE2、人PGE2酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Cayman公司）；EP₁R激動劑17-PT-PGE2（愛必信上海生物科技有限公司）；EP₁R抑制劑SC-51322、EP₃R抑制劑L-798106（美國Santa Cruz公司）；EP₂R激動劑Butaprost（美國R&D Systems公司）；兔抗EP₄R多抗、環氧化酶2（COX2）抗體（美國Abcam公司）；半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）-1、Caspase-3（美國Cell Signaling公司）；白細胞介素（IL）-1β（美國Pepro Tech公司）；β-肌動蛋白（actin）抗體（美國Sigma-Aldrich公司）；人IL-1β ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（碧云天生物技術有限公司）。

將hRMEC分為正常組、高糖組，于37 ℃培養箱中培養。正常組的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM培養基）中含有5.5 mmol/L葡萄糖；高糖組DMEM培養基中加入30.0 mmol/L葡萄糖，孵育24、48、72 h。高糖組細胞培養72 h后再分為對照組、PGE2組、EP_1-4R激動劑組、PGE2+EP_1-4R抑制劑組、二甲基亞砜（DMSO）組。對照組不再給予處理；PGE2組和EP_1-4R激動劑組分別給予10 μmol/L的PGE2和EP₁R激動劑17-PT-PGE2、EP₂R激動劑Butaprost、EP₃R激動劑Sulprostone、EP₄R激動劑Cay10598孵育24 h；PGE2+EP_1-4R抑制劑組分別給予5 μmol/L EP₁R抑制劑SC-51322、EP₂R抑制劑AH6809、EP₃R抑制劑L-798106、EP₄R抑制劑AH23848預處理30 min后，再給予10 μmol/L PGE2處理24 h。DMSO組給予DMSO處理24 h。細胞在給予不同刺激前均換為不含胎牛血清的DMEM培養基饑餓12 h。

1.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中目的蛋白表達

細胞孵育到相應時間后，從培養箱中取出細胞置于冰上，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，裂解液充分裂解細胞，收集裂解液離心后測上清液中總蛋白濃度，每一樣品用裂解液補齊至同質同體積，加5倍上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中上樣電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。載有蛋白的膜在含有特異性一抗的抗體稀釋液中4 ℃孵育過夜；室溫孵二抗。化學發光液顯影、曝光。以β-actin、GAPDH作為內參。采用Image J圖像分析軟件檢測目的蛋白條帶灰度值。

1.3 免疫共沉淀檢測NLRP3和凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）的蛋白結合水平

提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，并將蛋白濃度調至2 μg/μl。加入對應的IgG和Protein A/G，4 ℃轉1 h，除去非特異性反應。吸取10%作為Input，將剩余蛋白液加入抗體NLRP3，4 ℃過夜。加入Protein A/G，4 ℃轉4 h。100 g，4 ℃條件下離心5 min，棄去上清液，用清洗緩沖液清洗珠子≥4次。加入1倍上樣煮蛋白，進行Western blot實驗。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測各組細胞中EP_1-4R、NLRP3、IL-1β前體（pro-IL-1β）的mRNA相對表達量

6孔板培養hRMEC，高糖處理hRMEC 2、8、12 h后取出細胞，PBS洗3次，總RNA用Trizol法提取。按PrimeScript^TMRT試劑盒說明書步驟建立反應體系，逆轉錄；參照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒步驟建立反應體系，設計基因擴增引物序列（表1）；反應條件：95 ℃預孵育10 min（1個循環），95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min（40個循環）。放入qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參，目的基因擴增產物的相對含量用2^?ΔΔCt計算。

表1 基因擴增引物序列

表選項

下載CSV

基因	正向引物（5'-3'）	反向引物（3'-5'）
人EP₁R	ATCATGGTGGTGTCGTGCAT	TACACCCAAGGGTCCAGGAT
人EP₂R	CAACCTCATCCGCATGCAC	CTCAAAGGTCAGCCTG
人EP₃R	CTTCGCATAACTGGGGCAAC	TATCCGTGTGTGTCTTGACG
人EP₄R	CATCTGCTCCATCCCGCT	GGATGGCCTGCAAATCTGG
人GAPDH	ATCACCATCTTCCAGGAGCG	CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG
人NLRP3	GGCAACACTCTCGGAGACAAG	GCTCTGGCTGGAGGTCAGAA
人IL-1β	AAACCTCTTCGAGGCACAAG	GTTTAGGGCCATCAGCTTCA
人Pro-IL-1β	TCTCCGTGTGTGTCTTGCAG	GTTTAGGGCCATCAGCTTCA
注：EP₁R：前列腺素E2（PGE2）受體1；EP₂R：PGE2受體2；EP₃R：PGE2受體3；EP₄R：PGE2受體4；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶；NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白；IL-1β：白細胞介素-1β；pro-IL-1β：IL-1β前體

1.5 流式細胞儀檢測各組hRMEC凋亡情況

用不含乙二胺四醋酸的0.25%胰蛋白酶消化細胞，至細胞可以被移液管或槍頭輕輕吹打下來時，終止消化并收集細胞到離心管內。1000×g離心3～5 min，沉淀細胞。小心吸除上清液，用4 ℃預冷的PBS重懸細胞，離心沉淀細胞；重復該操作1次。用去離子水按1∶3稀釋結合緩沖液。用250 μl結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1×10⁶個/ml。取100 μl細胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ/異硫氰酸熒光素和20 μg/ml的碘化丙啶溶液10 μl。混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應管中加400 μl PBS，流式細胞儀分析。

1.6 ELISA檢測hRMEC細胞培養上清液中PGE2、IL-1β蛋白含量

收集細胞培養上清液，超濾離心濃縮10倍，ELISA試劑盒中標準品按濃度梯度進行稀釋。照ELISA試劑盒說明書操作，測量450 nm波長處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。繪制標準曲線，計算樣品蛋白濃度，即每mg總蛋白中PGE2、IL-1β的含量。

1.7 LDH細胞毒性檢測

96孔板接種細胞并給予相應處理，按試劑盒說明配制所需溶液；細胞培養板離心后留沉淀，加入PBS稀釋的LDH試劑150 μl混勻，放在培養箱中孵育1 h，培養板再離心，每孔取120 μl到新96孔板；再各加60 μl LDH工作液，室溫避光30 min后測490、600 nm波長處A值，以后者A值作參考，繪制細胞毒性曲線并計算半致死量LD50，用于反應細胞凋亡或者壞死程度。同時，對高糖環境的hRMEC給予IL-1β刺激24 h，檢測其細胞培養上清液中LDH的活性。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism-5統計軟件行統計學分析。定量數據以均數±標準差（±s）表示。兩組數據比較采用t檢驗；多組間計量資料比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖促進COX2表達、PGE2產生及hRMEC凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示，高糖組細胞培養48、72 h，hRMEC凋亡率較正常組明顯升高（圖1，2）。

圖1 高糖組、正常組流式細胞儀檢測像。1A示正常組；1B～1D分別示高糖組細胞培養24、48、72 h。高糖組細胞培養48、72 h，hRMEC凋亡率較正常組明顯升高

圖選項

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