引用本文： 廖夢宇, 宋尹婷, 顏華. 增生型糖尿病視網膜病變玻璃體中微粒水平及其臨床意義. 中華眼底病雜志, 2021, 37(8): 610-616. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201221-00627 復制
增生型糖尿病視網膜病變（PDR）是糖尿病導致的視網膜微血管損害繼發新生血管生成從而引發的一系列眼部病變，是糖尿病患者最常見的微血管并發癥之一。隨著我國糖尿病發病率的持續升高，PDR已成為糖尿病患者視力喪失的最常見原因[1-2]。微粒是細胞凋亡或者受刺激后以出芽方式產生的直徑為100～1000 nm的細胞膜碎片。近年來隨著微粒在眼底疾病的研究不斷深入，多種細胞來源的微粒被證實在眼內起到促炎、促凝等生物學作用[3]。本研究擬通過對PDR患者玻璃體中微粒進行形態觀察和大小鑒定，并分別檢測PDR患者玻璃體中不同細胞來源微粒水平，初步探討其參與PDR的致病機制，為臨床干預措施的研究提供理論依據。現將結果報道如下。
1 對象和方法
病例對照研究。本研究經天津醫科大學總醫院倫理委員會審批（批準號：IRB2021-WZ-096）。遵循《赫爾辛基宣言》原則；患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2018年1～12月在天津醫科大學總醫院眼科確診并接受玻璃體切割手術（PPV）治療的PDR患者54例54只眼的玻璃體樣本（PDR組）納入本研究。選取同期行PPV治療的非DR患者20例20只眼的玻璃體樣本作為對照組。
參照糖尿病視網膜病變（DR）國際臨床分級標準[4]確立PDR的診斷標準。排除標準：（1）手術前視力無光感；（2）合并嚴重全身系統性疾病；（3）凝血功能異常、手術前使用抗凝藥物；（4）臨床資料或輔助檢查記錄不完整；（5）既往曾接受過內眼手術；（6）合并有眼外傷、眼腫瘤或其他視網膜疾病。除上述6條排除標準外，PDR組還包括：（1）既往曾接受玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療；（2）存在黃斑前膜、黃斑水腫、黃斑部牽拉等。對照組同時排除糖尿病或血糖異常者。
患眼均行視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相、B型超聲、光相干斷層掃描檢查等。手術當日行空腹血糖和血壓檢查。采用Snellen視力表行視力檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。
PDR組54只眼中，玻璃體積血（VH）42只眼（77.8%，42/54），牽拉性視網膜脫離（TRD）21只眼（38.9%，21/54）。既往接受抗VEGF藥物治療17只眼（31.5%，17/54）。對照組20只眼中，特發性黃斑裂孔、特發性黃斑前膜、玻璃體黃斑牽拉綜合征、晶狀體完全脫位分別為6、6、2、6只眼。兩組患者年齡、性別構成比、眼別、血壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；空腹血糖比較，差異有統計學意義（t=2.200，P=0.031）（表1）。PDR組患眼手術前后logMAR視力分別為1.68±0.59、1.14±0.64；手術前后logMAR視力比較，差異有統計學意義（t=20.033，P＜0.001）。對照組患眼手術前后logMAR視力分別為1.17±0.74、0.81±0.63；手術前后logMAR視力比較，差異無統計學意義（t=1.636，P=0.110）。
表1
PDR組、對照組患者基線資料比較
PDR組依據PDR分期、是否發生TRD分為增生早、中期未合并TRD組（未合并TRD組）、增生晚期合并TRD組（合并TRD組），分別為33、21只眼。依據有無VH分為伴VH組、不伴VH組，分別為42、12只眼。根據PPV前3 d是否行抗VEGF藥物分為抗VEGF藥物治療組、未行抗VEGF藥物治療組，分別為17、37只眼。
所有手術均采用非接觸廣角鏡觀察系統輔助下23G聯合25G經睫狀體平坦部PPV，手術均由同一名手術者操作完成。未開放灌注通道前應用玻璃體切割頭切割并抽吸玻璃體腔中央部位玻璃體0.3 ml，立即轉移至1.5 ml無菌凍存管，－80 ℃保存。
玻璃體微粒樣品初步制備參照文獻[5]的密度梯度離心法進行。將微粒樣品滴加到碳膜包被的金屬微柵，磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡（HT7700，日本HITACHI公司）下進行形態學觀察；將吸取微粒樣品的無菌注射器連接馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300（英國Malvern Panalytical公司）循環系統，得到粒徑分布范圍。采用流式細胞儀（美國BD公司）檢測玻璃體樣本中視網膜光感受器細胞來源的微粒（RMP）、血小板來源的微粒（PMP）、內皮細胞來源的微粒（EMP）和膜表面表達磷脂酰絲氨酸（PS）微粒（PS-MP）的水平。利用Megamix標準磁珠（法國BioCytex公司）和ACURFP-38-5標準計數磁珠（美國Spherotech公司）建立流式細胞檢測模板，以異硫氰酸熒光素-花生凝集素（PNA）+為RMP，別藻青蛋白-CD62p+為PMP，藻紅蛋白（PE）/cy7-CD31+為EMP、PE-AnnexinV+為PS-MP。
采用SPSS 23.0軟件行統計學分析。所有數據經正態性檢驗均符合正態性，以均數±標準差（
±s）表示；兩組樣本間比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析。非正態分布資料的數據以中位數（范圍）表示；組間比較采用Mann-Whitney非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，微粒形態呈經典橢圓形囊泡狀，具有完整的雙層膜結構，內含少量胞質成分（圖1A）。納米顆粒跟蹤分析技術報告，玻璃體微粒粒徑大小為119～691 nm，平均粒徑175.0 nm，中位數144.4 nm（圖1B）。符合玻璃體微粒粒徑100～1000 nm范圍。
圖1
增生型糖尿病視網膜病變患眼玻璃體微粒透射電子顯微鏡像及納米顆粒跟蹤分析圖。1A示微粒形態呈具有完整雙層膜的囊泡狀結構 磷鎢酸 標尺：200 nm；1B示納米顆粒跟蹤分析圖，微粒粒徑大小為119～691 nm
流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，PDR組患眼玻璃體中RMP水平顯著降低，EMP、PMP水平顯著升高，差異均有統計學意義（t=?2.361、5.064、3.531，P=0.018、＜0.001、0.001）；兩組患眼玻璃體中PS-MP水平比較，差異無統計學意義（t=?1.617，P=0.110）（圖2）。PDR組、對照組患眼玻璃體中豐度最高的微粒類型均為RMP（表2）。抗VEGF藥物組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于未行抗VEGF藥物組；未合并TRD組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于合并TRD組；伴VH組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于不伴VH組（表3）。
圖2
PDR組（n=54）、對照組（ n=20）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
表2
PDR組、對照組患眼玻璃體中微粒水平比較[M（范圍），個/μl]
表3
PDR組不同手術指征患眼玻璃體中微粒水平比較[M（范圍），個/μl]
與未合并TRD組比較，合并TRD組患眼玻璃體中4種類型微粒水平均有升高趨勢，其中，EMP、PS-MP差異無統計學意義（t=?0.122、?1.335，P=0.903、0.188），RMP、PMP差異有統計學意義（t=?2.221、?2.098，P=0.031、0.041）（圖3）。
圖3
未合并TRD組（n=3）、合并TDR組（n=21）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。TDR：牽拉性視網膜脫離；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平顯著低于未行抗VEGF藥物治療組，但仍高于對照組，差異有統計學意義（Z=?2.430、?2.499，P=0.015、0.012），RMP、PMP、PS-MP差異無統計學意義（Z=?0.028、?0.233、?0.326、?1.211、1.923、?0.976，P=0.978、0.816、0.744、0.234、0.072、0.336）（圖4）。
圖4
抗VEGF藥物治療組（n=17）、未行抗VEGF藥物治療組（n=37）、對照組（n=20）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。4A示抗VEGF藥物治療組、未行抗VEGF藥物治療組比較；4B示抗VEGF藥物治療組、對照組比較。*P＜0.05。VEGF：血管內皮生長因子；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
不伴VH組患眼玻璃體中PMP水平顯著高于伴VH組，差異有統計學意義（t=－3.097，P=0.003）；兩組患眼玻璃體中RMP、EMP、PS-MP比較，差異無統計學意義（t=－1.211、－0.145、－1.210，P=0.231、0.885、0.249）（圖5）。
圖5
伴VH組、不伴VH組患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。VH：玻璃體積血；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
3 討論
微粒是細胞外囊泡的一種，最早由Wolf[6]在1967年發現的存在于激活的血小板周圍，具有促凝活性的“微塵樣”物質。本研究將制備得到的樣品置于透射電子鏡顯微鏡下，發現微粒呈具有完整雙層膜結構的囊泡狀，符合微粒形態學鑒定標準。通過納米顆粒追蹤分析技術，發現制備的微粒樣品粒徑大小并非均勻分布于100～1000 nm范圍，而是集中分布于100～500 nm范圍。由此，證實玻璃體標本中含有大量微粒，可以用于進一步臨床研究。
PDR發病機制被認為主要是視網膜微血管受損和病理性新生血管形成[7]。本研究結果顯示，PDR組患眼玻璃體中，與血管功能密切相關的EMP和PMP水平顯著高于對照組，結果與糖尿病患者循環中微粒研究結果一致。一項納入48項研究的meta分析結果顯示，糖尿病患者循環中總微粒、PMP、EMP水平顯著升高[8]。有學者提出，EMP和PMP水平增高觸發人體內的組織因子，激活絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶C信號通路而直接作用于眼部血管生成是DR發病機制之一[9-10]。本研究結果顯示，唯一眼源性的RMP在PDR組患眼玻璃體中的檢出水平顯著低于對照組，結果與Chahed等[11]既往關于PDR的微粒研究結論不一致。其可能的原因是本研究納入的對照組患者排除了視網膜血管疾病，而導致最終多為黃斑疾病患者。黃斑區是視網膜視力最敏銳部位，當受到牽拉、產生裂孔時往往導致大量光感受器細胞損傷[12-14]，可能是導致大量RMP釋放的原因。另有6例晶狀體完全脫位患者也僅排除了出血性損害，由于重力因素晶狀體硬核脫入玻璃體腔時也可能對視網膜產生沖撞導致類似外傷損害，使得視網膜視錐、視桿細胞層受累。
既往對微粒的定義是粒徑100～1000 nm且具有膜表面PS外翻結構的囊泡。但近期研究認為PS并不是表達于所有微粒表面，其表達量可以因微粒來源細胞不同、細胞刺激形式不同或PS形成機制不同而各有差異[15-20]。目前認為存在PS陰性的微粒，可能是因為某些微粒表面PS表達量過低，導致較能夠正常被檢測出的PS閾值還低[21]。本研究結果顯示，PDR組和對照組均檢測出PS陽性的微粒。但與在其他體液標本中的微粒研究不同[22]，玻璃體中PS陽性的微粒并不是含量最豐富的一種，這種現象與Tumahai等[23]、Chahed等[11]關于玻璃體微粒的研究結果一致。
本研究還揭示了隨PDR加重，因細胞刺激或凋亡所產生的微粒水平持續升高。PDR患者隨病情嚴重程度增加，玻璃體中EMP、PMP、RMP和PS-MP水平均有不同程度升高，與血管功能密切相關的EMP和PMP升高最顯著。隨糖尿病病程進展，PDR患者視網膜微血管損害不斷加重的同時，病理性新生血管反復破裂出血，再機化吸收，局部代償性增生形成纖維血管膜，長入玻璃體與視網膜之間潛在腔隙，更容易破裂出血，且不斷牽拉視網膜。視網膜脫離往往造成大量光感受器細胞損傷，細胞損傷后以出芽的形式產生更多的RMP，結果與Tumahai等[23]對孔源性視網膜脫離的RMP研究結果一致。
眼內注射抗VEGF藥物具有快速消退新生血管的作用，PPV前3 d玻璃體腔注射抗VEGF藥物被證實可以顯著減少PDR患者手術中出血和手術后再出血風險，并能有效縮短手術時間，還可能減少手術中醫源性視網膜裂孔的發生[24-26]。本研究結果顯示，抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平顯著降低。Munster等[27]發現，抗VEGF藥物可以阻斷腫瘤細胞來源的微粒誘導的促血管生成過程，這或許解釋了抗VEGF藥物降低玻璃體中EMP水平的機制。既往研究證實，糖尿病患者PS-MP水平顯著升高，其調節各種生長因子和趨化因子的表達上調，或激活細胞信號通路而直接參與眼內血管生成過程[9-10]。這說明抗VEGF藥物也可能是通過抑制EMP而抑制視網膜新生血管。我們還發現，抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平仍然較對照組升高，這說明抗VEGF藥物不能將EMP降至正常水平。其原因可能是因為PDR對視網膜微血管的損傷嚴重，玻璃體腔注射抗VEGF藥物仍然不能在短時間內完全修復受損的視網膜。
VH是PDR患者常見并發癥，主要原因是玻璃體視網膜界面的增生性病變牽拉病理性新生血管或視網膜血管的破裂出血[2]。本研究結果顯示，不伴VH組患眼玻璃體中PMP水平顯著高于伴VH組，且PS-MP也有升高趨勢。其可能原因是PDR患者視網膜血管受到損傷出血時，血小板受刺激釋放的微粒在病變部位聚集黏附，不伴VH組患眼的血管已經閉塞，損傷更嚴重，玻璃體腔內大量PMP被檢出。伴VH組患眼，由于玻璃體視網膜增生的病變組織對病理性新生血管或視網膜血管牽拉從而導致VH，此時視網膜新生血管活躍，或視網膜血管尚未閉塞，血管損傷程度較之閉塞血管更輕，PMP水平也更低。早期研究報道，PMP膜表面的促凝活性是活化血小板表面的50～100倍[28]。血小板促凝反應機制是為凝血酶的形成提供一個催化表面，當細胞受到刺激導致PS流出時，攜帶其來源細胞的膜成分和少量胞質的微粒脫落后也具備促凝活性[29]。糖尿病腎病也是糖尿病嚴重微血管并發癥。Yu等[30]研究發現，PS-MP在糖尿病腎病中起促凝作用，抑制微粒可能成為預防糖尿病腎病患者血栓形成和病變加重的新型治療手段。因此，我們推測PMP可能是通過增加PS的暴露而在PDR VH機制中起到一定調節作用。
眾多疾病研究已證實，微粒水平可以評估病變嚴重程度及預測并發癥風險[31-33]。然而，PDR手術治療后效果與手術操作關系更為密切，微粒對預測手術后并發癥的可信度尚未知。未來將進一步探討PDR患者玻璃體中微粒水平在手術治療前后的變化，以期探討微粒與視網膜結構及功能之間的關系。
增生型糖尿病視網膜病變（PDR）是糖尿病導致的視網膜微血管損害繼發新生血管生成從而引發的一系列眼部病變，是糖尿病患者最常見的微血管并發癥之一。隨著我國糖尿病發病率的持續升高，PDR已成為糖尿病患者視力喪失的最常見原因[1-2]。微粒是細胞凋亡或者受刺激后以出芽方式產生的直徑為100～1000 nm的細胞膜碎片。近年來隨著微粒在眼底疾病的研究不斷深入，多種細胞來源的微粒被證實在眼內起到促炎、促凝等生物學作用[3]。本研究擬通過對PDR患者玻璃體中微粒進行形態觀察和大小鑒定，并分別檢測PDR患者玻璃體中不同細胞來源微粒水平，初步探討其參與PDR的致病機制，為臨床干預措施的研究提供理論依據。現將結果報道如下。
1 對象和方法
病例對照研究。本研究經天津醫科大學總醫院倫理委員會審批（批準號：IRB2021-WZ-096）。遵循《赫爾辛基宣言》原則；患者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2018年1～12月在天津醫科大學總醫院眼科確診并接受玻璃體切割手術（PPV）治療的PDR患者54例54只眼的玻璃體樣本（PDR組）納入本研究。選取同期行PPV治療的非DR患者20例20只眼的玻璃體樣本作為對照組。
參照糖尿病視網膜病變（DR）國際臨床分級標準[4]確立PDR的診斷標準。排除標準：（1）手術前視力無光感；（2）合并嚴重全身系統性疾病；（3）凝血功能異常、手術前使用抗凝藥物；（4）臨床資料或輔助檢查記錄不完整；（5）既往曾接受過內眼手術；（6）合并有眼外傷、眼腫瘤或其他視網膜疾病。除上述6條排除標準外，PDR組還包括：（1）既往曾接受玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物治療；（2）存在黃斑前膜、黃斑水腫、黃斑部牽拉等。對照組同時排除糖尿病或血糖異常者。
患眼均行視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相、B型超聲、光相干斷層掃描檢查等。手術當日行空腹血糖和血壓檢查。采用Snellen視力表行視力檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。
PDR組54只眼中，玻璃體積血（VH）42只眼（77.8%，42/54），牽拉性視網膜脫離（TRD）21只眼（38.9%，21/54）。既往接受抗VEGF藥物治療17只眼（31.5%，17/54）。對照組20只眼中，特發性黃斑裂孔、特發性黃斑前膜、玻璃體黃斑牽拉綜合征、晶狀體完全脫位分別為6、6、2、6只眼。兩組患者年齡、性別構成比、眼別、血壓比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；空腹血糖比較，差異有統計學意義（t=2.200，P=0.031）（表1）。PDR組患眼手術前后logMAR視力分別為1.68±0.59、1.14±0.64；手術前后logMAR視力比較，差異有統計學意義（t=20.033，P＜0.001）。對照組患眼手術前后logMAR視力分別為1.17±0.74、0.81±0.63；手術前后logMAR視力比較，差異無統計學意義（t=1.636，P=0.110）。
表1
PDR組、對照組患者基線資料比較
PDR組依據PDR分期、是否發生TRD分為增生早、中期未合并TRD組（未合并TRD組）、增生晚期合并TRD組（合并TRD組），分別為33、21只眼。依據有無VH分為伴VH組、不伴VH組，分別為42、12只眼。根據PPV前3 d是否行抗VEGF藥物分為抗VEGF藥物治療組、未行抗VEGF藥物治療組，分別為17、37只眼。
所有手術均采用非接觸廣角鏡觀察系統輔助下23G聯合25G經睫狀體平坦部PPV，手術均由同一名手術者操作完成。未開放灌注通道前應用玻璃體切割頭切割并抽吸玻璃體腔中央部位玻璃體0.3 ml，立即轉移至1.5 ml無菌凍存管，－80 ℃保存。
玻璃體微粒樣品初步制備參照文獻[5]的密度梯度離心法進行。將微粒樣品滴加到碳膜包被的金屬微柵，磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡（HT7700，日本HITACHI公司）下進行形態學觀察；將吸取微粒樣品的無菌注射器連接馬爾文納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300（英國Malvern Panalytical公司）循環系統，得到粒徑分布范圍。采用流式細胞儀（美國BD公司）檢測玻璃體樣本中視網膜光感受器細胞來源的微粒（RMP）、血小板來源的微粒（PMP）、內皮細胞來源的微粒（EMP）和膜表面表達磷脂酰絲氨酸（PS）微粒（PS-MP）的水平。利用Megamix標準磁珠（法國BioCytex公司）和ACURFP-38-5標準計數磁珠（美國Spherotech公司）建立流式細胞檢測模板，以異硫氰酸熒光素-花生凝集素（PNA）+為RMP，別藻青蛋白-CD62p+為PMP，藻紅蛋白（PE）/cy7-CD31+為EMP、PE-AnnexinV+為PS-MP。
采用SPSS 23.0軟件行統計學分析。所有數據經正態性檢驗均符合正態性，以均數±標準差（±s）表示；兩組樣本間比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析。非正態分布資料的數據以中位數（范圍）表示；組間比較采用Mann-Whitney非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，微粒形態呈經典橢圓形囊泡狀，具有完整的雙層膜結構，內含少量胞質成分（圖1A）。納米顆粒跟蹤分析技術報告，玻璃體微粒粒徑大小為119～691 nm，平均粒徑175.0 nm，中位數144.4 nm（圖1B）。符合玻璃體微粒粒徑100～1000 nm范圍。
圖1
增生型糖尿病視網膜病變患眼玻璃體微粒透射電子顯微鏡像及納米顆粒跟蹤分析圖。1A示微粒形態呈具有完整雙層膜的囊泡狀結構 磷鎢酸 標尺：200 nm；1B示納米顆粒跟蹤分析圖，微粒粒徑大小為119～691 nm
流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組比較，PDR組患眼玻璃體中RMP水平顯著降低，EMP、PMP水平顯著升高，差異均有統計學意義（t=?2.361、5.064、3.531，P=0.018、＜0.001、0.001）；兩組患眼玻璃體中PS-MP水平比較，差異無統計學意義（t=?1.617，P=0.110）（圖2）。PDR組、對照組患眼玻璃體中豐度最高的微粒類型均為RMP（表2）。抗VEGF藥物組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于未行抗VEGF藥物組；未合并TRD組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于合并TRD組；伴VH組患眼玻璃體中不同類型微粒水平均低于不伴VH組（表3）。
圖2
PDR組（n=54）、對照組（ n=20）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。PDR：增生型糖尿病視網膜病變；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
表2
PDR組、對照組患眼玻璃體中微粒水平比較[M（范圍），個/μl]
表3
PDR組不同手術指征患眼玻璃體中微粒水平比較[M（范圍），個/μl]
與未合并TRD組比較，合并TRD組患眼玻璃體中4種類型微粒水平均有升高趨勢，其中，EMP、PS-MP差異無統計學意義（t=?0.122、?1.335，P=0.903、0.188），RMP、PMP差異有統計學意義（t=?2.221、?2.098，P=0.031、0.041）（圖3）。
圖3
未合并TRD組（n=3）、合并TDR組（n=21）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。TDR：牽拉性視網膜脫離；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平顯著低于未行抗VEGF藥物治療組，但仍高于對照組，差異有統計學意義（Z=?2.430、?2.499，P=0.015、0.012），RMP、PMP、PS-MP差異無統計學意義（Z=?0.028、?0.233、?0.326、?1.211、1.923、?0.976，P=0.978、0.816、0.744、0.234、0.072、0.336）（圖4）。
圖4
抗VEGF藥物治療組（n=17）、未行抗VEGF藥物治療組（n=37）、對照組（n=20）患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。4A示抗VEGF藥物治療組、未行抗VEGF藥物治療組比較；4B示抗VEGF藥物治療組、對照組比較。*P＜0.05。VEGF：血管內皮生長因子；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
不伴VH組患眼玻璃體中PMP水平顯著高于伴VH組，差異有統計學意義（t=－3.097，P=0.003）；兩組患眼玻璃體中RMP、EMP、PS-MP比較，差異無統計學意義（t=－1.211、－0.145、－1.210，P=0.231、0.885、0.249）（圖5）。
圖5
伴VH組、不伴VH組患眼玻璃體中不同類型微粒水平比較。*P＜0.05。VH：玻璃體積血；RMP：視網膜光感受器細胞來源的微粒；EMP：內皮細胞來源的微粒；PMP：血小板來源的微粒；PS-MP：膜表面表達磷脂酰絲氨酸微粒
3 討論
微粒是細胞外囊泡的一種，最早由Wolf[6]在1967年發現的存在于激活的血小板周圍，具有促凝活性的“微塵樣”物質。本研究將制備得到的樣品置于透射電子鏡顯微鏡下，發現微粒呈具有完整雙層膜結構的囊泡狀，符合微粒形態學鑒定標準。通過納米顆粒追蹤分析技術，發現制備的微粒樣品粒徑大小并非均勻分布于100～1000 nm范圍，而是集中分布于100～500 nm范圍。由此，證實玻璃體標本中含有大量微粒，可以用于進一步臨床研究。
PDR發病機制被認為主要是視網膜微血管受損和病理性新生血管形成[7]。本研究結果顯示，PDR組患眼玻璃體中，與血管功能密切相關的EMP和PMP水平顯著高于對照組，結果與糖尿病患者循環中微粒研究結果一致。一項納入48項研究的meta分析結果顯示，糖尿病患者循環中總微粒、PMP、EMP水平顯著升高[8]。有學者提出，EMP和PMP水平增高觸發人體內的組織因子，激活絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶C信號通路而直接作用于眼部血管生成是DR發病機制之一[9-10]。本研究結果顯示，唯一眼源性的RMP在PDR組患眼玻璃體中的檢出水平顯著低于對照組，結果與Chahed等[11]既往關于PDR的微粒研究結論不一致。其可能的原因是本研究納入的對照組患者排除了視網膜血管疾病，而導致最終多為黃斑疾病患者。黃斑區是視網膜視力最敏銳部位，當受到牽拉、產生裂孔時往往導致大量光感受器細胞損傷[12-14]，可能是導致大量RMP釋放的原因。另有6例晶狀體完全脫位患者也僅排除了出血性損害，由于重力因素晶狀體硬核脫入玻璃體腔時也可能對視網膜產生沖撞導致類似外傷損害，使得視網膜視錐、視桿細胞層受累。
既往對微粒的定義是粒徑100～1000 nm且具有膜表面PS外翻結構的囊泡。但近期研究認為PS并不是表達于所有微粒表面，其表達量可以因微粒來源細胞不同、細胞刺激形式不同或PS形成機制不同而各有差異[15-20]。目前認為存在PS陰性的微粒，可能是因為某些微粒表面PS表達量過低，導致較能夠正常被檢測出的PS閾值還低[21]。本研究結果顯示，PDR組和對照組均檢測出PS陽性的微粒。但與在其他體液標本中的微粒研究不同[22]，玻璃體中PS陽性的微粒并不是含量最豐富的一種，這種現象與Tumahai等[23]、Chahed等[11]關于玻璃體微粒的研究結果一致。
本研究還揭示了隨PDR加重，因細胞刺激或凋亡所產生的微粒水平持續升高。PDR患者隨病情嚴重程度增加，玻璃體中EMP、PMP、RMP和PS-MP水平均有不同程度升高，與血管功能密切相關的EMP和PMP升高最顯著。隨糖尿病病程進展，PDR患者視網膜微血管損害不斷加重的同時，病理性新生血管反復破裂出血，再機化吸收，局部代償性增生形成纖維血管膜，長入玻璃體與視網膜之間潛在腔隙，更容易破裂出血，且不斷牽拉視網膜。視網膜脫離往往造成大量光感受器細胞損傷，細胞損傷后以出芽的形式產生更多的RMP，結果與Tumahai等[23]對孔源性視網膜脫離的RMP研究結果一致。
眼內注射抗VEGF藥物具有快速消退新生血管的作用，PPV前3 d玻璃體腔注射抗VEGF藥物被證實可以顯著減少PDR患者手術中出血和手術后再出血風險，并能有效縮短手術時間，還可能減少手術中醫源性視網膜裂孔的發生[24-26]。本研究結果顯示，抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平顯著降低。Munster等[27]發現，抗VEGF藥物可以阻斷腫瘤細胞來源的微粒誘導的促血管生成過程，這或許解釋了抗VEGF藥物降低玻璃體中EMP水平的機制。既往研究證實，糖尿病患者PS-MP水平顯著升高，其調節各種生長因子和趨化因子的表達上調，或激活細胞信號通路而直接參與眼內血管生成過程[9-10]。這說明抗VEGF藥物也可能是通過抑制EMP而抑制視網膜新生血管。我們還發現，抗VEGF藥物治療組患眼玻璃體中EMP水平仍然較對照組升高，這說明抗VEGF藥物不能將EMP降至正常水平。其原因可能是因為PDR對視網膜微血管的損傷嚴重，玻璃體腔注射抗VEGF藥物仍然不能在短時間內完全修復受損的視網膜。
VH是PDR患者常見并發癥，主要原因是玻璃體視網膜界面的增生性病變牽拉病理性新生血管或視網膜血管的破裂出血[2]。本研究結果顯示，不伴VH組患眼玻璃體中PMP水平顯著高于伴VH組，且PS-MP也有升高趨勢。其可能原因是PDR患者視網膜血管受到損傷出血時，血小板受刺激釋放的微粒在病變部位聚集黏附，不伴VH組患眼的血管已經閉塞，損傷更嚴重，玻璃體腔內大量PMP被檢出。伴VH組患眼，由于玻璃體視網膜增生的病變組織對病理性新生血管或視網膜血管牽拉從而導致VH，此時視網膜新生血管活躍，或視網膜血管尚未閉塞，血管損傷程度較之閉塞血管更輕，PMP水平也更低。早期研究報道，PMP膜表面的促凝活性是活化血小板表面的50～100倍[28]。血小板促凝反應機制是為凝血酶的形成提供一個催化表面，當細胞受到刺激導致PS流出時，攜帶其來源細胞的膜成分和少量胞質的微粒脫落后也具備促凝活性[29]。糖尿病腎病也是糖尿病嚴重微血管并發癥。Yu等[30]研究發現，PS-MP在糖尿病腎病中起促凝作用，抑制微粒可能成為預防糖尿病腎病患者血栓形成和病變加重的新型治療手段。因此，我們推測PMP可能是通過增加PS的暴露而在PDR VH機制中起到一定調節作用。
眾多疾病研究已證實，微粒水平可以評估病變嚴重程度及預測并發癥風險[31-33]。然而，PDR手術治療后效果與手術操作關系更為密切，微粒對預測手術后并發癥的可信度尚未知。未來將進一步探討PDR患者玻璃體中微粒水平在手術治療前后的變化，以期探討微粒與視網膜結構及功能之間的關系。
