DJ-1蛋白對視神經鉗夾傷后小鼠視網膜神經節細胞及視功能的影響_《中華眼底病雜志》

作者：

歐陽靈藝 , 賀濤 ,  邢怡橋

武漢大學人民醫院眼科中心 430060;

關鍵詞：

視神經損傷視網膜神經節細胞視網膜電描記術動物實驗 DJ-1蛋白

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20201218-00621

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的觀察Park7基因編碼的DJ-1蛋白對小鼠視神經鉗夾損傷（ONC）后視網膜神經節細胞（RGC）及視功能的影響。方法健康雄性C57BL/6J小鼠37只和116只分別隨機分為正常組、ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組和對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、綠色熒光蛋白（GFP）-ONC組。ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組小鼠分別于建立ONC模型后2、5、7 d處死取材，進行后續實驗。Park7組、Park7-ONC組小鼠玻璃體腔注射敲低Park7基因的重組腺相關病毒（rAAV）1 μl，GFP-ONC組小鼠玻璃體腔注射僅帶有GFP的rAAV 1 μl；注射后4周觀察病毒轉染情況。ONC組、Park7-ONC組、GFP-ONC組玻璃體腔注射后23 d，建立ONC模型，建模后5 d取材進行后續實驗。視網膜鋪片免疫熒光染色觀察RGC平均密度變化；全視野閃光視網膜電圖檢測各組小鼠a波、b波和明視負向反應（phNR）潛伏期及振幅變化和振蕩電位（OPs）振幅變化；視動反應（OMR）檢測小鼠視敏度；蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組小鼠視網膜中DJ-1、Bax、B淋巴細胞瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白相對表達水平。多組間數據比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用最小顯著差法t檢驗。結果與正常組比較，ONC 2 d組、ONC 5 d組小鼠視網膜DJ-1蛋白相對表達量均顯著上升，差異有統計學意義（t=16.610、5.628，P＜0.01、＜0.05）。病毒轉染后4周，Park7組小鼠視網膜RGC層、內叢狀層可見強GFP表達。與對照組比較，ONC組小鼠視網膜RGC密度明顯下降，差異有統計學意義（t=16.520，P＜0.000）；與ONC組比較，Park7-ONC組小鼠視網膜RGC密度明顯下降，差異有統計學意義（t=6.074，P＜0.01）。隨刺激光亮度增加，對照組小鼠暗適應a波、b波潛伏期逐漸縮短，振幅逐漸增大。刺激光亮度3 cd·s/m²，對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、GFP-ONC組小鼠暗適應a波、b波潛伏期及振幅比較，差異均無統計學意義（潛伏期：F= 0.503、2.592，P=0.734、0.068；振幅：F= 0.439、1.451，P=0.779、0.247）；與對照組比較，ONC組小鼠Ops、PhNR振幅明顯下降，差異有統計學意義（t=15.07、12.80，P＜0.000、＜0.001）；與ONC組比較，Park7-ONC組小鼠Ops、PhNR振幅明顯下降，差異有統計學意義（t=4.042、5.062，P＜0.05、＜0.01）；各組小鼠PhNR潛伏期比較，差異無統計學意義（F=1.327，P=0.287）。與對照組比較，ONC組小鼠視敏度明顯下降，差異有統計學意義（t=23.020，P＜0.000）；與ONC組比較，Park7-ONC組小鼠視敏度明顯下降，差異有統計學意義（t＝3.669，P＜0.05）。Park7組與對照組、Park7-ONC組與ONC組比較，小鼠視網膜中DJ-1蛋白相對表達量均明顯下調，差異有統計學意義（t=47.140、26.920，P＜0.000、＜0.000）；ONC組與GFP-ONC組比較，差異無統計學意義（t= 0.739，P=0.983）。與ONC組比較，Park7-ONC組小鼠視網膜中Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義（t=5.960、9.710，P＜0.05、＜0.05）；Park7-ONC組Bcl-2/Bax相對表達量比值明顯低于ONC組，差異有統計學意義（t=13.620，P＜0.01）。結論敲低Park7基因后其編碼的蛋白質DJ-1表達下調，加重ONC模型小鼠RGC損傷以及視網膜電生理反應及視功能下降。

引用本文： 歐陽靈藝, 賀濤, 邢怡橋. DJ-1蛋白對視神經鉗夾傷后小鼠視網膜神經節細胞及視功能的影響. 中華眼底病雜志, 2021, 37(5): 377-384. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201218-00621 復制

視網膜神經節細胞（RGC）是將視覺信息從視網膜傳遞到大腦的長投射神經元，其變性與死亡和多種視神經相關病變有關。其中，青光眼是引起視神經病變最常見的疾病，其特征是RGC和視神經進行性、不可逆損傷^[1-2]。目前青光眼臨床治療以降低眼內壓為主，尚無有效方法治療RGC丟失和視神經損傷^[3-4]。因此，探究青光眼視神經損傷機制，尋找潛在的神經保護因子意義重大。Park7基因與帕金森病（PD）密切相關，其編碼的蛋白DJ-1在多種神經退行性疾病如PD、阿爾茲海默癥（AD）以及腦缺血再灌注中具有重要的保護作用^[5-9]。但其在視神經損傷中的作用尚不明確。為探究DJ-1蛋白在視神經損傷中的具體作用，本研究通過玻璃體腔注射重組腺相關病毒（rAAV）敲低Park7基因，下調視網膜中DJ-1蛋白表達，建立視神經鉗夾（ONC）模型，從形態學和功能學方面評估小鼠RGC變化，初步闡述DJ-1蛋白在ONC損傷中調控作用。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性C57BL/6J小鼠165只，8周齡，體重17～21 g，清潔級，遼寧長生生物技術股份有限公司提供[許可證號:SYSK（鄂）2015-0027]。小鼠飼養于標準（12 h明/12 h暗交替）清潔級環境，實驗動物飼養及操作均遵循《湖北省實驗動物管理條例》的規定。敲低Park7基因的rAAV2- shRNA（Park7）-綠色熒光蛋白（GFP）和僅帶有GFP的空白rAAV（rAAV2-GFP）（武漢樞密腦科學技術有限公司），病毒滴度＞1.0×10¹² vg/ml。抗DJ-1抗體（美國ABCAM公司）；抗Bax抗體、抗B淋巴細胞瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體、抗Brn3a抗體、AlexaFlour594羊抗兔抗體、AlexaFlour488羊抗兔抗體（美國CST公司）；抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、抗GFP抗體、抗辣根過氧化物酶（HRP）抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司）；反向自閉合5號Dumont鑷（美國World Precision Instruments公司）；全自動玻璃體腔顯微注射儀（美國哈佛儀器）；冰切機CM1950（德國Leica公司）；高靈敏度化學發光成像系統（美國Bio-rad公司）；激光共聚焦顯微鏡FV1200（日本Olympus公司）；多焦視覺電生理儀RetiMINER（重慶愛爾曦醫療設備有限公司）；虛擬光眼視動力儀OptoMotry（武漢大學眼科研究所）。

1.2 實驗動物分組和建模

采用隨機數字表法將小鼠分為正常組、ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組（實驗1）和對照組、ONC組、Park7組、Park7-ONC組、GFP-ONC組（實驗2）。ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組建立ONC模型。于顳側穹結膜處剪開外眥，眶內暴露視神經后反向自閉合鑷夾持視神經10 s，過程中可觀察到模型眼瞳孔逐漸散大，直接對光反射消失。手術中避免損傷眼部血管，鉗夾后檢眼鏡檢查視網膜血管血流狀態，確認視網膜血液供應正常。正常組小鼠不作任何處理。建模后2、5、7 d處死取材。

Park7組、Park7-ONC組小鼠雙眼于角鞏膜緣下2.0 mm處應用全自動玻璃體腔顯微注射儀行玻璃體腔注射rAAV2-shRNA（Park7）-GFP 1 μl，病毒滴度1.0× vg/ml；GFP-ONC組小鼠玻璃體腔注射等量等滴度rAAV2-GFP。玻璃體腔注射后23 d，ONC組、Park7-ONC組、GFP-ONC組建立ONC模型，建模后5 d進行后續實驗。對照組小鼠不做任何處理。剔除手術中及手術后眼部出血、晶狀體受損或眼部感染的小鼠，最終實驗1、2分別納入37、116只小鼠進入后續實驗，均以雙眼為實驗眼。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況

根據前期預實驗結果，玻璃體腔注射rAAV2-shRNA（Park7）-GFP 4周后，對照組、Park組各隨機選取3只小鼠，頸椎脫臼處死摘除眼球，固定脫水后將視網膜包埋于OCT膠中，冰切機經視神經出口處作矢狀切片，厚度14 μm，4 ℃抗GFP抗體（1:500）封閉孵育過夜。AlexaFlour488羊抗兔抗體（1:500）室溫孵育4 h，滴加抗熒光淬滅劑后封片。激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況。

1.4 全視網膜鋪片及RGC計數

隨機選取對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、GFP-ONC組小鼠各3只，頸椎脫臼處死摘除眼球，固定剝離視網膜，4 ℃封閉過夜。抗Brn3a抗體（1∶500）4 ℃孵育2 d；Alexa Flour594羊抗兔抗體（1∶500）室溫下孵育4 h。將RGC層（GCL）朝上放置于載玻片上，將視網膜均勻地剪成4瓣，滴加抗熒光淬滅劑后封片。激光共聚焦顯微鏡觀察，10×40倍視野下，分別在距視盤約1.5、2.5、3.5 mm處0.3 mm×0.3 mm區域處取3個視野，4個象限共12個視野^[10]，拍照并應用Image J軟件對Brn3a染色的細胞進行計數。

1.5 全視野閃光視網膜電圖（ff-ERG）

隨機選取對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、GFP-ONC組小鼠各7只，參照文獻[11]的方法行ff-ERG檢查。暗適應12 h后于紅色照明下腹腔注射戊巴比妥鈉全身麻醉，0.5%鹽酸去氧腎上腺素、0.5%托吡卡因散瞳。鍍金線圈電極作為記錄電極置于角膜中央表面，銀絲電極插入兩耳間皮下作為參考電極，鐵夾夾住尾部接地。依次使用0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000 cds/m²的白光作為閃光刺激，記錄小鼠a、b波潛伏期及振幅。光亮度為3.000 cd·s/m²時記錄振蕩電位（OPs），Ops主要振幅（OP1、OP2、OP3）的總和定義為Ops的大小。觀察明視負向反應（PhNR），參照文獻[12]的方法，先于光亮度10.000 cd·s/m²的藍色和綠色背景中明適應15 min，再以光亮度6.280 cd·s/m²藍色閃光誘發刺激，記錄PhNR潛伏期及振幅。所有振幅均為該波波峰/谷相對于基線的距離。

1.6 視動反應（OMR）檢測小鼠視敏度

隨機選取對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、GFP-ONC組小鼠各7只，參照文獻[13-14]的方法，采用虛擬光眼視動力儀OptoMotry檢測各組小鼠視敏度。小鼠暗適應4 h后置于裝置平臺中心，周圍4個屏幕上顯示確定對比度的轉動光柵，當小鼠感知到光柵投射出的以一定速度轉動的圓柱后，頭部跟隨圓柱旋轉并產生角速度與圓柱近似運動，將小鼠能產生反射的最高光柵空間頻率（cyc/deg）作為視敏度。

1.7 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠視網膜中DJ-1、Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平

隨機選取正常組、不同時間ONC組以及對照組、Park7組、Park7-ONC組、ONC組、GFP-ONC組小鼠各3只，頸椎脫臼處死小鼠摘除眼球，提取視網膜蛋白，測定蛋白質濃度后進行電泳。每個泳道35 μg蛋白樣品，通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉膜后封閉1 h，抗DJ-1抗體、抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗GAPDH抗體（均為1:1000）4 ℃孵育過夜。室溫下加入二抗HRP（1:8000）孵育，加入增強化學發光劑反應后采用Bio-rad化學發光成像儀采集圖像。使用分析軟件Image J對灰度值進行分析，以GAPDH作為內參評估目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學分析

采用SPSS21.0軟件行統計學分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用最小顯著差法t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Western blot檢測結果顯示，正常組、ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組小鼠視網膜中DJ-1蛋白相對表達量分別為0.516 8±0.015 3、0.830 8±0.029 0、0.592 8±0.017 7、0.300 4±0.005 6；與正常組比較，ONC2 d組、ONC5 d組小鼠視網膜DJ-1蛋白相對表達量均顯著上升，差異有統計學意義（t=16.610、5.628，P＜0.01、＜0.05）（圖1）。

圖1 正常組、ONC 2 d組、ONC 5 d組、ONC 7 d組小鼠視網膜中DJ-1蛋白表達情況。1A示電泳圖；1B示4個組小鼠視網膜中DJ-1蛋白表達結果（n=8）。與正常組比較，ONC 2 d組、ONC 5 d組小鼠視網膜中DJ-1蛋白表達顯著升高，^*P＜0.05，^**P＜0.01。ONC：視神經鉗夾；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

圖選項

組別	n	DJ-1蛋白	Bax蛋白	Bcl-2蛋白
對照組	3	0.548±0.016	0.655±0.024	0.497±0.024
Park7組	3	0.175±0.012	0.625±0.013	0.475±0.037
Park7-ONC組	3	0.264±0.013	1.159±0.044	0.175±0.029
ONC組	3	0.599±0.017	0.976±0.029	0.275±0.029
GFP-ONC組	3	0.592±0.021	0.995±0.012	0.292±0.018
注：ONC：視神經鉗夾；GFP：綠色熒光蛋白；Bax：兔抗人單克隆抗體；Bcl-2：B淋巴細胞瘤/白血病-2

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《中華眼底病雜志》

DJ-1蛋白對視神經鉗夾傷后小鼠視網膜神經節細胞及視功能的影響

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料