引用本文: 李媛, 秦廷玉, 郭龍, 李淑珍, 侯習武. miR-142-5p靶向調控叉頭轉錄蛋白O亞族3介導輔助性T細胞17細胞炎性反應促進自身免疫性葡萄膜炎的發展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(7): 533-541. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201203-00602 復制
葡萄膜炎是一種以免疫介導的葡萄膜組織和視網膜損傷為特征的眼內炎癥性疾病[1-2]。目前尚未完全闡明該疾病潛在機制。miRNA是小的非編碼RNA分子,可充當基因表達轉錄后調節子,并影響真核生物的眾多生物學過程[3]。既往研究已闡明miRNA與葡萄膜炎之間的關系,并發現在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠模型中存在miR-142-5p表達[4-5]。CD4細胞是人體免疫系統中的一種重要免疫細胞,輔助性T細胞17(Th17)是CD4+T細胞亞群,在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要意義。叉頭轉錄蛋白O亞族3(FOXO3)在適應性免疫應答中起著重要作用,在FOXO3-/-的T細胞中,Th17細胞分化相關的基因被上調且白細胞介素(IL)-17表達增加[6-7],表明FOXO3可能參與了IL-17的產生。因此,本研究通過建立EAU模型大鼠,提取CD4+T細胞,檢測細胞中miR-142-5p與FOXO3的表達情況,驗證兩者之間的靶向關系以及對Th17細胞的相關作用,初步探討其對葡萄膜炎的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
光感受器間維生素A類結合蛋白(IRBP)1177-1191多肽片段(IRBP1177-1191)由上海生工生物公司合成;結核分枝桿菌H37RA[普如汀生物技術(北京)有限公司];異硫氰酸熒光素(FITC)抗小鼠CD4抗體、微珠和autoMACS分離柱(德國Miltenyi Biotec公司);miR-142-5p抑制劑與模擬物及其陰性對照(NC)(廣州市銳博生物科技有限公司);FOXO3干擾載體及其NC(海英拜生物科技有限公司);miRNA分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);cDNA預混液(美國Life Technologies公司);實時聚合酶鏈反應(PCR)系統(美國Applied Biosystems公司);SYBR ExScript 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。
1.2 分組和建模
健康雄性Lewis大鼠35只,6~8周齡,體重200~250 g,無特定病原體級,上海加科生物科技有限公司提供(許可證號:滬ICP備15027593號-1)。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定,并獲得鄭州大學第一附屬醫院動物倫理委員會許可(倫理編號:201905)。
采用隨機數字表法將10只大鼠分為模型組、對照組,每組5只。模型組大鼠以過繼免疫方式誘導EAU。IRBP1177-1191 30 μl、結核分枝桿菌H37RA 200 μg、完全弗氏佐劑100 μl、磷酸鹽緩沖液100 μl混合成乳劑,于大鼠尾根部和背部皮下注射至少6個點,注射劑量200 μl。對照組大鼠不作任何處理。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙燈顯微鏡檢查,參照文獻[8]的標準進行EAU評分。0分:屈光間質透明,可見眼底紅色反光;0.5分:虹膜血管擴張;1分:虹膜血管充血和瞳孔收縮異常;2分:前房混濁和紅色反光減少;3分:前房中度混濁,但仍可見眼底暗紅色反光;4分:前房嚴重混濁,瞳孔閉鎖,眼底不能窺見或眼球突出。免疫后20 d,麻醉處死大鼠,摘除眼球。4%戊二醛固定24 h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,4 μm厚度連續切片,蘇木精-伊紅(HE)染色。參照文獻[8]的標準進行組織病理學分級。0分:無炎癥,視網膜結構正常;0.5分:視網膜輕度炎癥,有或無光感受器受損;1分:視網膜輕度炎癥和(或)光感受器外節受損;2分:視網膜中度炎癥和(或)受損部位擴展至外核層;3分:視網膜中重度炎癥和(或)受損部位累及到內界膜;4分:視網膜重度炎癥和(或)視網膜全層破壞受損。
1.3 CD4+T細胞提取和轉染
免疫后21 d,取對照組、模型組大鼠眼球和引流淋巴結制備細胞懸液,分離純化T細胞。使用結合FITC抗小鼠CD4抗體和涂有抗FITC抗體的微珠組合進行選擇,autoMACS分離柱進行分離,藻紅蛋白綴合的抗CD4抗體確定分離的細胞純度。純化的細胞分為對照組、模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組、si-NC組、si-FOXO3組。對照組、模型組未進行任何轉染;miR-142-5p-mimic組、si-FOXO3組分別轉染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3;mimic-NC組、si-NC組分別轉染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3相應NC。各組CD4+T細胞在Th17極化條件下體外共培養72 h,收集細胞用于進一步分析。
1.4 qRT-PCR檢測大鼠CD4+T細胞及眼組織中miR-142-5p、FOXO3及細胞培養上清液中IL-17、IL-22、維甲酸相關孤兒受體γ(RORγ)mRNA相對表達量
miRNA分離試劑盒提取總RNA;高容量RNA至cDNA預混液合成cDNA;SYBR ExScript qRT-PCR試劑盒于實時PCR系統上進行qRT-PCR。U6作為miR-142-5p內參照,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為FOXO3、IL-17、IL-22、RORγ的內參照。引物由上海生工生物公司合成(表1)。標準SYBR-Green qRT-PCR試劑盒檢測表達,相對表達式計算使用相對量化方程2?ΔΔCt。細胞實驗重復3次,動物實驗重復5次,均取平均值。

1.5 生物信息學網站及雙熒光素酶預測miR-142-5p與FOXO3的靶向關系
293T細胞與FOXO3 3-UTR WT/Mut載體和內部對照pRenilla-TK以及hsa-miR-142-5p的模擬物/抑制劑或相應的NC共轉染。2 d后收獲細胞,雙熒光素報告試劑盒評估熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。
1.6 流式細胞儀檢測CD4+T細胞中IL-17比例
50 ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯、1 mg/ml離子霉素、1 mg/ml布雷菲德菌素A刺激CD4+T細胞4 h,固定、通透過夜。IL-17抗體行細胞內染色。FlowJo軟件分析采集的數據。實驗重復3次,取平均值。
1.7 EAU評分和組織病理學分級
采用隨機數字表法將25只大鼠分為模型組、轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p- mimic組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組,每組各5只。分別眼周注射模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組、si-NC組、si-FOXO3組細胞懸液50 μg,再次采用過繼免疫方式誘導EAU。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙燈顯微鏡檢查,參照文獻[8]的標準進行EAU評分;免疫后20 d,麻醉處死所有大鼠,摘除眼球,取任意一側眼組織進行HE染色,參照文獻[8]的標準進行組織病理學分級。
1.8 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料均以均數±標準差(±s)表示。三組間比較行單因素方差分析;兩組間比較行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-142-5p在EAU大鼠細胞中的表達
免疫后4、8、12、16、20 d,模型組大鼠均出現不同程度EAU表現,隨時間延長,其癥狀加重(圖1)。qRT-PCR檢測結果顯示,模型組、對照組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量分別為2.63±0.29、1.00±0.25,Th17細胞極化狀態下miR-142-5p mRNA相對表達量分別為2.51±0.27、1.00±0.30。模型組大鼠CD4+T細胞中、Th17細胞極化狀態下miR-142-5p mRNA相對表達量均高于對照組,差異有統計學意義(t=7.374、7.108,P=0.002、0.002)。

2.2 miR-142-5p促進EAU大鼠衍生的Th17細胞發育
qRT-PCR檢查結果顯示,模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量分別為1.00±0.25、0.96±0.27、2.72±0.38。與mimic-NC組比較,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量顯著上升,差異有統計學意義(t=6.540,P=0.003)(圖2)。與模型組、mimic-NC組比較,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞培養上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相對表達量顯著增加,差異有統計學意義(F=26.110、6.292、5.269,P=0.001、0.034、0.048)(表2,圖3)。




流式細胞儀檢測結果顯示,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中IL-17+比例較模型組、mimic-NC組明顯升高(圖4)。

qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織中miR-142-5p mRNA相對表達量較模型組、轉染mimic-NC組顯著上升;與轉染mimic-NC組比較,差異有統計學意義(t=6.690,P=0.000)(圖5)。模型組、轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p-mimic組大鼠免疫后隨時間延長,EAU評分均呈上升趨勢。光學顯微鏡觀察發現,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織較模型組、轉染mimic-NC組損傷加重(圖6A~6C)。轉染miR-142-5p-mimic組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染mimic-NC組、模型組顯著升高,差異均有統計學意義(t=5.633、6.286,P<0.05)(圖6D,6E)。


生物信息學網站預測FOXO3為miR-142-5p的直接靶點,并在FOXO3 mRNA的3'UTR區域顯示miR-142-5p的推測結合位點(圖7A)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic顯著降低野生型FOXO3 3'UTR構建物的熒光素酶活性(t=9.526,P=0.001),但對FOXO3-3'UTR構建體的突變型無影響(圖7B)。

2.3 miR-142-5p通過FOXO3促進EAU大鼠Th17細胞發育及炎性反應的發展
qRT-PCR檢測結果顯示,模型組、對照組大鼠CD4+T細胞中、Th17細胞極化狀態下FOXO3 mRNA相對表達量分別為0.53±0.05、1.00±0.06和0.58±0.06、1.00±0.05;模型組大鼠CD4+T細胞、Th17細胞極化狀態下FOXO3 mRNA相對表達量均低于對照組,差異有統計學意義(t=10.423、9.314,P=0.001、0.001)。轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量分別為1.05±0.07、0.48±0.05、1.04±0.06、0.42±0.05;與模型組比較,轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量顯著下降,差異均有統計學意義(t=14.888、16.605,P<0.05);與轉染mimic-NC組、轉染si-NC組比較,轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量顯著下降,差異有統計學意義(t=14.816、17.751,P<0.05)(圖8)。與模型組、si-NC組比較,si-FOXO3組大鼠CD4+T細胞培養上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相對表達量顯著增加,差異有統計學意義(F=55.660、10.490、11.430,P<0.05)(表3,圖9)




流式細胞儀檢測結果顯示,si-FOXO3組大鼠CD4+T細胞中IL-17+比例較模型組、si-NC組明顯升高(圖10)。

2.4 miR-142-5p通過降低FOXO3的表達加劇EAU大鼠病情的發展
qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織CD4+T細胞中FOXO3 mRNA相對表達量分別為0.45±0.06、0.40±0.07,較轉染mimic-NC組、轉染si-NC組顯著下降,差異有統計學意義(t=14.552、14.456,P<0.05)(圖11)。模型組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組大鼠免疫后隨時間延長,EAU評分均呈上升趨勢。光學顯微鏡觀察發現,轉染si-FOXO3組大鼠眼組織損傷明顯加重(圖12A~12C)。與轉染si-NC組比較,轉染si-FOXO3組大鼠EAU評分與組織病理學分級均顯著升高,差異有統計學意義(t=6.852、6.635,P<0.05)(圖12D,12E)。


3 討論
葡萄膜炎是由于感染或自身免疫性疾病以及自身炎癥所引起,其病程長,是致盲的重要原因之一[9-10]。病原性Th17細胞是自身免疫性疾病的關鍵驅動因子,是CD4+T細胞亞群,可作為臨床診斷或治療自身免疫性疾病的潛在靶點[11]。miRNA能夠通過轉錄后調節基因表達,通過與互補靶標mRNA結合,抑制mRNA翻譯成蛋白質或誘導mRNA降解,參與疾病的進程[12]。研究發現,miRNA可調控自身反應性Th17細胞應答,改善EAU的損傷程度[13-15]。
Han等[16]、Talebi等[17]研究發現,miR-142-5p參與免疫反應與炎癥反應調節。miR-142-5p能促進視網膜母細胞瘤細胞增生和上皮-間質轉化[18]。為探討miR-142-5p對葡萄膜炎的作用,本研究建立EAU模型,結果顯示模型組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p表達高于對照組大鼠。這說明miR-142-5p在EAU大鼠細胞中上調,對從EAU大鼠新鮮分離的CD4+T細胞進行miR-142-5p模擬物轉染,miR-142-5p表達顯著上調。為評估miR-142-5p是否能夠在體外直接影響Th17細胞發育,本研究將轉染的CD4+T細胞在Th17細胞極化條件下共培養,發現miR-142-5p-mimic促進Th17細胞表面標記物IL-17的產生,同時IL-22、RORγ表達也顯著增加。IL-17、IL-22是CD4+T細胞及Th17細胞的主要分泌因子,RORγ為主要的轉錄因子,它們的增加提示miR-142-5p能促進EAU大鼠衍生的Th17細胞發育。轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織中miR-142-5p表達顯著上升;各組大鼠EAU評分均呈上升趨勢,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染mimic-NC組與模型組顯著升高。這說明上調miR-142-5p加劇EAU嚴重程度。
為研究miR-142-5p的下游調控機制,生物信息學網站預測FOXO3是miR-142-5p的直接靶點,并在FOXO3 mRNA的3'UTR區域顯示了miR-142-5p的推測結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic顯著降低野生型FOXO3 3'UTR構建物的熒光素酶活性,但對FOXO3-3'UTR構建體的突變型無影響。這些結果表明FOXO3是miR-142-5p的直接靶點。Wei等[19]研究表明,在EAU大鼠體內存在FOXO3表達,并通過調控其表達對EAU的病情產生影響。經本研究發現,在EAU大鼠細胞中,FOXO3表達降低。轉染miR-142-5p-mimic及si-FOXO3后FOXO3表達顯著下降,轉染si-FOXO3組Th17細胞標記物IL-17、IL-22以及RORγ的表達較轉染si-NC組增加。這說明miR-142-5p可通過FOXO3促進EAU大鼠Th17細胞發育及炎性反應的發展。轉染miR-142-5p-mimic組和si-FOXO3組大鼠眼組織CD4+T細胞中FOXO3表達顯著下降;各組大鼠EAU評分均呈上升趨勢,轉染si-FOXO3組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染si-NC組、模型組顯著升高。這提示miR-142-5p通過降低FOXO3的表達加劇EAU大鼠病情的發展。
本研究結果表明,EAU大鼠細胞中,miR-142-5p表達上調,FOXO3表達下調;miR-142-5p與FOXO3具有靶向關系;miR-142-5p調控Th17細胞體外發育;轉染miR-142-5p模擬物可促進EAU發展。機制上,miR-142-5p靶向調控FOXO3的表達促進了Th17細胞相關炎性因子的發展,引起炎性反應,從而促進自身免疫性葡萄膜炎的發展。
葡萄膜炎是一種以免疫介導的葡萄膜組織和視網膜損傷為特征的眼內炎癥性疾病[1-2]。目前尚未完全闡明該疾病潛在機制。miRNA是小的非編碼RNA分子,可充當基因表達轉錄后調節子,并影響真核生物的眾多生物學過程[3]。既往研究已闡明miRNA與葡萄膜炎之間的關系,并發現在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠模型中存在miR-142-5p表達[4-5]。CD4細胞是人體免疫系統中的一種重要免疫細胞,輔助性T細胞17(Th17)是CD4+T細胞亞群,在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要意義。叉頭轉錄蛋白O亞族3(FOXO3)在適應性免疫應答中起著重要作用,在FOXO3-/-的T細胞中,Th17細胞分化相關的基因被上調且白細胞介素(IL)-17表達增加[6-7],表明FOXO3可能參與了IL-17的產生。因此,本研究通過建立EAU模型大鼠,提取CD4+T細胞,檢測細胞中miR-142-5p與FOXO3的表達情況,驗證兩者之間的靶向關系以及對Th17細胞的相關作用,初步探討其對葡萄膜炎的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
光感受器間維生素A類結合蛋白(IRBP)1177-1191多肽片段(IRBP1177-1191)由上海生工生物公司合成;結核分枝桿菌H37RA[普如汀生物技術(北京)有限公司];異硫氰酸熒光素(FITC)抗小鼠CD4抗體、微珠和autoMACS分離柱(德國Miltenyi Biotec公司);miR-142-5p抑制劑與模擬物及其陰性對照(NC)(廣州市銳博生物科技有限公司);FOXO3干擾載體及其NC(海英拜生物科技有限公司);miRNA分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司);cDNA預混液(美國Life Technologies公司);實時聚合酶鏈反應(PCR)系統(美國Applied Biosystems公司);SYBR ExScript 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。
1.2 分組和建模
健康雄性Lewis大鼠35只,6~8周齡,體重200~250 g,無特定病原體級,上海加科生物科技有限公司提供(許可證號:滬ICP備15027593號-1)。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定,并獲得鄭州大學第一附屬醫院動物倫理委員會許可(倫理編號:201905)。
采用隨機數字表法將10只大鼠分為模型組、對照組,每組5只。模型組大鼠以過繼免疫方式誘導EAU。IRBP1177-1191 30 μl、結核分枝桿菌H37RA 200 μg、完全弗氏佐劑100 μl、磷酸鹽緩沖液100 μl混合成乳劑,于大鼠尾根部和背部皮下注射至少6個點,注射劑量200 μl。對照組大鼠不作任何處理。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙燈顯微鏡檢查,參照文獻[8]的標準進行EAU評分。0分:屈光間質透明,可見眼底紅色反光;0.5分:虹膜血管擴張;1分:虹膜血管充血和瞳孔收縮異常;2分:前房混濁和紅色反光減少;3分:前房中度混濁,但仍可見眼底暗紅色反光;4分:前房嚴重混濁,瞳孔閉鎖,眼底不能窺見或眼球突出。免疫后20 d,麻醉處死大鼠,摘除眼球。4%戊二醛固定24 h,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,4 μm厚度連續切片,蘇木精-伊紅(HE)染色。參照文獻[8]的標準進行組織病理學分級。0分:無炎癥,視網膜結構正常;0.5分:視網膜輕度炎癥,有或無光感受器受損;1分:視網膜輕度炎癥和(或)光感受器外節受損;2分:視網膜中度炎癥和(或)受損部位擴展至外核層;3分:視網膜中重度炎癥和(或)受損部位累及到內界膜;4分:視網膜重度炎癥和(或)視網膜全層破壞受損。
1.3 CD4+T細胞提取和轉染
免疫后21 d,取對照組、模型組大鼠眼球和引流淋巴結制備細胞懸液,分離純化T細胞。使用結合FITC抗小鼠CD4抗體和涂有抗FITC抗體的微珠組合進行選擇,autoMACS分離柱進行分離,藻紅蛋白綴合的抗CD4抗體確定分離的細胞純度。純化的細胞分為對照組、模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組、si-NC組、si-FOXO3組。對照組、模型組未進行任何轉染;miR-142-5p-mimic組、si-FOXO3組分別轉染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3;mimic-NC組、si-NC組分別轉染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3相應NC。各組CD4+T細胞在Th17極化條件下體外共培養72 h,收集細胞用于進一步分析。
1.4 qRT-PCR檢測大鼠CD4+T細胞及眼組織中miR-142-5p、FOXO3及細胞培養上清液中IL-17、IL-22、維甲酸相關孤兒受體γ(RORγ)mRNA相對表達量
miRNA分離試劑盒提取總RNA;高容量RNA至cDNA預混液合成cDNA;SYBR ExScript qRT-PCR試劑盒于實時PCR系統上進行qRT-PCR。U6作為miR-142-5p內參照,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為FOXO3、IL-17、IL-22、RORγ的內參照。引物由上海生工生物公司合成(表1)。標準SYBR-Green qRT-PCR試劑盒檢測表達,相對表達式計算使用相對量化方程2?ΔΔCt。細胞實驗重復3次,動物實驗重復5次,均取平均值。

1.5 生物信息學網站及雙熒光素酶預測miR-142-5p與FOXO3的靶向關系
293T細胞與FOXO3 3-UTR WT/Mut載體和內部對照pRenilla-TK以及hsa-miR-142-5p的模擬物/抑制劑或相應的NC共轉染。2 d后收獲細胞,雙熒光素報告試劑盒評估熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。
1.6 流式細胞儀檢測CD4+T細胞中IL-17比例
50 ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯、1 mg/ml離子霉素、1 mg/ml布雷菲德菌素A刺激CD4+T細胞4 h,固定、通透過夜。IL-17抗體行細胞內染色。FlowJo軟件分析采集的數據。實驗重復3次,取平均值。
1.7 EAU評分和組織病理學分級
采用隨機數字表法將25只大鼠分為模型組、轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p- mimic組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組,每組各5只。分別眼周注射模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組、si-NC組、si-FOXO3組細胞懸液50 μg,再次采用過繼免疫方式誘導EAU。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙燈顯微鏡檢查,參照文獻[8]的標準進行EAU評分;免疫后20 d,麻醉處死所有大鼠,摘除眼球,取任意一側眼組織進行HE染色,參照文獻[8]的標準進行組織病理學分級。
1.8 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料均以均數±標準差(±s)表示。三組間比較行單因素方差分析;兩組間比較行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-142-5p在EAU大鼠細胞中的表達
免疫后4、8、12、16、20 d,模型組大鼠均出現不同程度EAU表現,隨時間延長,其癥狀加重(圖1)。qRT-PCR檢測結果顯示,模型組、對照組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量分別為2.63±0.29、1.00±0.25,Th17細胞極化狀態下miR-142-5p mRNA相對表達量分別為2.51±0.27、1.00±0.30。模型組大鼠CD4+T細胞中、Th17細胞極化狀態下miR-142-5p mRNA相對表達量均高于對照組,差異有統計學意義(t=7.374、7.108,P=0.002、0.002)。

2.2 miR-142-5p促進EAU大鼠衍生的Th17細胞發育
qRT-PCR檢查結果顯示,模型組、mimic-NC組、miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量分別為1.00±0.25、0.96±0.27、2.72±0.38。與mimic-NC組比較,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p mRNA相對表達量顯著上升,差異有統計學意義(t=6.540,P=0.003)(圖2)。與模型組、mimic-NC組比較,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞培養上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相對表達量顯著增加,差異有統計學意義(F=26.110、6.292、5.269,P=0.001、0.034、0.048)(表2,圖3)。




流式細胞儀檢測結果顯示,miR-142-5p-mimic組大鼠CD4+T細胞中IL-17+比例較模型組、mimic-NC組明顯升高(圖4)。

qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織中miR-142-5p mRNA相對表達量較模型組、轉染mimic-NC組顯著上升;與轉染mimic-NC組比較,差異有統計學意義(t=6.690,P=0.000)(圖5)。模型組、轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p-mimic組大鼠免疫后隨時間延長,EAU評分均呈上升趨勢。光學顯微鏡觀察發現,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織較模型組、轉染mimic-NC組損傷加重(圖6A~6C)。轉染miR-142-5p-mimic組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染mimic-NC組、模型組顯著升高,差異均有統計學意義(t=5.633、6.286,P<0.05)(圖6D,6E)。


生物信息學網站預測FOXO3為miR-142-5p的直接靶點,并在FOXO3 mRNA的3'UTR區域顯示miR-142-5p的推測結合位點(圖7A)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic顯著降低野生型FOXO3 3'UTR構建物的熒光素酶活性(t=9.526,P=0.001),但對FOXO3-3'UTR構建體的突變型無影響(圖7B)。

2.3 miR-142-5p通過FOXO3促進EAU大鼠Th17細胞發育及炎性反應的發展
qRT-PCR檢測結果顯示,模型組、對照組大鼠CD4+T細胞中、Th17細胞極化狀態下FOXO3 mRNA相對表達量分別為0.53±0.05、1.00±0.06和0.58±0.06、1.00±0.05;模型組大鼠CD4+T細胞、Th17細胞極化狀態下FOXO3 mRNA相對表達量均低于對照組,差異有統計學意義(t=10.423、9.314,P=0.001、0.001)。轉染mimic-NC組、轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量分別為1.05±0.07、0.48±0.05、1.04±0.06、0.42±0.05;與模型組比較,轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量顯著下降,差異均有統計學意義(t=14.888、16.605,P<0.05);與轉染mimic-NC組、轉染si-NC組比較,轉染si-FOXO3組大鼠眼組織中FOXO3 mRNA相對表達量顯著下降,差異有統計學意義(t=14.816、17.751,P<0.05)(圖8)。與模型組、si-NC組比較,si-FOXO3組大鼠CD4+T細胞培養上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相對表達量顯著增加,差異有統計學意義(F=55.660、10.490、11.430,P<0.05)(表3,圖9)




流式細胞儀檢測結果顯示,si-FOXO3組大鼠CD4+T細胞中IL-17+比例較模型組、si-NC組明顯升高(圖10)。

2.4 miR-142-5p通過降低FOXO3的表達加劇EAU大鼠病情的發展
qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic組、轉染si-FOXO3組大鼠眼組織CD4+T細胞中FOXO3 mRNA相對表達量分別為0.45±0.06、0.40±0.07,較轉染mimic-NC組、轉染si-NC組顯著下降,差異有統計學意義(t=14.552、14.456,P<0.05)(圖11)。模型組、轉染si-NC組、轉染si-FOXO3組大鼠免疫后隨時間延長,EAU評分均呈上升趨勢。光學顯微鏡觀察發現,轉染si-FOXO3組大鼠眼組織損傷明顯加重(圖12A~12C)。與轉染si-NC組比較,轉染si-FOXO3組大鼠EAU評分與組織病理學分級均顯著升高,差異有統計學意義(t=6.852、6.635,P<0.05)(圖12D,12E)。


3 討論
葡萄膜炎是由于感染或自身免疫性疾病以及自身炎癥所引起,其病程長,是致盲的重要原因之一[9-10]。病原性Th17細胞是自身免疫性疾病的關鍵驅動因子,是CD4+T細胞亞群,可作為臨床診斷或治療自身免疫性疾病的潛在靶點[11]。miRNA能夠通過轉錄后調節基因表達,通過與互補靶標mRNA結合,抑制mRNA翻譯成蛋白質或誘導mRNA降解,參與疾病的進程[12]。研究發現,miRNA可調控自身反應性Th17細胞應答,改善EAU的損傷程度[13-15]。
Han等[16]、Talebi等[17]研究發現,miR-142-5p參與免疫反應與炎癥反應調節。miR-142-5p能促進視網膜母細胞瘤細胞增生和上皮-間質轉化[18]。為探討miR-142-5p對葡萄膜炎的作用,本研究建立EAU模型,結果顯示模型組大鼠CD4+T細胞中miR-142-5p表達高于對照組大鼠。這說明miR-142-5p在EAU大鼠細胞中上調,對從EAU大鼠新鮮分離的CD4+T細胞進行miR-142-5p模擬物轉染,miR-142-5p表達顯著上調。為評估miR-142-5p是否能夠在體外直接影響Th17細胞發育,本研究將轉染的CD4+T細胞在Th17細胞極化條件下共培養,發現miR-142-5p-mimic促進Th17細胞表面標記物IL-17的產生,同時IL-22、RORγ表達也顯著增加。IL-17、IL-22是CD4+T細胞及Th17細胞的主要分泌因子,RORγ為主要的轉錄因子,它們的增加提示miR-142-5p能促進EAU大鼠衍生的Th17細胞發育。轉染miR-142-5p-mimic組大鼠眼組織中miR-142-5p表達顯著上升;各組大鼠EAU評分均呈上升趨勢,轉染miR-142-5p-mimic組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染mimic-NC組與模型組顯著升高。這說明上調miR-142-5p加劇EAU嚴重程度。
為研究miR-142-5p的下游調控機制,生物信息學網站預測FOXO3是miR-142-5p的直接靶點,并在FOXO3 mRNA的3'UTR區域顯示了miR-142-5p的推測結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,轉染miR-142-5p-mimic顯著降低野生型FOXO3 3'UTR構建物的熒光素酶活性,但對FOXO3-3'UTR構建體的突變型無影響。這些結果表明FOXO3是miR-142-5p的直接靶點。Wei等[19]研究表明,在EAU大鼠體內存在FOXO3表達,并通過調控其表達對EAU的病情產生影響。經本研究發現,在EAU大鼠細胞中,FOXO3表達降低。轉染miR-142-5p-mimic及si-FOXO3后FOXO3表達顯著下降,轉染si-FOXO3組Th17細胞標記物IL-17、IL-22以及RORγ的表達較轉染si-NC組增加。這說明miR-142-5p可通過FOXO3促進EAU大鼠Th17細胞發育及炎性反應的發展。轉染miR-142-5p-mimic組和si-FOXO3組大鼠眼組織CD4+T細胞中FOXO3表達顯著下降;各組大鼠EAU評分均呈上升趨勢,轉染si-FOXO3組大鼠EAU評分與組織病理學分級均較轉染si-NC組、模型組顯著升高。這提示miR-142-5p通過降低FOXO3的表達加劇EAU大鼠病情的發展。
本研究結果表明,EAU大鼠細胞中,miR-142-5p表達上調,FOXO3表達下調;miR-142-5p與FOXO3具有靶向關系;miR-142-5p調控Th17細胞體外發育;轉染miR-142-5p模擬物可促進EAU發展。機制上,miR-142-5p靶向調控FOXO3的表達促進了Th17細胞相關炎性因子的發展,引起炎性反應,從而促進自身免疫性葡萄膜炎的發展。