引用本文： 劉勃實, 韓金棟, 黃欣遠, 李輝, 曹靖靖, 梁景黎, 李筱榮, 東莉潔. 氧誘導視網膜病變小鼠模型中參與p21調控的miRNA表達譜分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(9): 762-767. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201112-00545 復制
視網膜新生血管（RNV）性疾病是導致各年齡段視覺障礙的主要原因。病理性新生血管受多種因素調節[1-2]。miRNA是一種小的內源性非編碼RNA分子，通常靶向一個或多個mRNA，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNA而調節基因表達，進而參與生物進程[3]。近年，miRNA通過調控多種因子抑制或促進RNV生成的研究時有報道[4-5]。p21（CDKN1）為細胞周期抑制因子，可通過與多種細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）復合體結合發揮對細胞周期負性調節作用，進而調控細胞的生物學過程[6]。我們前期研究中發現p21在氧誘導視網膜病變（OIR）模型中表達水平明顯低于對照組，其后體內動物實驗研究發現p21高表達可以顯著下調RNV數量[7]；而體外細胞實驗結果顯示p21對視網膜血管內皮細胞增生、遷移及管腔形成均可發揮抑制作用[8]。為進一步了解miRNA與p21的相互作用及其在RNV中的作用途徑，本研究通過對OIR模型小鼠的視網膜組織行miRNA芯片檢測，篩選差異miRNA，明確與RNV形成且與p21調控存在潛在關聯的miRNA及通路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康C57BL/6J小鼠40只，7日齡，體重（3.53±0.37）g，雌雄不限，清潔級，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：TJYY20190103002）。將小鼠分為OIR組、正常組，各20只。OIR組小鼠參照文獻[9]的方法構建OIR模型。正常組小鼠不做任何處理。
小鼠17日齡（P17）時，每組隨機選取6只小鼠過量麻醉處死。摘取眼球，4%多聚甲醛中室溫固定2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）4 ℃保存。手術顯微鏡下剝離完整的視網膜，封閉2 h（10 ml PBS、30 μl Triton X-100、20 mg牛血清白蛋白）。然后置于IB4[1∶500稀釋于0.3%磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST），美國Invitrogen公司，I21411]中4℃孵育過夜。0.3% PBST洗3次后，將視網膜放置在載玻片上并在相等的距離上做放射狀切口。抗熒光衰退封片劑封片后，立刻使用共聚焦顯微鏡在5倍視野下拍照。
小鼠P17時，每組隨機選取6只小鼠過量麻醉處死。摘除眼球，4%多聚甲醛中4 °C過夜；常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，連續切片。常規脫蠟后行蘇木精-伊紅（HE）染色。計數每張切片中突破內界膜（ILM）的血管內皮細胞核數。
小鼠P17時，每組隨機選取8只小鼠過量麻醉處死。摘除眼球，取視網膜組織立即放入液氮中，－80 ℃冰箱保存。小鼠視網膜標本由北京霖源生物科技有限公司行基因芯片分析。
基因芯片分析所得差異miRNA靶基因的基因注釋（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析由北京霖源生物科技有限公司完成。p21相關GO條目通過Gene Ontology在線數據庫（http://www.geneontology.org/），輸入關鍵詞“CDKN1A”獲得；KEGG通路條目通過KEGG數據庫（https://www.kegg.jp/）取得。
應用Targetscan Release 7.2（http://www.targetscan.org）、MiRanda（http://www.microrna. org）、MicroT-CDS（http://www.microrna.gr/microT-CDS）數據庫篩選p21相關miRNA。選取物種為小鼠（Mus Musculus），以“CDKN1A”為關鍵詞，搜索CDKN1A（即p21）的可能互作miRNA，并與基因芯片所得的差異miRNA進行比對，分析有無重合。重合者即為與p21有關的差異miRNA。并在此基礎上分析3個數據庫所得結果的交集情況，交集越多被認為結果越可靠。
采用SPSS22.0軟件進行統計學處理。所有數據以均數±標準差（
）表示。組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常組小鼠視網膜未見明顯無灌注區及RNV（圖1A）；OIR組小鼠可見大量無灌注區和RNV（圖1B）。兩組小鼠視網膜無灌注區相對面積比較，差異有統計學意義（t=18.800，P<0.000 1）（圖1C）。正常組小鼠未見突破ILM的血管內皮細胞核（圖2A）；OIR組可見大量突破ILM的血管內皮細胞核（圖2B）。兩組小鼠突破ILM的血管內皮細胞核數量比較，差異有統計學意義（t=9.025，P=0.000 1）。
圖1
正常組、OIR組小鼠視網膜鋪片熒光顯微鏡像及視網膜無灌注區相對面積比較。1A、1B分別示正常組、OIR組視網膜鋪片熒光顯微鏡像。正常組小鼠視網膜未見明顯無灌注區及RNV；OIR組小鼠視網膜可見明顯的無灌注區（黃色線圈內）及RNV ×50。1C示正常組、OIR組小鼠視網膜無灌注區相對面積比較（n=6），*P＜0.05。OIR：氧誘導視網膜病變；RNV：視網膜新生血管
圖2
正常組、OIR組小鼠視網膜切片光學顯微鏡像及突破ILM的血管內皮細胞核數量比較。2A、2B示正常組、OIR組光學顯微鏡像，正常組小鼠未見突破ILM的血管內皮細胞核；OIR組小鼠可見大量突破ILM的血管內皮細胞核（黑箭） HE ×400。2C示兩組小鼠突破ILM的血管內皮細胞核數量比較（n=6），*P＜0.05。OIR：氧誘導視網膜病變；ILM：內界膜；HE：蘇木精-伊紅
miRNA芯片分析共鑒定出1 882個miRNA，其中miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-129-5p與p21相關。與正常組比較，OIR組有統計學差異的表達有54個。其中，上調、下調者分別為47、7個；差異表達倍數＞1.25倍者23個，＜0.75倍者5個（表1）。
表1
差異表達倍數＞1.25及＜0.75的miRNA
從3個數據庫與所得差異miRNA的比對結果中共篩選到與p21相關miRNA 13個，按差異倍數從高到低分別為miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-329-3p、miR-362-3p、miR-532-5p、miR-20b-5p、miR-20a-5p、miR-195a-5p、miR-423-5p、miR-497a-5p、miR-129-5p。其中，與p21相關且具有較顯著差異（差異倍數＞1.25或＜0.75）miRNA為miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-129-5p。未發現在3個數據庫交集者；2個數據庫交集者7個，分別為miR-224-5p、miR-329-3p、miR-362-3p、miR-20b-5p、miR-20a-5p、miR-423-5p、miR-129-5p；單個數據庫中出現者6個（圖3）。
圖3
p21相關miRNA篩選
差異miRNA靶基因GO分析得到與p21相關顯著差異條目1 112個（P＜0.05）。與GO在線數據庫中檢索得到的p21相關條目比對，與GO條目重疊50個，其中生物學過程、細胞組分、分子功能分別為35、8、7個。其中生物學過程主要在轉錄調控、DNA模板、細胞代謝過程的調控、基因表達的調控、多細胞器官發育和氮化合物代謝過程調控等方面富集（圖4A）；細胞組分主要集中在細胞核和胞內細胞器中（圖4B）；分子功能主要集中在蛋白質結合方面（圖4C）。
圖4
基于差異表達miRNA靶基因的p21相關GO通路分析氣泡圖。4A示生物學過程。1. 組織發育；2. 轉錄調控，DNA模板；3. 有絲分裂細胞周期的G1/S期轉換；4. 有絲分裂細胞周期；5. 細胞周期調控；6. 細胞周期的正向調控；7. 細胞周期的負向調控；8. 細胞周期；9. 細胞增生調控；10. 細胞增生的正向調控；11. 細胞應激反應；12. 細胞生物合成過程的正向調控；13. 細胞分化調控；14. 細胞對DNA損傷刺激的反應；15. 細胞蛋白代謝過程的正向調控；16. 細胞蛋白代謝過程的調控；17. 細胞代謝過程的正向調控；18. 細胞代謝過程的調控；19. 細胞程序性死亡的正向調控；20. 上皮細胞增生調控；21. 上皮發育；22. 器官發育；23. 節律過程；24. 基因表達的正向調控；25. 基因表達的調控；26. 多細胞器官發育；27. 氮化合物代謝過程調控；28. 蛋白磷酸化的正向調控；29. 蛋白磷酸化的調控；30. 蛋白磷酸化；31. 蛋白激酶激活調控；32. 大分子生物合成過程的正向調控；33. 催化活性調控；34. 成纖維細胞增生的正向調控；35. Ras蛋白信號轉導。4B、4C分別示細胞組分、分子功能。GO：基因注釋
差異miRNA靶基因KEGG分析得到65個顯著差異條目（P＜0.05），其中與GO數據庫中檢索得到的p21通路條目重疊13個（圖5），包括子宮內膜癌、胰腺癌、小細胞肺癌、前列腺癌、慢性粒細胞白血病、膠質細胞瘤、基底細胞癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、丙型肺炎、膀胱癌、癌癥通路、ErbB信號通路，其中最為富集的是癌癥通路。
圖5
基于差異表達miRNA靶基因的p21相關KEGG通路分析通路氣泡圖。KEGG：京都基因與基因組百科全書
3 討論
血管內皮生長因子（VEGF）是參與新生血管生成的主要刺激因子，視網膜色素上皮細胞和Müller細胞是眼內VEGF的主要來源[10]。以抗VEGF作為藥物靶點的應用在近年已取得較好臨床效果，然而僅針對這一靶點會影響生理VEGF的維持，從而導致血管異常[11] 。因此，尋找新的可靠靶點必不可少。轉錄組學作為目前發展較快、應用較多的一種生物信息分析手段，在生物醫學研究領域發揮著越來越重要的作用，通過RNA的水平來研究基因的表達情況，進而獲得可靠的生物信息[12]。本研究利用miRNA分析技術挖掘OIR模型中p21的上游調控分子，明確其上下游調控關系，初步探究p21在OIR的作用機制，為臨床治療提供一個新的基因手段。
氧誘導新生小鼠視網膜病變進而制備RNV模型已廣泛應用于病理性視網膜研究，此模型可確保新生血管的發生，并通過視網膜鋪片和HE染色得以檢驗[13]。本研究結果顯示，OIR組小鼠視網膜有明顯無灌注區，且突破ILM的血管內皮細胞核明顯增多，證實模型構建成功。
本研究通過3個主流miRNA數據庫，得到13個與p21相關miRNA。其中，miR-129-5p是唯一表達下調者。目前對其研究主要集中于腫瘤領域，涉及細胞增生、遷移以及血管生成等過程，如通過Wnt5a阻斷蛋白激酶C/細胞外信號調節激酶/核因子-κB、c-Jun氨基末端激酶通路，抑制膠質母細胞瘤增生、血管生成[14]。通過轉化生長因子-β誘導的因子同位序列2途徑抑制膠質瘤細胞增生和遷移，并使細胞有絲分裂停留在G0/G1期[15]。此外，還可經由SOX4/Wnt/β-catenin等通路抑制多種腫瘤細胞的增生[16]。主要作為細胞增生和血管形成的抑制因子存在，此與其在OIR模型中表達下調相吻合，而其與p21之間表達量的同向變化則表明兩者之間的作用可能存在其他因子的影響。除miR-129-5p外，其他miRNA在血管形成、細胞增生等方面的作用亦有研究報道，如miR-335參與結腸癌等各類腫瘤的增生、遷移過程，涉及MAPK1、ROCK1、PAX6等靶基因[17]。miR-532-5p通過靶向調節TWIST1從而抑制卵巢癌上皮細胞的增生、侵襲，并可作為卵巢癌的預后指標[18]。miRNA-224可促進 Wnt/β-catenin信號通路介導的結直腸癌細胞增生、侵襲[19]。miR-362-3p通過靶向作用于ADAMTS1抑制血管平滑肌細胞增生、遷移進而延緩動脈粥樣硬化進展[20]。由于miRNA與mRNA之間作用的復雜性，同一miRNA的表達在不同疾病或生理過程中有所不同，其具體作用亦尚無定論，但其中頻繁涉及到的通路和基因為Wnt、AKT-ERK、EGFR等，這也提示關注這些關鍵節點。
本研究共篩選到13條KEGG通路及50個GO條目與p21相關。其中，13條KEGG通路均與血管生成或細胞增生相關，且各通路所涉及的基因具有較高的重復性，包括Wnt、EGF-EGFR、FGF-FGFR、VEGF、PIK、AKT、PAK等基因家族；50個GO條目中，富集度較高的主要是細胞增生相關細胞周期相關條目，如細胞周期正向調控、CDK活性上調、對細胞周期停滯的負向調控等，均與p21作為細胞周期調控因子的作用相符。
本研究結果顯示，以p21為靶點的miRNA在OIR模型中存在表達差異，提示這些miRNA可能通過調控p21的表達而在RNV形成中發揮重要作用。然而，這些篩選出來的miRNA與P21的直接作用研究較少，本研究尚未對這些miRNA與P21的相互作用關系進行驗證。下一步我們將探究這些miRNA與P21的關系，為RNV性疾病的診斷和治療提供幫助。
視網膜新生血管（RNV）性疾病是導致各年齡段視覺障礙的主要原因。病理性新生血管受多種因素調節[1-2]。miRNA是一種小的內源性非編碼RNA分子，通常靶向一個或多個mRNA，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNA而調節基因表達，進而參與生物進程[3]。近年，miRNA通過調控多種因子抑制或促進RNV生成的研究時有報道[4-5]。p21（CDKN1）為細胞周期抑制因子，可通過與多種細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）復合體結合發揮對細胞周期負性調節作用，進而調控細胞的生物學過程[6]。我們前期研究中發現p21在氧誘導視網膜病變（OIR）模型中表達水平明顯低于對照組，其后體內動物實驗研究發現p21高表達可以顯著下調RNV數量[7]；而體外細胞實驗結果顯示p21對視網膜血管內皮細胞增生、遷移及管腔形成均可發揮抑制作用[8]。為進一步了解miRNA與p21的相互作用及其在RNV中的作用途徑，本研究通過對OIR模型小鼠的視網膜組織行miRNA芯片檢測，篩選差異miRNA，明確與RNV形成且與p21調控存在潛在關聯的miRNA及通路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康C57BL/6J小鼠40只，7日齡，體重（3.53±0.37）g，雌雄不限，清潔級，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會許可（倫理編號：TJYY20190103002）。將小鼠分為OIR組、正常組，各20只。OIR組小鼠參照文獻[9]的方法構建OIR模型。正常組小鼠不做任何處理。
小鼠17日齡（P17）時，每組隨機選取6只小鼠過量麻醉處死。摘取眼球，4%多聚甲醛中室溫固定2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）4 ℃保存。手術顯微鏡下剝離完整的視網膜，封閉2 h（10 ml PBS、30 μl Triton X-100、20 mg牛血清白蛋白）。然后置于IB4[1∶500稀釋于0.3%磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST），美國Invitrogen公司，I21411]中4℃孵育過夜。0.3% PBST洗3次后，將視網膜放置在載玻片上并在相等的距離上做放射狀切口。抗熒光衰退封片劑封片后，立刻使用共聚焦顯微鏡在5倍視野下拍照。
小鼠P17時，每組隨機選取6只小鼠過量麻醉處死。摘除眼球，4%多聚甲醛中4 °C過夜；常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，連續切片。常規脫蠟后行蘇木精-伊紅（HE）染色。計數每張切片中突破內界膜（ILM）的血管內皮細胞核數。
小鼠P17時，每組隨機選取8只小鼠過量麻醉處死。摘除眼球，取視網膜組織立即放入液氮中，－80 ℃冰箱保存。小鼠視網膜標本由北京霖源生物科技有限公司行基因芯片分析。
基因芯片分析所得差異miRNA靶基因的基因注釋（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析由北京霖源生物科技有限公司完成。p21相關GO條目通過Gene Ontology在線數據庫（http://www.geneontology.org/），輸入關鍵詞“CDKN1A”獲得；KEGG通路條目通過KEGG數據庫（https://www.kegg.jp/）取得。
應用Targetscan Release 7.2（http://www.targetscan.org）、MiRanda（http://www.microrna. org）、MicroT-CDS（http://www.microrna.gr/microT-CDS）數據庫篩選p21相關miRNA。選取物種為小鼠（Mus Musculus），以“CDKN1A”為關鍵詞，搜索CDKN1A（即p21）的可能互作miRNA，并與基因芯片所得的差異miRNA進行比對，分析有無重合。重合者即為與p21有關的差異miRNA。并在此基礎上分析3個數據庫所得結果的交集情況，交集越多被認為結果越可靠。
采用SPSS22.0軟件進行統計學處理。所有數據以均數±標準差（）表示。組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常組小鼠視網膜未見明顯無灌注區及RNV（圖1A）；OIR組小鼠可見大量無灌注區和RNV（圖1B）。兩組小鼠視網膜無灌注區相對面積比較，差異有統計學意義（t=18.800，P<0.000 1）（圖1C）。正常組小鼠未見突破ILM的血管內皮細胞核（圖2A）；OIR組可見大量突破ILM的血管內皮細胞核（圖2B）。兩組小鼠突破ILM的血管內皮細胞核數量比較，差異有統計學意義（t=9.025，P=0.000 1）。
圖1
正常組、OIR組小鼠視網膜鋪片熒光顯微鏡像及視網膜無灌注區相對面積比較。1A、1B分別示正常組、OIR組視網膜鋪片熒光顯微鏡像。正常組小鼠視網膜未見明顯無灌注區及RNV；OIR組小鼠視網膜可見明顯的無灌注區（黃色線圈內）及RNV ×50。1C示正常組、OIR組小鼠視網膜無灌注區相對面積比較（n=6），*P＜0.05。OIR：氧誘導視網膜病變；RNV：視網膜新生血管
圖2
正常組、OIR組小鼠視網膜切片光學顯微鏡像及突破ILM的血管內皮細胞核數量比較。2A、2B示正常組、OIR組光學顯微鏡像，正常組小鼠未見突破ILM的血管內皮細胞核；OIR組小鼠可見大量突破ILM的血管內皮細胞核（黑箭） HE ×400。2C示兩組小鼠突破ILM的血管內皮細胞核數量比較（n=6），*P＜0.05。OIR：氧誘導視網膜病變；ILM：內界膜；HE：蘇木精-伊紅
miRNA芯片分析共鑒定出1 882個miRNA，其中miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-129-5p與p21相關。與正常組比較，OIR組有統計學差異的表達有54個。其中，上調、下調者分別為47、7個；差異表達倍數＞1.25倍者23個，＜0.75倍者5個（表1）。
表1
差異表達倍數＞1.25及＜0.75的miRNA
從3個數據庫與所得差異miRNA的比對結果中共篩選到與p21相關miRNA 13個，按差異倍數從高到低分別為miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-329-3p、miR-362-3p、miR-532-5p、miR-20b-5p、miR-20a-5p、miR-195a-5p、miR-423-5p、miR-497a-5p、miR-129-5p。其中，與p21相關且具有較顯著差異（差異倍數＞1.25或＜0.75）miRNA為miR-7218-5p、miR-322-5p、miR-224-5p、miR-335-5p、miR-129-5p。未發現在3個數據庫交集者；2個數據庫交集者7個，分別為miR-224-5p、miR-329-3p、miR-362-3p、miR-20b-5p、miR-20a-5p、miR-423-5p、miR-129-5p；單個數據庫中出現者6個（圖3）。
圖3
p21相關miRNA篩選
差異miRNA靶基因GO分析得到與p21相關顯著差異條目1 112個（P＜0.05）。與GO在線數據庫中檢索得到的p21相關條目比對，與GO條目重疊50個，其中生物學過程、細胞組分、分子功能分別為35、8、7個。其中生物學過程主要在轉錄調控、DNA模板、細胞代謝過程的調控、基因表達的調控、多細胞器官發育和氮化合物代謝過程調控等方面富集（圖4A）；細胞組分主要集中在細胞核和胞內細胞器中（圖4B）；分子功能主要集中在蛋白質結合方面（圖4C）。
圖4
基于差異表達miRNA靶基因的p21相關GO通路分析氣泡圖。4A示生物學過程。1. 組織發育；2. 轉錄調控，DNA模板；3. 有絲分裂細胞周期的G1/S期轉換；4. 有絲分裂細胞周期；5. 細胞周期調控；6. 細胞周期的正向調控；7. 細胞周期的負向調控；8. 細胞周期；9. 細胞增生調控；10. 細胞增生的正向調控；11. 細胞應激反應；12. 細胞生物合成過程的正向調控；13. 細胞分化調控；14. 細胞對DNA損傷刺激的反應；15. 細胞蛋白代謝過程的正向調控；16. 細胞蛋白代謝過程的調控；17. 細胞代謝過程的正向調控；18. 細胞代謝過程的調控；19. 細胞程序性死亡的正向調控；20. 上皮細胞增生調控；21. 上皮發育；22. 器官發育；23. 節律過程；24. 基因表達的正向調控；25. 基因表達的調控；26. 多細胞器官發育；27. 氮化合物代謝過程調控；28. 蛋白磷酸化的正向調控；29. 蛋白磷酸化的調控；30. 蛋白磷酸化；31. 蛋白激酶激活調控；32. 大分子生物合成過程的正向調控；33. 催化活性調控；34. 成纖維細胞增生的正向調控；35. Ras蛋白信號轉導。4B、4C分別示細胞組分、分子功能。GO：基因注釋
差異miRNA靶基因KEGG分析得到65個顯著差異條目（P＜0.05），其中與GO數據庫中檢索得到的p21通路條目重疊13個（圖5），包括子宮內膜癌、胰腺癌、小細胞肺癌、前列腺癌、慢性粒細胞白血病、膠質細胞瘤、基底細胞癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、丙型肺炎、膀胱癌、癌癥通路、ErbB信號通路，其中最為富集的是癌癥通路。
圖5
基于差異表達miRNA靶基因的p21相關KEGG通路分析通路氣泡圖。KEGG：京都基因與基因組百科全書
3 討論
血管內皮生長因子（VEGF）是參與新生血管生成的主要刺激因子，視網膜色素上皮細胞和Müller細胞是眼內VEGF的主要來源[10]。以抗VEGF作為藥物靶點的應用在近年已取得較好臨床效果，然而僅針對這一靶點會影響生理VEGF的維持，從而導致血管異常[11] 。因此，尋找新的可靠靶點必不可少。轉錄組學作為目前發展較快、應用較多的一種生物信息分析手段，在生物醫學研究領域發揮著越來越重要的作用，通過RNA的水平來研究基因的表達情況，進而獲得可靠的生物信息[12]。本研究利用miRNA分析技術挖掘OIR模型中p21的上游調控分子，明確其上下游調控關系，初步探究p21在OIR的作用機制，為臨床治療提供一個新的基因手段。
氧誘導新生小鼠視網膜病變進而制備RNV模型已廣泛應用于病理性視網膜研究，此模型可確保新生血管的發生，并通過視網膜鋪片和HE染色得以檢驗[13]。本研究結果顯示，OIR組小鼠視網膜有明顯無灌注區，且突破ILM的血管內皮細胞核明顯增多，證實模型構建成功。
本研究通過3個主流miRNA數據庫，得到13個與p21相關miRNA。其中，miR-129-5p是唯一表達下調者。目前對其研究主要集中于腫瘤領域，涉及細胞增生、遷移以及血管生成等過程，如通過Wnt5a阻斷蛋白激酶C/細胞外信號調節激酶/核因子-κB、c-Jun氨基末端激酶通路，抑制膠質母細胞瘤增生、血管生成[14]。通過轉化生長因子-β誘導的因子同位序列2途徑抑制膠質瘤細胞增生和遷移，并使細胞有絲分裂停留在G0/G1期[15]。此外，還可經由SOX4/Wnt/β-catenin等通路抑制多種腫瘤細胞的增生[16]。主要作為細胞增生和血管形成的抑制因子存在，此與其在OIR模型中表達下調相吻合，而其與p21之間表達量的同向變化則表明兩者之間的作用可能存在其他因子的影響。除miR-129-5p外，其他miRNA在血管形成、細胞增生等方面的作用亦有研究報道，如miR-335參與結腸癌等各類腫瘤的增生、遷移過程，涉及MAPK1、ROCK1、PAX6等靶基因[17]。miR-532-5p通過靶向調節TWIST1從而抑制卵巢癌上皮細胞的增生、侵襲，并可作為卵巢癌的預后指標[18]。miRNA-224可促進 Wnt/β-catenin信號通路介導的結直腸癌細胞增生、侵襲[19]。miR-362-3p通過靶向作用于ADAMTS1抑制血管平滑肌細胞增生、遷移進而延緩動脈粥樣硬化進展[20]。由于miRNA與mRNA之間作用的復雜性，同一miRNA的表達在不同疾病或生理過程中有所不同，其具體作用亦尚無定論，但其中頻繁涉及到的通路和基因為Wnt、AKT-ERK、EGFR等，這也提示關注這些關鍵節點。
本研究共篩選到13條KEGG通路及50個GO條目與p21相關。其中，13條KEGG通路均與血管生成或細胞增生相關，且各通路所涉及的基因具有較高的重復性，包括Wnt、EGF-EGFR、FGF-FGFR、VEGF、PIK、AKT、PAK等基因家族；50個GO條目中，富集度較高的主要是細胞增生相關細胞周期相關條目，如細胞周期正向調控、CDK活性上調、對細胞周期停滯的負向調控等，均與p21作為細胞周期調控因子的作用相符。
本研究結果顯示，以p21為靶點的miRNA在OIR模型中存在表達差異，提示這些miRNA可能通過調控p21的表達而在RNV形成中發揮重要作用。然而，這些篩選出來的miRNA與P21的直接作用研究較少，本研究尚未對這些miRNA與P21的相互作用關系進行驗證。下一步我們將探究這些miRNA與P21的關系，為RNV性疾病的診斷和治療提供幫助。
