引用本文： 劉巨平, 洪亞茹, 姚旭陽, 張哲, 步紹翀, 李輝, 曹靖靖, 白小妹, 李筱榮, 東莉潔. 骨形成蛋白4促進視網膜血管內皮細胞增生和遷移. 中華眼底病雜志, 2022, 38(4): 304-309. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201109-00539 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病主要微血管并發癥之一，持續的高血糖、缺氧以及氧化應激反應均可導致視網膜血管內皮細胞（RMEC）損傷、功能障礙甚至凋亡[1-3]。我們前期研究利用RNA轉錄組分析技術，對高糖誘導下的RMEC進行轉錄組學分析，發現骨形成蛋白（BMP）4表達顯著上調[4]。BMP4是轉化生長因子（TGF）-β家族成員，在細胞增生、分化中起重要作用[5]；同時也是TGF-β亞家族BMP家族成員，參與眼部的發育過程[6]。BMP4通過與其受體結合影響SMAD9的磷酸化，并與SMAD1和SMAD5形成復合物，在轉運至細胞核的過程中與SMAD4結合，最終被轉移至細胞核激活BMP靶基因[7]。BMP4所編碼的蛋白可以與血清中絲氨酸激酶受體結合，通過BMP受體（BMPR）1和BMPR2進行信號傳導，調控血管內皮生長因子（VEGF）和細胞外基質成分的表達水平。基于氧化應激條件下TGF-β1/SMAD信號通路在導致細胞外基質代謝異常以及促進DR發病中所發揮的作用，本研究將首先明確氧化應激是否影響BMP4表達，進一步觀察BMP4對RMEC增生和遷移的影響，旨在為DR潛在的生物學治療靶點提供依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RMEC（hRMEC）由本實驗室自行保存；內皮細胞培養基（ECM，美國Science Cell公司）；噻唑藍（MTT）增生檢測試劑盒（11465007001，瑞士Roche公司）；兔源BMP4抗體（ab124715）、辣根過氧化物酶標記的二抗（ab97051）、Alexa Fluor 488標記的熒光二抗（ab150077）（英國Abcam公司）；4-羥基壬烯醛（4-HNE）（393204，美國Sigma公司）；重組人BMP4蛋白（美國R&D Systems公司）。
1.2 方法
hRMEC分為對照組、4-HNE處理組（4-HNE組）、BMP4組。ECM培養第2～6代hRMEC，待細胞密度達到80%～90%時，胰酶將細胞消化成懸液，以細胞密度103個/孔接種到96孔板中。細胞貼壁生長24 h后，4-HNE組細胞培養基加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4組細胞培養加入10 μmmol/L 4-HNE，刺激6 h后加入100 ng/ml重組人BMP4。對照組正常培養，不做任何處理。
MTT比色法檢測4-HNE、BMP4對hRMEC生存力的影響。以1×104個/ml的細胞密度將hRMEC接種于96孔板中。對照組加入110 μl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO）；4HNE組細胞采用4-HNE誘導細胞6 h后，每孔加入110 μl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl DMSO；BMP4組細胞采用4-HNE處理細胞6 h后再加入100 ng/ml重組人BMP4刺激6 h，后續處理同4-HNE處理組。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值。每組設3個復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定4-HNE、BMP4對細胞遷移能力的影響。以6×105個/ml的細胞密度將hRMEC接種于6孔板中。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用ImageJ軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
免疫熒光實驗檢測4-HNE對細胞內BMP4的表達影響。細胞培養板中每孔滴加4%多聚甲醛對細胞進行固定，時間20 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，5 min/次。加入0.1% QuickBlock?封閉液（PBSTX），孵育20 min；再次PBS洗細胞3次，5 min/次。各組細胞置于封閉液（1%牛血清白蛋白、10%山羊血清、0.3 mol/L甘氨酸）和0.1% PBSTX中封閉2 h；PBS洗細胞3次，5 min/次。加入一抗，4 ℃過夜孵育。PBS洗細胞3次，10 min/次；加入二抗孵育1 h，樣本PBS洗3次，10 min/次。加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚封片劑，熒光顯微鏡下觀察拍照。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測對照組、BMP4組細胞中纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（Laminin）、α-平滑肌收縮蛋白（α-SMA）、膠原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、VEGF、結締組織生長因子（CTGF）mRNA相對表達量以及對照組、4-HNE組細胞中 4-HNE mRNA相對表達量。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，1500 r/min離心5 min。聚合酶鏈反應（PCR）反應條件：50 ℃反應2 min，95 ℃變性10 min（1個循環）；95 ℃變性15 s，40個循環；55 ℃擴增30 s；95 ℃反應15 s；60 ℃反應15 s，95 ℃ 反應15 s。置于PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，依照公式2-ΔΔCt計算RNA相對表達量。
表1
基因擴增測序引物
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測對照組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入20 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。10%脫脂牛奶封閉，1:1 000 一抗4 ℃孵育24 h（GAPDH 作為陽性對照），PBS洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復5次； 加入化學發光劑，暗室曝光。
1.3 統計學處理
采用SPSS 22.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
）表示。兩組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
對照組、4-HNE組、BMP4組細胞生存力分別為0.767、1.367 、1.533 ；4-HNE組、BMP4組細胞生存力較對照組明顯提高，差異有統計學意義（t=12.73、16.26，P=0.000 2、<0.000 1）。細胞培養12 h后，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組、BMP4組可見大量細胞遷移進入裸區（圖1）。對照組、4-HNE組、BMP4組細胞遷移率分別為（0.176 7±0.003 333）%、（0.386 7±0.006 667）%、（0.353 3±0.003 333）%，4-HNE組、BMP4組細胞遷移率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=28.17、37.48，P＜0.000 1、＜0.000 1）。
圖1
三組細胞遷移率比較（n=3）。1A、1B、1C分別示對照組、4-HNE組、BMP4組細胞培養0 h；1D、1E、1F分別示對照組、4-HNE組、BMP4組細胞培養12 h。對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組、BMP4組可見大量細胞遷移進入裸區。標尺：200 μm。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白
熒光顯微鏡觀察發現，4-HNE組細胞中BMP4蛋白呈陽性表達（圖2）。對照組、4-HNE組細胞4-HNE表達比較，差異有統計學意義（t=8.886，P=0.009）。與對照組比較，4-HNE組細胞中BMP4 mRNA（t=16.36，P=0.000 1）、蛋白（t=69.35，P＜0.000 1）相對表達量升高，差異均有統計學意義（圖3）。
圖2
兩組細胞熒光顯微鏡像。2A示對照組，胞質抗體染色呈現熒光綠色，核染藍色；2B示4-HNE組，胞質抗體染色綠色熒光明顯增多 BMP4+DAPI 標尺：50 μm。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
圖3
兩組細胞中BMP4蛋白表達情況（n=3）。3A示電泳圖；3B示對照組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白表達比較。****P<0.000 1。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，BMP4組細胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（t=10.61、17.00、14.85、7.78、12.02、10.61，P=0.000 4、＜0.000 1、0.000 1、0.001 5、0.000 1、0.0004）（圖4）。
圖4
對照組、BMP4組細胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相對表達量比較（n=3）。與對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。FN：纖維連接蛋白；Laminin：層粘連蛋白；α-SMA：α-平滑肌收縮蛋白；Collagen Ⅰ：膠原蛋白Ⅰ型；VEGF：血管內皮生長因子；CTGF：結締組織生長因子
3 討論
目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是治療DR的一線方法，但可能存在促進纖維膜形成等并發癥。因此，探索DR新的治療靶點和治療方法刻不容緩[8]。
大量研究表明，氧化應激在DR發病機制中起重要作用[9-10]，其主要產物為活性氧，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等。這些自由基和過氧化物可以攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，進而形成多種醛。4-HNE是脂質過氧化過程中的主要產物，為一種αβ不飽和醛，高濃度4-HNE可與巰基化合物、DNA、蛋白質、磷脂等親核物質發生反應，引起細胞功能障礙，導致細胞損傷，進而導致疾病[11]。另一方面，低濃度4-HNE也是一種調節多種細胞信號通路和基因表達的生物活性分子，參與細胞增生、壞死和凋亡等[12-13]。此外，4-HNE作為脂質過氧化的主要產物，已成為脂質過氧化/氧化應激的重要標志，在誘導細胞氧化應激或凋亡的實驗研究中被廣泛應用。本研究中我們采用MTT細胞增生實驗、細胞劃痕實驗證明了4-HNE對hRMEC的影響，因此我們應用了4-HNE誘導視網膜多種細胞以模擬DR細胞的氧化應激微環境。
單純的抗VEGF藥物治療DR，可能會伴發纖維膜的生成，所以探究具有雙靶點的基因是我們研究的重點。既往研究證實，BMP4可保護雞視網膜Müller膠質細胞，促進黑色素瘤和平滑肌細胞的侵襲和遷移[14-15]，調節ARPE-19細胞和斑馬魚胚胎中VEGF基因的轉錄和分泌，促進腎纖維化[16-17]。并且，BMP4可顯著增加成纖維細胞的膠原生成，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。在多種細胞中，BMP4的高表達顯著上調細胞外成分，包括FN、纖溶酶原激活物抑制劑-1、膠原蛋白和血小板反應蛋白1。為進一步研究BMP4的分布和表達，我們在體外成功構建了DR細胞模型即4-HNE處理細胞模型。由于DR主要是一種血管疾病，我們首先觀察了BMP4在hRMEC中的表達，通過PCR、Western blot和免疫熒光實驗檢測到hRMEC細胞模型中BMP4高表達。鑒于BMP4能夠促進VEGF的表達，同時作為TGF-β家族的一員，BMP4能夠促進下游纖維化相關因子的表達，我們觀察到BMP4對視網膜血管內皮細胞的增生及遷移產生了促進作用，并同時通過PCR檢測到BMP4在DR細胞模型中能夠促進VEGF以及纖維化相關因子的表達。有關BMP4的機制研究指出，BMP4可通過與BMP激活的SMAD結合元件結合，以劑量和時間依賴方式增加VEGF的分泌[18]。BMP影響R-SMAD （SMAD1、SMAD5、SMAD9）的磷酸化，與SMAD4形成復合物，最終激活BMP靶基因[19]。
視網膜新生血管和纖維化膜是增生型DR（PDR）的標志。抗VEGF藥物因其在新生血管和滲出性病變中的顯著作用，逐漸成為PDR治療的有效輔助手段。但大量研究發現，抗VEGF藥物治療可導致纖維化因子表達增加，加重纖維化過程[20-22]。這表明新生血管和纖維化在DR治療中同等重要。近年來，有學者提出應用雙靶點治療DR的思路，即抑制新生血管以及抑制纖維化在DR的治療中同等重要[22-23]。我們之前通過RNA轉錄組測序分析高糖水平影響視網膜血管內皮細胞的機制，發現BMP4可能是DR雙靶治療（抗VEGF藥物和抗纖維化）的潛在靶點，并且我們發現BMP4在細胞氧化應激方面有重要作用[24-25]。結合本研究結果發現，BMP4不但可以影響CTGF和VEGF的表達，而且另一重要優點是BMP4還可影響其他纖維化相關因子的表達，如FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ。這提示通過拮抗BMP4可能在DR治療起著重要且全面的作用，BMP4可以促進VEGF以及纖維化相關因子的表達，這是本研究的創新性發現。
本研究的局限性在于僅驗證了BMP4對hRMEC的增生和遷移作用，未進行細胞管腔實驗直接證明BMP4促進新生血管的作用。今后研究將補充實驗，提高其完整度；同時還應重點著眼于BMP4對于DR致病的機制研究。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病主要微血管并發癥之一，持續的高血糖、缺氧以及氧化應激反應均可導致視網膜血管內皮細胞（RMEC）損傷、功能障礙甚至凋亡[1-3]。我們前期研究利用RNA轉錄組分析技術，對高糖誘導下的RMEC進行轉錄組學分析，發現骨形成蛋白（BMP）4表達顯著上調[4]。BMP4是轉化生長因子（TGF）-β家族成員，在細胞增生、分化中起重要作用[5]；同時也是TGF-β亞家族BMP家族成員，參與眼部的發育過程[6]。BMP4通過與其受體結合影響SMAD9的磷酸化，并與SMAD1和SMAD5形成復合物，在轉運至細胞核的過程中與SMAD4結合，最終被轉移至細胞核激活BMP靶基因[7]。BMP4所編碼的蛋白可以與血清中絲氨酸激酶受體結合，通過BMP受體（BMPR）1和BMPR2進行信號傳導，調控血管內皮生長因子（VEGF）和細胞外基質成分的表達水平。基于氧化應激條件下TGF-β1/SMAD信號通路在導致細胞外基質代謝異常以及促進DR發病中所發揮的作用，本研究將首先明確氧化應激是否影響BMP4表達，進一步觀察BMP4對RMEC增生和遷移的影響，旨在為DR潛在的生物學治療靶點提供依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RMEC（hRMEC）由本實驗室自行保存；內皮細胞培養基（ECM，美國Science Cell公司）；噻唑藍（MTT）增生檢測試劑盒（11465007001，瑞士Roche公司）；兔源BMP4抗體（ab124715）、辣根過氧化物酶標記的二抗（ab97051）、Alexa Fluor 488標記的熒光二抗（ab150077）（英國Abcam公司）；4-羥基壬烯醛（4-HNE）（393204，美國Sigma公司）；重組人BMP4蛋白（美國R&D Systems公司）。
1.2 方法
hRMEC分為對照組、4-HNE處理組（4-HNE組）、BMP4組。ECM培養第2～6代hRMEC，待細胞密度達到80%～90%時，胰酶將細胞消化成懸液，以細胞密度103個/孔接種到96孔板中。細胞貼壁生長24 h后，4-HNE組細胞培養基加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4組細胞培養加入10 μmmol/L 4-HNE，刺激6 h后加入100 ng/ml重組人BMP4。對照組正常培養，不做任何處理。
MTT比色法檢測4-HNE、BMP4對hRMEC生存力的影響。以1×104個/ml的細胞密度將hRMEC接種于96孔板中。對照組加入110 μl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO）；4HNE組細胞采用4-HNE誘導細胞6 h后，每孔加入110 μl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl DMSO；BMP4組細胞采用4-HNE處理細胞6 h后再加入100 ng/ml重組人BMP4刺激6 h，后續處理同4-HNE處理組。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值。每組設3個復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定4-HNE、BMP4對細胞遷移能力的影響。以6×105個/ml的細胞密度將hRMEC接種于6孔板中。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用ImageJ軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
免疫熒光實驗檢測4-HNE對細胞內BMP4的表達影響。細胞培養板中每孔滴加4%多聚甲醛對細胞進行固定，時間20 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞3次，5 min/次。加入0.1% QuickBlock?封閉液（PBSTX），孵育20 min；再次PBS洗細胞3次，5 min/次。各組細胞置于封閉液（1%牛血清白蛋白、10%山羊血清、0.3 mol/L甘氨酸）和0.1% PBSTX中封閉2 h；PBS洗細胞3次，5 min/次。加入一抗，4 ℃過夜孵育。PBS洗細胞3次，10 min/次；加入二抗孵育1 h，樣本PBS洗3次，10 min/次。加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚封片劑，熒光顯微鏡下觀察拍照。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測對照組、BMP4組細胞中纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（Laminin）、α-平滑肌收縮蛋白（α-SMA）、膠原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、VEGF、結締組織生長因子（CTGF）mRNA相對表達量以及對照組、4-HNE組細胞中 4-HNE mRNA相對表達量。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，1500 r/min離心5 min。聚合酶鏈反應（PCR）反應條件：50 ℃反應2 min，95 ℃變性10 min（1個循環）；95 ℃變性15 s，40個循環；55 ℃擴增30 s；95 ℃反應15 s；60 ℃反應15 s，95 ℃ 反應15 s。置于PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參，依照公式2-ΔΔCt計算RNA相對表達量。
表1
基因擴增測序引物
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測對照組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入20 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。10%脫脂牛奶封閉，1:1 000 一抗4 ℃孵育24 h（GAPDH 作為陽性對照），PBS洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重復5次； 加入化學發光劑，暗室曝光。
1.3 統計學處理
采用SPSS 22.0軟件行統計學分析。計量數據以均數±標準差（）表示。兩組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
對照組、4-HNE組、BMP4組細胞生存力分別為0.767、1.367 、1.533 ；4-HNE組、BMP4組細胞生存力較對照組明顯提高，差異有統計學意義（t=12.73、16.26，P=0.000 2、<0.000 1）。細胞培養12 h后，對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組、BMP4組可見大量細胞遷移進入裸區（圖1）。對照組、4-HNE組、BMP4組細胞遷移率分別為（0.176 7±0.003 333）%、（0.386 7±0.006 667）%、（0.353 3±0.003 333）%，4-HNE組、BMP4組細胞遷移率較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=28.17、37.48，P＜0.000 1、＜0.000 1）。
圖1
三組細胞遷移率比較（n=3）。1A、1B、1C分別示對照組、4-HNE組、BMP4組細胞培養0 h；1D、1E、1F分別示對照組、4-HNE組、BMP4組細胞培養12 h。對照組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組、BMP4組可見大量細胞遷移進入裸區。標尺：200 μm。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白
熒光顯微鏡觀察發現，4-HNE組細胞中BMP4蛋白呈陽性表達（圖2）。對照組、4-HNE組細胞4-HNE表達比較，差異有統計學意義（t=8.886，P=0.009）。與對照組比較，4-HNE組細胞中BMP4 mRNA（t=16.36，P=0.000 1）、蛋白（t=69.35，P＜0.000 1）相對表達量升高，差異均有統計學意義（圖3）。
圖2
兩組細胞熒光顯微鏡像。2A示對照組，胞質抗體染色呈現熒光綠色，核染藍色；2B示4-HNE組，胞質抗體染色綠色熒光明顯增多 BMP4+DAPI 標尺：50 μm。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
圖3
兩組細胞中BMP4蛋白表達情況（n=3）。3A示電泳圖；3B示對照組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白表達比較。****P<0.000 1。HNE：羥基壬烯醛；BMP：骨形成蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，BMP4組細胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（t=10.61、17.00、14.85、7.78、12.02、10.61，P=0.000 4、＜0.000 1、0.000 1、0.001 5、0.000 1、0.0004）（圖4）。
圖4
對照組、BMP4組細胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相對表達量比較（n=3）。與對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1。FN：纖維連接蛋白；Laminin：層粘連蛋白；α-SMA：α-平滑肌收縮蛋白；Collagen Ⅰ：膠原蛋白Ⅰ型；VEGF：血管內皮生長因子；CTGF：結締組織生長因子
3 討論
目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是治療DR的一線方法，但可能存在促進纖維膜形成等并發癥。因此，探索DR新的治療靶點和治療方法刻不容緩[8]。
大量研究表明，氧化應激在DR發病機制中起重要作用[9-10]，其主要產物為活性氧，如超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基等。這些自由基和過氧化物可以攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，進而形成多種醛。4-HNE是脂質過氧化過程中的主要產物，為一種αβ不飽和醛，高濃度4-HNE可與巰基化合物、DNA、蛋白質、磷脂等親核物質發生反應，引起細胞功能障礙，導致細胞損傷，進而導致疾病[11]。另一方面，低濃度4-HNE也是一種調節多種細胞信號通路和基因表達的生物活性分子，參與細胞增生、壞死和凋亡等[12-13]。此外，4-HNE作為脂質過氧化的主要產物，已成為脂質過氧化/氧化應激的重要標志，在誘導細胞氧化應激或凋亡的實驗研究中被廣泛應用。本研究中我們采用MTT細胞增生實驗、細胞劃痕實驗證明了4-HNE對hRMEC的影響，因此我們應用了4-HNE誘導視網膜多種細胞以模擬DR細胞的氧化應激微環境。
單純的抗VEGF藥物治療DR，可能會伴發纖維膜的生成，所以探究具有雙靶點的基因是我們研究的重點。既往研究證實，BMP4可保護雞視網膜Müller膠質細胞，促進黑色素瘤和平滑肌細胞的侵襲和遷移[14-15]，調節ARPE-19細胞和斑馬魚胚胎中VEGF基因的轉錄和分泌，促進腎纖維化[16-17]。并且，BMP4可顯著增加成纖維細胞的膠原生成，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。在多種細胞中，BMP4的高表達顯著上調細胞外成分，包括FN、纖溶酶原激活物抑制劑-1、膠原蛋白和血小板反應蛋白1。為進一步研究BMP4的分布和表達，我們在體外成功構建了DR細胞模型即4-HNE處理細胞模型。由于DR主要是一種血管疾病，我們首先觀察了BMP4在hRMEC中的表達，通過PCR、Western blot和免疫熒光實驗檢測到hRMEC細胞模型中BMP4高表達。鑒于BMP4能夠促進VEGF的表達，同時作為TGF-β家族的一員，BMP4能夠促進下游纖維化相關因子的表達，我們觀察到BMP4對視網膜血管內皮細胞的增生及遷移產生了促進作用，并同時通過PCR檢測到BMP4在DR細胞模型中能夠促進VEGF以及纖維化相關因子的表達。有關BMP4的機制研究指出，BMP4可通過與BMP激活的SMAD結合元件結合，以劑量和時間依賴方式增加VEGF的分泌[18]。BMP影響R-SMAD （SMAD1、SMAD5、SMAD9）的磷酸化，與SMAD4形成復合物，最終激活BMP靶基因[19]。
視網膜新生血管和纖維化膜是增生型DR（PDR）的標志。抗VEGF藥物因其在新生血管和滲出性病變中的顯著作用，逐漸成為PDR治療的有效輔助手段。但大量研究發現，抗VEGF藥物治療可導致纖維化因子表達增加，加重纖維化過程[20-22]。這表明新生血管和纖維化在DR治療中同等重要。近年來，有學者提出應用雙靶點治療DR的思路，即抑制新生血管以及抑制纖維化在DR的治療中同等重要[22-23]。我們之前通過RNA轉錄組測序分析高糖水平影響視網膜血管內皮細胞的機制，發現BMP4可能是DR雙靶治療（抗VEGF藥物和抗纖維化）的潛在靶點，并且我們發現BMP4在細胞氧化應激方面有重要作用[24-25]。結合本研究結果發現，BMP4不但可以影響CTGF和VEGF的表達，而且另一重要優點是BMP4還可影響其他纖維化相關因子的表達，如FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ。這提示通過拮抗BMP4可能在DR治療起著重要且全面的作用，BMP4可以促進VEGF以及纖維化相關因子的表達，這是本研究的創新性發現。
本研究的局限性在于僅驗證了BMP4對hRMEC的增生和遷移作用，未進行細胞管腔實驗直接證明BMP4促進新生血管的作用。今后研究將補充實驗，提高其完整度；同時還應重點著眼于BMP4對于DR致病的機制研究。
