引用本文： 王詩園, 張翔, 彭婕, 胡毅倩, 趙培泉. CRB1突變型Leber先天性黑矇和早發視網膜萎縮患兒基因型與表型特征研究. 中華眼底病雜志, 2021, 37(4): 284-289. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200929-00478 復制
Leber先天性黑矇（LCA）和早發視網膜萎縮（EOSRD）為臨床罕見嚴重遺傳性視網膜疾病，是兒童致盲的重要原因之一[1]。目前已發現與LCA、EOSRD相關的致病基因25個（www.sph.uth.edu），即CRX、IMPDH1、OTX2、AIPL1、CABP4、CCT2、CEP290、CLUAP1、CRB1,DTHD1、GDF6、GUCY2D、IFT140、IQCB1、KCNJ13、LCA5、LRAT、NMNAT1、PRPH2、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1。其中，CRB1不同于其他致病基因的表型，如小動脈旁視網膜色素上皮保留（PPRPE）、Coats樣滲出、黃斑病變等易與其他眼底疾病相混淆[2]。本研究團隊既往報道CRB1突變約占到所有LCA致病基因的10%[3]。因此，對CRB1突變型LCA和EOSRD進行研究，有助于更全面認識兒童視網膜疾病，提高診斷效率。但目前針對CRB1突變研究主要集中于國外文獻[4-6]，國內研究相對空白。本研究對一組大樣本LCA和EOSRD患兒的臨床資料進行分析，初步探索國內CRB1突變患者的基因型與表型特征，為相關臨床診治提供參考。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。監護人均獲知情并簽署書面同意書。
2013年1月至2019年12月于上海交通大學醫學院附屬新華醫院眼科臨床及基因診斷的CRB1突變LCA和EOSRD患兒10例納入本研究。
參照文獻[1]的標準確立LCA/EOSRD診斷標準。LCA：出生或1歲內出現嚴重視力受損，包括眼球震顫、無固視、不追光；視網膜電圖（ERG）波形平坦呈熄滅型。EOSRD：1～5歲出現畏光、夜盲，視力無光感～＜0.3；ERG明暗適應波形平坦或重度下降。基因診斷標準：二代測序及致病性分析為CRB1基因突變，并經一代驗證及家系共分離分析予以明確。排除標準：除LCA/EOSRD外其他先天性眼部疾患，如早產兒視網膜病變、先天性青光眼、家族性滲出性玻璃體視網膜病變等；疑似系統性綜合征，如聽力、前庭功能、智力、肌張力以及肝腎功能、血糖等異常。
患兒均行視力、屈光度、裂隙燈顯微鏡、全視野ERG檢查。同時行眼底彩色照相、光相干斷層掃描（OCT）檢查分別為7、6例；熒光素眼底血管造影（FFA）檢查1例。視力檢查采用標準對數視力表進行；眼底檢查采用兒童廣角數碼視網膜成像系統或英國Optos公司 200Tx激光掃描檢眼鏡（UWF SLO）進行；FFA檢查采用德國海德堡公司Spectralis HRA儀進行；OCT檢查采用美國Optovue公司AngioVue OCT血管成像儀進行。
2 結果
10例患兒中，LCA 6例，EOSRD 4例。男性5例，女性5例；首次就診年齡6個月～5歲，平均年齡3.61歲。視力不追光～＜0.3；屈光度+1.50～+4.25 D，平均屈光度+3.03 D。夜盲、斜視、眼球震顫、指壓眼球分別為4、2、3、2例。ERG明暗適應波形平坦6例，重度下降4例。成功檢測到致病性突變位點19個，其中新發現突變位點9個。純合突變1例，復合雜合突變9例（表1）。
表1
10例CRB1突變患兒基因型與表型主要特征
患兒中，眼底視網膜呈“銅錢”樣（圖1A，1B）、“椒鹽”樣（圖1C）、“骨細胞”樣（圖1D）色素改變分別為4、2、1例，“結晶”樣色素改變（圖1E）1例，黃斑區色素瘢痕（圖1F）2例。行UWF SLO檢查的7例，眼底中周部均可見不同程度PPRPE（圖1C～1E）（表2）。對稱性黃斑囊樣水腫（圖1G）、黃斑區劈裂樣囊變（圖1D）以及單眼黃斑前膜與視盤及黃斑區粘連（圖1E）各1例。視盤邊界欠清楚，視網膜污穢，層間色素變動（圖1H）1例。
圖1
CRB1基因突變LCA/EOSRD患兒彩色眼底像。1A示中周部青灰色“銅錢”樣色素印記；1B示“銅錢”樣色素沉著累及黃斑；1C示視網膜“椒鹽”樣色素改變，中周部PPRPE（白箭）存在，視盤顏色蠟黃；1D示周邊“骨細胞”樣色素沉著，PPRPE（白箭）存在；1E示周邊“結晶”樣色素改變（白箭頭），PPRPE（白箭）存在，后極部致密增生膜累及視盤和黃斑區，玻璃體腔混濁團塊與視盤粘連，增生膜牽拉血管扭曲；1F示黃斑區色素瘢痕；1G示PPRPE（白箭），黃斑囊樣水腫，黃斑區色素增生沉著；1H示視盤邊界欠清，視網膜色素改變，層間色素變動
表2
CRB1基因突變LCA/EOSRD患兒眼底、OCT檢查結果
行OCT檢查的6例中，玻璃體混濁，視盤處粘連隆起4例。所有患者視網膜外層萎縮，橢圓體帶缺失（表2）。其中，視網膜結構粗糙增厚，中心凹變薄（圖2A）3例；雙眼對稱性黃斑水腫（圖2B）1例；雙眼黃斑層間對稱性劈裂樣囊變，似于輕度層間水腫（圖2C）1例；右眼后極部致密增生膜與視盤及黃斑區粘連，視網膜增厚結構紊亂，玻璃體混濁（圖2D）1例。行FFA檢查1例，患眼視網膜色素改變，層間色素變動，晚期視盤熒光素染色，黃斑區熒光素積聚，各象限沿血管走形呈彌漫性強熒光，周邊PPRPE呈“霜枝”樣強熒光（圖3）， 呈類葡萄膜炎改變。
圖3
CRB1基因突變Leber先天性黑矇/早發視網膜萎縮患兒熒光素眼底血管造影晚期像。3A~3C分別示顳側、后極部、鼻側，視盤熒光素滲漏，黃斑區熒光素積聚，各象限沿血管走形呈彌漫性強熒光，周邊呈“霜枝”樣改變
3 討論
CRB1基因定位于1q31.3染色體，主要表達于視網膜和大腦，在視網膜上作為一種大跨膜蛋白表達于光感受器細胞內節以及Müller細胞的外叢狀層[7]。目前已檢測到200多個致病位點，同一個致病位點可導致不同眼底表現，輕重程度差異較大[5]。在幼兒中可導致EOSRD以及更嚴重的LCA。既往文獻報道，CRB1突變約占常染色體隱性遺傳LCA的7%～17%，占常染色體隱性遺傳EOSRD的3%～9%[7]。本組98例經臨床和基因檢測篩選診斷為LCA/EOSRD的患者中，CRB1突變占10.2%（10/98），與既往研究結果相符[7]。10例患者中9例為復合雜合突變，遺傳方式復雜且基因型各不相同，突變位點分布廣泛。本組患兒檢測到的19個突變位點中，9個位點為本研究團隊首次報道[3]。這提示與國外研究比較，國內CRB1突變整體所占致病基因的比例基本相符，但各基因型突變頻譜差別較大。Mathijssen等[4]報道多例歐洲特定地域人群中CRB1（c.3122T＞C p.Met1041Thr）純合突變患者，但本組患兒未檢測到該位點突變，進一步提示各種族地域CRB1突變頻譜差異大，中國人群有自身的遺傳特點。
CRB1基因突變患者眼底色素改變多樣，以“骨細胞”樣改變多見，出現特征性“銅錢”樣形態[8]。本研究結果顯示，10例患者中“銅錢”樣、“椒鹽”樣、“骨細胞”樣色素改變分別為4、2、1例，“結晶”樣色素改變1例，黃斑區色素瘢痕2例。值得注意的是CRB1突變另一特殊色素改變PPRPE。Heckenlively[9]于1982年首次詳細報道了PPRPE的形態，認為此形態主要存在于視網膜色素變性（RP）患者小動脈旁或者小動脈下。den Hollander等[10]在27例伴有PPRPE的RP患者中，20例檢測到CRB1致病突變。但另有研究結果顯示CRB1突變可不伴有PPRPE[11]。我們認為出現上述結果的差異主要受限于當時的基因檢測技術及傳統眼底彩色照相的成像技術。本研究采用UWF SLO行眼底彩色照相的7例患兒均可見PPRPE。UWF SLO可清晰顯示傳統眼底彩色照相不易發現的PPRPE，顯著提高檢出率。其原因可能是PPRPE多為視網膜層間的色素變動，在穿透性更強的激光掃描下顯示更為清晰。因此，臨床中疑似色素變性類疾病患者，應用UWF SLO可以提高層間色素變動的檢出率。隨著基因檢測技術和多模式影像技術的發展，CRB1突變與PPRPE的基因型與表型關系會更為緊密。
本組3例患兒黃斑區存在特殊表現，其中對稱性黃斑水腫、黃斑區劈裂樣囊變以及單眼黃斑前膜各1例。CRB1突變患者黃斑囊腔樣改變既往已有文獻報道，可伴或不伴熒光素滲漏[5, 12-13]。結合本研究觀察，滲漏可能主要為黃斑水腫所致，不伴滲漏主要以劈裂形態存在。Mucciolo等[6]長期隨訪發現，CRB1突變患者可出現黃斑劈裂向黃斑水腫演變，最后出現黃斑萎縮。結合本研究結果，我們推測這些特殊表型可能是病變不同階段的表現。既往研究報道，一近親結婚家庭中3名子代患者均存在黃斑劈裂樣改變，經ERG及基因檢測，1例為CRB1突變引起，2例為RS1突變引起的X-連鎖視網膜劈裂，其母親為CRB1和RS1兩種基因的攜帶者[14]。這提示臨床上對于黃斑劈裂樣改變還需考慮CRB1突變可能，ERG檢查對于鑒別診斷至關重要，結合CRB1和RS1基因的快速檢測能夠幫助我們明確診斷。Murro等[15]曾報道1例CRB1突變型黃斑水腫誤診為葡萄膜炎的病例，本研究中1例患兒FFA檢查顯示黃斑區熒光素積聚，晚期視盤著染，周邊PPRPE顯示“霜枝”樣強熒光，類似葡萄膜炎樣反應，而在另外黃斑前膜患兒中探及到明顯的玻璃體混濁，與黃斑及視盤處粘連。據此我們認為，對于有類葡萄膜炎樣表現的患兒需要加強去偽鑒別，電生理及基因檢測非常重要。
CRB1主要表達于光感受器細胞內節以維持細胞的極性和細胞間的粘連，而多數CRB1突變患者存在視網膜結構層次紊亂[7-10]。因此，我們推測CRB1基因突變可能導致細胞的重新排列，以致視網膜增厚，但各層結構缺乏呈現出不成熟的視網膜。有研究發現，CRB2作為CRB家族中的一員參與CRB1調控，CRB2的丟失加重CRB1相關RP樣表型向LCA樣表型發展[7, 16]。Tsang等[17]在CRB1突變患者中檢測到其他可能起修飾作用的基因。因此，我們推測CRB1可能存在一個基因修飾調控網絡，共同作用導致各種特殊表型的出現，但有待于進一步功能驗證。
CRB1基因治療的最佳窗口期是生命最初二三十年[5]，早期正確診斷非常重要。鑒于其特殊表型易與其他兒童眼底病相混淆，臨床需加強多模式影像檢查，同時結合ERG和基因檢測以提高診斷效率。由于CRB1突變患者臨床罕見，本研究納入病例數較少，其特征規律有待于更多樣本量及更長隨訪時間的深入研究加以驗證和探討。
Leber先天性黑矇（LCA）和早發視網膜萎縮（EOSRD）為臨床罕見嚴重遺傳性視網膜疾病，是兒童致盲的重要原因之一[1]。目前已發現與LCA、EOSRD相關的致病基因25個（www.sph.uth.edu），即CRX、IMPDH1、OTX2、AIPL1、CABP4、CCT2、CEP290、CLUAP1、CRB1,DTHD1、GDF6、GUCY2D、IFT140、IQCB1、KCNJ13、LCA5、LRAT、NMNAT1、PRPH2、RD3、RDH12、RPE65、RPGRIP1、SPATA7、TULP1。其中，CRB1不同于其他致病基因的表型，如小動脈旁視網膜色素上皮保留（PPRPE）、Coats樣滲出、黃斑病變等易與其他眼底疾病相混淆[2]。本研究團隊既往報道CRB1突變約占到所有LCA致病基因的10%[3]。因此，對CRB1突變型LCA和EOSRD進行研究，有助于更全面認識兒童視網膜疾病，提高診斷效率。但目前針對CRB1突變研究主要集中于國外文獻[4-6]，國內研究相對空白。本研究對一組大樣本LCA和EOSRD患兒的臨床資料進行分析，初步探索國內CRB1突變患者的基因型與表型特征，為相關臨床診治提供參考。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。監護人均獲知情并簽署書面同意書。
2013年1月至2019年12月于上海交通大學醫學院附屬新華醫院眼科臨床及基因診斷的CRB1突變LCA和EOSRD患兒10例納入本研究。
參照文獻[1]的標準確立LCA/EOSRD診斷標準。LCA：出生或1歲內出現嚴重視力受損，包括眼球震顫、無固視、不追光；視網膜電圖（ERG）波形平坦呈熄滅型。EOSRD：1～5歲出現畏光、夜盲，視力無光感～＜0.3；ERG明暗適應波形平坦或重度下降。基因診斷標準：二代測序及致病性分析為CRB1基因突變，并經一代驗證及家系共分離分析予以明確。排除標準：除LCA/EOSRD外其他先天性眼部疾患，如早產兒視網膜病變、先天性青光眼、家族性滲出性玻璃體視網膜病變等；疑似系統性綜合征，如聽力、前庭功能、智力、肌張力以及肝腎功能、血糖等異常。
患兒均行視力、屈光度、裂隙燈顯微鏡、全視野ERG檢查。同時行眼底彩色照相、光相干斷層掃描（OCT）檢查分別為7、6例；熒光素眼底血管造影（FFA）檢查1例。視力檢查采用標準對數視力表進行；眼底檢查采用兒童廣角數碼視網膜成像系統或英國Optos公司 200Tx激光掃描檢眼鏡（UWF SLO）進行；FFA檢查采用德國海德堡公司Spectralis HRA儀進行；OCT檢查采用美國Optovue公司AngioVue OCT血管成像儀進行。
2 結果
10例患兒中，LCA 6例，EOSRD 4例。男性5例，女性5例；首次就診年齡6個月～5歲，平均年齡3.61歲。視力不追光～＜0.3；屈光度+1.50～+4.25 D，平均屈光度+3.03 D。夜盲、斜視、眼球震顫、指壓眼球分別為4、2、3、2例。ERG明暗適應波形平坦6例，重度下降4例。成功檢測到致病性突變位點19個，其中新發現突變位點9個。純合突變1例，復合雜合突變9例（表1）。
表1
10例CRB1突變患兒基因型與表型主要特征
患兒中，眼底視網膜呈“銅錢”樣（圖1A，1B）、“椒鹽”樣（圖1C）、“骨細胞”樣（圖1D）色素改變分別為4、2、1例，“結晶”樣色素改變（圖1E）1例，黃斑區色素瘢痕（圖1F）2例。行UWF SLO檢查的7例，眼底中周部均可見不同程度PPRPE（圖1C～1E）（表2）。對稱性黃斑囊樣水腫（圖1G）、黃斑區劈裂樣囊變（圖1D）以及單眼黃斑前膜與視盤及黃斑區粘連（圖1E）各1例。視盤邊界欠清楚，視網膜污穢，層間色素變動（圖1H）1例。
圖1
CRB1基因突變LCA/EOSRD患兒彩色眼底像。1A示中周部青灰色“銅錢”樣色素印記；1B示“銅錢”樣色素沉著累及黃斑；1C示視網膜“椒鹽”樣色素改變，中周部PPRPE（白箭）存在，視盤顏色蠟黃；1D示周邊“骨細胞”樣色素沉著，PPRPE（白箭）存在；1E示周邊“結晶”樣色素改變（白箭頭），PPRPE（白箭）存在，后極部致密增生膜累及視盤和黃斑區，玻璃體腔混濁團塊與視盤粘連，增生膜牽拉血管扭曲；1F示黃斑區色素瘢痕；1G示PPRPE（白箭），黃斑囊樣水腫，黃斑區色素增生沉著；1H示視盤邊界欠清，視網膜色素改變，層間色素變動
表2
CRB1基因突變LCA/EOSRD患兒眼底、OCT檢查結果
行OCT檢查的6例中，玻璃體混濁，視盤處粘連隆起4例。所有患者視網膜外層萎縮，橢圓體帶缺失（表2）。其中，視網膜結構粗糙增厚，中心凹變薄（圖2A）3例；雙眼對稱性黃斑水腫（圖2B）1例；雙眼黃斑層間對稱性劈裂樣囊變，似于輕度層間水腫（圖2C）1例；右眼后極部致密增生膜與視盤及黃斑區粘連，視網膜增厚結構紊亂，玻璃體混濁（圖2D）1例。行FFA檢查1例，患眼視網膜色素改變，層間色素變動，晚期視盤熒光素染色，黃斑區熒光素積聚，各象限沿血管走形呈彌漫性強熒光，周邊PPRPE呈“霜枝”樣強熒光（圖3）， 呈類葡萄膜炎改變。
圖3
CRB1基因突變Leber先天性黑矇/早發視網膜萎縮患兒熒光素眼底血管造影晚期像。3A~3C分別示顳側、后極部、鼻側，視盤熒光素滲漏，黃斑區熒光素積聚，各象限沿血管走形呈彌漫性強熒光，周邊呈“霜枝”樣改變
3 討論
CRB1基因定位于1q31.3染色體，主要表達于視網膜和大腦，在視網膜上作為一種大跨膜蛋白表達于光感受器細胞內節以及Müller細胞的外叢狀層[7]。目前已檢測到200多個致病位點，同一個致病位點可導致不同眼底表現，輕重程度差異較大[5]。在幼兒中可導致EOSRD以及更嚴重的LCA。既往文獻報道，CRB1突變約占常染色體隱性遺傳LCA的7%～17%，占常染色體隱性遺傳EOSRD的3%～9%[7]。本組98例經臨床和基因檢測篩選診斷為LCA/EOSRD的患者中，CRB1突變占10.2%（10/98），與既往研究結果相符[7]。10例患者中9例為復合雜合突變，遺傳方式復雜且基因型各不相同，突變位點分布廣泛。本組患兒檢測到的19個突變位點中，9個位點為本研究團隊首次報道[3]。這提示與國外研究比較，國內CRB1突變整體所占致病基因的比例基本相符，但各基因型突變頻譜差別較大。Mathijssen等[4]報道多例歐洲特定地域人群中CRB1（c.3122T＞C p.Met1041Thr）純合突變患者，但本組患兒未檢測到該位點突變，進一步提示各種族地域CRB1突變頻譜差異大，中國人群有自身的遺傳特點。
CRB1基因突變患者眼底色素改變多樣，以“骨細胞”樣改變多見，出現特征性“銅錢”樣形態[8]。本研究結果顯示，10例患者中“銅錢”樣、“椒鹽”樣、“骨細胞”樣色素改變分別為4、2、1例，“結晶”樣色素改變1例，黃斑區色素瘢痕2例。值得注意的是CRB1突變另一特殊色素改變PPRPE。Heckenlively[9]于1982年首次詳細報道了PPRPE的形態，認為此形態主要存在于視網膜色素變性（RP）患者小動脈旁或者小動脈下。den Hollander等[10]在27例伴有PPRPE的RP患者中，20例檢測到CRB1致病突變。但另有研究結果顯示CRB1突變可不伴有PPRPE[11]。我們認為出現上述結果的差異主要受限于當時的基因檢測技術及傳統眼底彩色照相的成像技術。本研究采用UWF SLO行眼底彩色照相的7例患兒均可見PPRPE。UWF SLO可清晰顯示傳統眼底彩色照相不易發現的PPRPE，顯著提高檢出率。其原因可能是PPRPE多為視網膜層間的色素變動，在穿透性更強的激光掃描下顯示更為清晰。因此，臨床中疑似色素變性類疾病患者，應用UWF SLO可以提高層間色素變動的檢出率。隨著基因檢測技術和多模式影像技術的發展，CRB1突變與PPRPE的基因型與表型關系會更為緊密。
本組3例患兒黃斑區存在特殊表現，其中對稱性黃斑水腫、黃斑區劈裂樣囊變以及單眼黃斑前膜各1例。CRB1突變患者黃斑囊腔樣改變既往已有文獻報道，可伴或不伴熒光素滲漏[5, 12-13]。結合本研究觀察，滲漏可能主要為黃斑水腫所致，不伴滲漏主要以劈裂形態存在。Mucciolo等[6]長期隨訪發現，CRB1突變患者可出現黃斑劈裂向黃斑水腫演變，最后出現黃斑萎縮。結合本研究結果，我們推測這些特殊表型可能是病變不同階段的表現。既往研究報道，一近親結婚家庭中3名子代患者均存在黃斑劈裂樣改變，經ERG及基因檢測，1例為CRB1突變引起，2例為RS1突變引起的X-連鎖視網膜劈裂，其母親為CRB1和RS1兩種基因的攜帶者[14]。這提示臨床上對于黃斑劈裂樣改變還需考慮CRB1突變可能，ERG檢查對于鑒別診斷至關重要，結合CRB1和RS1基因的快速檢測能夠幫助我們明確診斷。Murro等[15]曾報道1例CRB1突變型黃斑水腫誤診為葡萄膜炎的病例，本研究中1例患兒FFA檢查顯示黃斑區熒光素積聚，晚期視盤著染，周邊PPRPE顯示“霜枝”樣強熒光，類似葡萄膜炎樣反應，而在另外黃斑前膜患兒中探及到明顯的玻璃體混濁，與黃斑及視盤處粘連。據此我們認為，對于有類葡萄膜炎樣表現的患兒需要加強去偽鑒別，電生理及基因檢測非常重要。
CRB1主要表達于光感受器細胞內節以維持細胞的極性和細胞間的粘連，而多數CRB1突變患者存在視網膜結構層次紊亂[7-10]。因此，我們推測CRB1基因突變可能導致細胞的重新排列，以致視網膜增厚，但各層結構缺乏呈現出不成熟的視網膜。有研究發現，CRB2作為CRB家族中的一員參與CRB1調控，CRB2的丟失加重CRB1相關RP樣表型向LCA樣表型發展[7, 16]。Tsang等[17]在CRB1突變患者中檢測到其他可能起修飾作用的基因。因此，我們推測CRB1可能存在一個基因修飾調控網絡，共同作用導致各種特殊表型的出現，但有待于進一步功能驗證。
CRB1基因治療的最佳窗口期是生命最初二三十年[5]，早期正確診斷非常重要。鑒于其特殊表型易與其他兒童眼底病相混淆，臨床需加強多模式影像檢查，同時結合ERG和基因檢測以提高診斷效率。由于CRB1突變患者臨床罕見，本研究納入病例數較少，其特征規律有待于更多樣本量及更長隨訪時間的深入研究加以驗證和探討。
