引用本文： 朱青, 李亞, 游雅, 施曉萌, 雷博. PCDH15基因復合雜合新突變致無色素性視網膜色素變性表型的1F型Usher綜合征一家系. 中華眼底病雜志, 2021, 37(6): 444-448. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200928-00473 復制
無色素性視網膜色素變性（RPSP）是一種非典型性原發性視網膜色素變性（RP），約占非綜合征型RP患者的10%[1]。RPSP患者眼底無或僅有極少色素沉著，臨床僅憑眼底檢查極易造成漏診。Usher綜合征（USH）是一種以耳聾和RP為特征的常染色體隱性遺傳性疾病[2-3]。臨床根據聽力和前庭功能受累情況將其分為3種臨床亞型，其中1型最為嚴重，表現為先天性重度聽力下降、前庭功能障礙和青春期前發病的RP。USH具有遺傳異質性，迄今已鑒定出包括PCDH15在內的7種1型USH致病基因（RETNET，https://sph.uth.edu/RetNet/）。PCDH15基因定位于10號染色體長臂，主要在耳蝸毛細胞及視網膜光感受器細胞中表達[4]。一項人群PCDH15變異頻譜研究發現，PCDH15基因胞內結構域中的截短變異發生率較高，且導致1F型USH的可能性極低[5]。基因型表型相關性研究表明，PCDH15基因錯義突變與非綜合征型耳聾發生有關，而無功能變異則與1型USH相關[6]。目前國內以RPSP為臨床表型的USH研究鮮見報道。我們在臨床中發現具有RPSP表型的USH一家系，采用基于靶向捕獲的二代測序技術對其家系進行了基因突變檢測，借助共分離驗證及生物信息學分析，明確了其致病突變位點PCDH15基因c.4109dupA（p.K1370fs）（M1）、c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）（M2）。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審批[批文號：HNEECKY-2019（15號）]，遵循《赫爾辛基宣言》原則，患兒監護人及受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年11月于河南省立眼科醫院檢查確診的具有RPSP表型的1F型USH患者1例和其父母納入研究。1F型USH診斷標準：致病基因為PCDH15，表現為先天性重度聽力下降，前庭功能障礙，青春期前發病的RP。詳細詢問患兒病史和家族史。受檢者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼底彩色照相、視網膜電圖（ERG）和視覺誘發電位（VEP）、光相干斷層掃描（OCT）、視野檢查。家族史和臨床檢查結果符合RPSP診斷標準[7]。
先證者女，9歲。主訴雙眼夜盲4年余，聽覺下降7年。純音測聽檢查示患兒雙耳聽力重度下降。BCVA：右眼0.5+（+1.25DS/?2.00DC×160），左眼0.5+（+1.75DS/?1.00DC×20）。眼底視盤邊界清楚、顏色淡紅，黃斑中心凹反光可見，未見明顯色素沉著（圖1A，1B）。OCT檢查示周邊視網膜外層變薄，橢圓體帶消失（圖1C，1D）。雙眼中周邊視野的視敏度普遍性下降（圖1E，1F）。ERG檢查示雙眼視桿系統反應重度下降，呈熄滅型；閃光VEP檢查，雙眼P2波潛伏期正常，波幅正常（圖1G～1J）。患兒父母表型正常。
圖1
無色素性視網膜色素變性伴1F型Usher綜合征患兒彩色眼底、光相干斷層掃描（OCT）、視野及視網膜電圖檢查像。1A、1B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼周邊視網膜色灰暗，色素上皮萎縮，未見明顯色素沉著。1C、1D分別示右眼、左眼OCT像。雙眼黃斑中心凹結構存在，周邊視網膜外層變薄且橢圓體帶消失。1E、1F分別示右眼、左眼視野檢查灰度圖。雙眼中周邊視野的光敏感度下降。1G、1H和1I、1J分別示右眼、左眼的明適應和暗適應視網膜電圖檢查像。雙眼暗適應和明適應波幅重度下降
采集受檢者外周靜脈血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，紫外分光光度計定量。經片段化、連接接頭、擴增純化后，利用液相雜交法將自主研發設計的探針（PS400）與目標區域結合，雜交捕獲376個與視網膜遺傳病相關基因的外顯子區域和相鄰內含子區域（50堿基對）及已知內含子突變。捕獲到的DNA經洗脫和擴增純化后，使用高通量測序儀（Illumina）進行測序。測序數據采用XYGeneRanger2.0軟件與UCSC hg19人類參考基因組序列進行比對和鑒別遺傳變異，并收集目標區域的覆蓋度和平均測序深度等質量參數。視網膜遺傳病相關基因檢測測序目標區域平均測序深度為300×，其中99%的目標序列測序深度達＞30×[8]。采用MutationTaster蛋白預測軟件，并依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）于2015年發布的《序列變異解讀標準和指南》[9]評估其遺傳變異的致病性。
對檢測出的可疑致病突變擴展至家系成員進行Sanger測序驗證。使用生物信息學技術預測變異對編碼蛋白的影響，應用SWISS-MODEL和PSIPRED預測野生型與M1突變型蛋白結構模型。
2 結果
基因檢測結果顯示，先證者PCDH15基因有2個可疑雜合突變，即M1：c.4109dupA（p.K1370fs），M2：c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）。2個雜合變異均未在正常人群數據庫中檢出，且人類基因突變數據庫（HGMD）、ClinVar數據庫未報道。Mutation Taster預測為致病性變異。經Sanger測序驗證，患兒母親攜帶雜合變異M1，父親攜帶雜合變異M2，變異在該家系中呈共分離狀態。經ACMG指南評估M1和M2均為PCDH15基因新發現致病性變異（PVS1、PM2、PP1、PP3、PP4）。
比對uniprot數據庫PCDH15蛋白（A2A3D8_HUMAN）結構域信息，結合TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測，PCDH15蛋白第1380～1402位氨基酸構成蛋白的跨膜結構域。M1突變型蛋白的跨膜結構域消失。與正常的同源序列比較，變異M1改變了PCDH15蛋白序列第1371～1407位37個氨基酸并出現終止，使編碼蛋白跨膜區的疏水性與α螺旋結構均發生顯著變化（圖2～4）。PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）預測M1突變改變了編碼蛋白質膜的亞細胞定位，突變型多數分布于線粒體及細胞質中而非質膜。變異M2發生于基因起始端的信號肽結構域，使蛋白翻譯提前終止于第7個密碼子，預測無法合成蛋白產物。
圖2
PCDH15蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。PCDH15 c.4109dupA（p.K1370fs）所對應的氨基酸位點在人（Homo sapiens）、斑馬魚（Danio rerio）、家雞（Gallus gallus）、小家鼠（Mus musculus）、貓頭鷹猴（Aotus nancymaae）、獼猴（Macaca mulatta）、家兔（Oryctolagus cuniculus）中均高度保守（紅色線框內為跨膜區氨基酸序列）
圖3
PCDH15蛋白氨基酸序列跨膜區預測及親疏水性分析。3A、3B分別示野生型、M1突變型TMHMM跨膜預測結果。可見M1突變型蛋白序列跨膜結構域消失。3C、3D分別示野生型、M1突變型Kyte和Doolittle親疏水性分析。峰值越高，疏水性越強。M1突變型蛋白序列原跨膜區疏水性發生顯著改變（紅色線框內為跨膜區）
圖4
PCDH15蛋白拓撲結構分析圖。4A示野生型，蛋白第1371～1407位氨基酸使用灰色標出，具有正常的α跨膜螺旋結構；4B示M1突變型，突變位點導致正常的跨膜結構發生改變
根據臨床表型、基因變異致病性以及蛋白結構預測，最終臨床診斷PCDH15相關1F型USH。
3 討論
原發性RP早期癥狀為夜盲、視野向心性縮小，ERG表現為視桿-視錐型細胞變性[10]，其中ERG是確診RPSP重要的一項客觀檢查[11-12]。本例患兒臨床表現、眼底彩色照相、ERG和視野檢查結果均符合RPSP典型表現，結合患兒有先天性耳聾表現，臨床初步診斷為USH。
通過靶向捕獲高通量測序技術對此患兒家系進行致病基因分析，發現PCDH15基因可疑致病復合雜合突變。一個為遺傳自母親的移碼突變，另一個為遺傳自父親的無義突變。PCDH15基因編碼介導細胞間黏附的鈣依賴性內在膜蛋白，由1個胞外信號肽、11個胞外鈣結合結構域、1個跨膜結構域和1個獨特的胞內結構域組成，對維持正常的視網膜和耳蝸功能具有重要作用[6]。與在耳蝸靜纖毛中作用方式相似，USH1蛋白在人類、靈長類和兩棲類動物光感受器細胞中被認為是一種膜耦合蛋白，介導光感受器細胞外節和環繞其外的萼狀突起之間的黏附[13]。PCDH15基因敲減的熱帶爪蟾，其光感受器細胞的萼狀突起被破壞，光感受器細胞外節出現異常的形態且功能下降[14]。本研究發現的移碼突變c.4109dupA（p.K1370fs），其插入位點位于PCDH15基因編碼蛋白的胞外側，移碼導致整個編碼蛋白跨膜區氨基酸序列發生變化，蛋白編碼提前終止于臨近跨膜區的胞內側。PCDH15蛋白（UniProtKB-A2A3D8）第1380～1402位氨基酸形成α跨膜螺旋結構，其跨膜性質的決定因素包括氨基酸序列的長度和疏水性，疏水性錯配和界面錨固，極性殘基和脯氨酸等[15]。α螺旋跨膜蛋白的跨膜與否取決于整個跨膜序列的疏水性強弱[16]。使用Kyte和Doolittle疏水分析法預測出M1突變型產物相比野生型1380～1402位氨基酸序列疏水性發生顯著改變[17]，因此預測該肽段沒有足夠的疏水性成為跨膜區。無義突變c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）插入的堿基產生終止密碼子，使蛋白質合成提前終止于胞外信號肽結構域處，導致編碼蛋白無法合成。該兩種變異預測會產生截短的轉錄本，通過無義介導的mRNA衰變的細胞保護性機制而降解[18]，或產生截短的蛋白產物。對移碼突變c.4109dupA（p.K1370fs）產生的突變型蛋白結構進行預測，發現其改變了編碼蛋白的α螺旋跨膜結構，影響了蛋白的正常跨膜與定位，使編碼蛋白無法發揮其正常膜耦合功能，進而破壞光感受器細胞與靜纖毛正常形態和功能，引起眼與耳部的異常表現。
根據患者臨床表型、基因變異致病性以及蛋白結構與功能預測，本例患兒最終診斷為與PCDH15基因相關的1F型USH。患兒眼底未發現明顯的骨細胞樣色素沉著，臨床診斷中可能會漏診。因此，對此類患者應進行常規ERG檢查和基因檢測。
目前對于USH尚無有效的治療辦法。對聽力障礙者可建議其佩戴助聽器，早期植入人工耳蝸有助于重度聽力受損患兒語言能力的提高[19]。腺相關病毒介導的基因替代治療在部分早期RP患者中取得良好效果，但這種方法不適用于大基因（＞4.5 kb），如PCDH15。因此在治療尚未取得突破性進展的情況下，基因篩查產前診斷和遺傳咨詢顯得尤為重要。
PCDH15基因新的復合雜合突變導致本例患兒出現非典型性RP和聽力下降。2個新發現變異c.4109dupA、c.17dupA，導致PCDH15蛋白無法正常合成，繼而引起眼部及耳部異常表現。本研究拓展了PCDH15基因導致USH的基因突變譜和臨床表型譜。
無色素性視網膜色素變性（RPSP）是一種非典型性原發性視網膜色素變性（RP），約占非綜合征型RP患者的10%[1]。RPSP患者眼底無或僅有極少色素沉著，臨床僅憑眼底檢查極易造成漏診。Usher綜合征（USH）是一種以耳聾和RP為特征的常染色體隱性遺傳性疾病[2-3]。臨床根據聽力和前庭功能受累情況將其分為3種臨床亞型，其中1型最為嚴重，表現為先天性重度聽力下降、前庭功能障礙和青春期前發病的RP。USH具有遺傳異質性，迄今已鑒定出包括PCDH15在內的7種1型USH致病基因（RETNET，https://sph.uth.edu/RetNet/）。PCDH15基因定位于10號染色體長臂，主要在耳蝸毛細胞及視網膜光感受器細胞中表達[4]。一項人群PCDH15變異頻譜研究發現，PCDH15基因胞內結構域中的截短變異發生率較高，且導致1F型USH的可能性極低[5]。基因型表型相關性研究表明，PCDH15基因錯義突變與非綜合征型耳聾發生有關，而無功能變異則與1型USH相關[6]。目前國內以RPSP為臨床表型的USH研究鮮見報道。我們在臨床中發現具有RPSP表型的USH一家系，采用基于靶向捕獲的二代測序技術對其家系進行了基因突變檢測，借助共分離驗證及生物信息學分析，明確了其致病突變位點PCDH15基因c.4109dupA（p.K1370fs）（M1）、c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）（M2）。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審批[批文號：HNEECKY-2019（15號）]，遵循《赫爾辛基宣言》原則，患兒監護人及受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年11月于河南省立眼科醫院檢查確診的具有RPSP表型的1F型USH患者1例和其父母納入研究。1F型USH診斷標準：致病基因為PCDH15，表現為先天性重度聽力下降，前庭功能障礙，青春期前發病的RP。詳細詢問患兒病史和家族史。受檢者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼底彩色照相、視網膜電圖（ERG）和視覺誘發電位（VEP）、光相干斷層掃描（OCT）、視野檢查。家族史和臨床檢查結果符合RPSP診斷標準[7]。
先證者女，9歲。主訴雙眼夜盲4年余，聽覺下降7年。純音測聽檢查示患兒雙耳聽力重度下降。BCVA：右眼0.5+（+1.25DS/?2.00DC×160），左眼0.5+（+1.75DS/?1.00DC×20）。眼底視盤邊界清楚、顏色淡紅，黃斑中心凹反光可見，未見明顯色素沉著（圖1A，1B）。OCT檢查示周邊視網膜外層變薄，橢圓體帶消失（圖1C，1D）。雙眼中周邊視野的視敏度普遍性下降（圖1E，1F）。ERG檢查示雙眼視桿系統反應重度下降，呈熄滅型；閃光VEP檢查，雙眼P2波潛伏期正常，波幅正常（圖1G～1J）。患兒父母表型正常。
圖1
無色素性視網膜色素變性伴1F型Usher綜合征患兒彩色眼底、光相干斷層掃描（OCT）、視野及視網膜電圖檢查像。1A、1B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼周邊視網膜色灰暗，色素上皮萎縮，未見明顯色素沉著。1C、1D分別示右眼、左眼OCT像。雙眼黃斑中心凹結構存在，周邊視網膜外層變薄且橢圓體帶消失。1E、1F分別示右眼、左眼視野檢查灰度圖。雙眼中周邊視野的光敏感度下降。1G、1H和1I、1J分別示右眼、左眼的明適應和暗適應視網膜電圖檢查像。雙眼暗適應和明適應波幅重度下降
采集受檢者外周靜脈血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，紫外分光光度計定量。經片段化、連接接頭、擴增純化后，利用液相雜交法將自主研發設計的探針（PS400）與目標區域結合，雜交捕獲376個與視網膜遺傳病相關基因的外顯子區域和相鄰內含子區域（50堿基對）及已知內含子突變。捕獲到的DNA經洗脫和擴增純化后，使用高通量測序儀（Illumina）進行測序。測序數據采用XYGeneRanger2.0軟件與UCSC hg19人類參考基因組序列進行比對和鑒別遺傳變異，并收集目標區域的覆蓋度和平均測序深度等質量參數。視網膜遺傳病相關基因檢測測序目標區域平均測序深度為300×，其中99%的目標序列測序深度達＞30×[8]。采用MutationTaster蛋白預測軟件，并依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）于2015年發布的《序列變異解讀標準和指南》[9]評估其遺傳變異的致病性。
對檢測出的可疑致病突變擴展至家系成員進行Sanger測序驗證。使用生物信息學技術預測變異對編碼蛋白的影響，應用SWISS-MODEL和PSIPRED預測野生型與M1突變型蛋白結構模型。
2 結果
基因檢測結果顯示，先證者PCDH15基因有2個可疑雜合突變，即M1：c.4109dupA（p.K1370fs），M2：c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）。2個雜合變異均未在正常人群數據庫中檢出，且人類基因突變數據庫（HGMD）、ClinVar數據庫未報道。Mutation Taster預測為致病性變異。經Sanger測序驗證，患兒母親攜帶雜合變異M1，父親攜帶雜合變異M2，變異在該家系中呈共分離狀態。經ACMG指南評估M1和M2均為PCDH15基因新發現致病性變異（PVS1、PM2、PP1、PP3、PP4）。
比對uniprot數據庫PCDH15蛋白（A2A3D8_HUMAN）結構域信息，結合TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測，PCDH15蛋白第1380～1402位氨基酸構成蛋白的跨膜結構域。M1突變型蛋白的跨膜結構域消失。與正常的同源序列比較，變異M1改變了PCDH15蛋白序列第1371～1407位37個氨基酸并出現終止，使編碼蛋白跨膜區的疏水性與α螺旋結構均發生顯著變化（圖2～4）。PSORT（http://psort.nibb.ac.jp/form2.html）預測M1突變改變了編碼蛋白質膜的亞細胞定位，突變型多數分布于線粒體及細胞質中而非質膜。變異M2發生于基因起始端的信號肽結構域，使蛋白翻譯提前終止于第7個密碼子，預測無法合成蛋白產物。
圖2
PCDH15蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。PCDH15 c.4109dupA（p.K1370fs）所對應的氨基酸位點在人（Homo sapiens）、斑馬魚（Danio rerio）、家雞（Gallus gallus）、小家鼠（Mus musculus）、貓頭鷹猴（Aotus nancymaae）、獼猴（Macaca mulatta）、家兔（Oryctolagus cuniculus）中均高度保守（紅色線框內為跨膜區氨基酸序列）
圖3
PCDH15蛋白氨基酸序列跨膜區預測及親疏水性分析。3A、3B分別示野生型、M1突變型TMHMM跨膜預測結果。可見M1突變型蛋白序列跨膜結構域消失。3C、3D分別示野生型、M1突變型Kyte和Doolittle親疏水性分析。峰值越高，疏水性越強。M1突變型蛋白序列原跨膜區疏水性發生顯著改變（紅色線框內為跨膜區）
圖4
PCDH15蛋白拓撲結構分析圖。4A示野生型，蛋白第1371～1407位氨基酸使用灰色標出，具有正常的α跨膜螺旋結構；4B示M1突變型，突變位點導致正常的跨膜結構發生改變
根據臨床表型、基因變異致病性以及蛋白結構預測，最終臨床診斷PCDH15相關1F型USH。
3 討論
原發性RP早期癥狀為夜盲、視野向心性縮小，ERG表現為視桿-視錐型細胞變性[10]，其中ERG是確診RPSP重要的一項客觀檢查[11-12]。本例患兒臨床表現、眼底彩色照相、ERG和視野檢查結果均符合RPSP典型表現，結合患兒有先天性耳聾表現，臨床初步診斷為USH。
通過靶向捕獲高通量測序技術對此患兒家系進行致病基因分析，發現PCDH15基因可疑致病復合雜合突變。一個為遺傳自母親的移碼突變，另一個為遺傳自父親的無義突變。PCDH15基因編碼介導細胞間黏附的鈣依賴性內在膜蛋白，由1個胞外信號肽、11個胞外鈣結合結構域、1個跨膜結構域和1個獨特的胞內結構域組成，對維持正常的視網膜和耳蝸功能具有重要作用[6]。與在耳蝸靜纖毛中作用方式相似，USH1蛋白在人類、靈長類和兩棲類動物光感受器細胞中被認為是一種膜耦合蛋白，介導光感受器細胞外節和環繞其外的萼狀突起之間的黏附[13]。PCDH15基因敲減的熱帶爪蟾，其光感受器細胞的萼狀突起被破壞，光感受器細胞外節出現異常的形態且功能下降[14]。本研究發現的移碼突變c.4109dupA（p.K1370fs），其插入位點位于PCDH15基因編碼蛋白的胞外側，移碼導致整個編碼蛋白跨膜區氨基酸序列發生變化，蛋白編碼提前終止于臨近跨膜區的胞內側。PCDH15蛋白（UniProtKB-A2A3D8）第1380～1402位氨基酸形成α跨膜螺旋結構，其跨膜性質的決定因素包括氨基酸序列的長度和疏水性，疏水性錯配和界面錨固，極性殘基和脯氨酸等[15]。α螺旋跨膜蛋白的跨膜與否取決于整個跨膜序列的疏水性強弱[16]。使用Kyte和Doolittle疏水分析法預測出M1突變型產物相比野生型1380～1402位氨基酸序列疏水性發生顯著改變[17]，因此預測該肽段沒有足夠的疏水性成為跨膜區。無義突變c.17dupA（p.Y6_L7delinsX）插入的堿基產生終止密碼子，使蛋白質合成提前終止于胞外信號肽結構域處，導致編碼蛋白無法合成。該兩種變異預測會產生截短的轉錄本，通過無義介導的mRNA衰變的細胞保護性機制而降解[18]，或產生截短的蛋白產物。對移碼突變c.4109dupA（p.K1370fs）產生的突變型蛋白結構進行預測，發現其改變了編碼蛋白的α螺旋跨膜結構，影響了蛋白的正常跨膜與定位，使編碼蛋白無法發揮其正常膜耦合功能，進而破壞光感受器細胞與靜纖毛正常形態和功能，引起眼與耳部的異常表現。
根據患者臨床表型、基因變異致病性以及蛋白結構與功能預測，本例患兒最終診斷為與PCDH15基因相關的1F型USH。患兒眼底未發現明顯的骨細胞樣色素沉著，臨床診斷中可能會漏診。因此，對此類患者應進行常規ERG檢查和基因檢測。
目前對于USH尚無有效的治療辦法。對聽力障礙者可建議其佩戴助聽器，早期植入人工耳蝸有助于重度聽力受損患兒語言能力的提高[19]。腺相關病毒介導的基因替代治療在部分早期RP患者中取得良好效果，但這種方法不適用于大基因（＞4.5 kb），如PCDH15。因此在治療尚未取得突破性進展的情況下，基因篩查產前診斷和遺傳咨詢顯得尤為重要。
PCDH15基因新的復合雜合突變導致本例患兒出現非典型性RP和聽力下降。2個新發現變異c.4109dupA、c.17dupA，導致PCDH15蛋白無法正常合成，繼而引起眼部及耳部異常表現。本研究拓展了PCDH15基因導致USH的基因突變譜和臨床表型譜。
