引用本文： 薛敏, 柯屹峰, 任新軍, 劉巨平, 范小娥, 李筱榮. 病理性近視患者房水非標記定量蛋白質組學分析. 中華眼底病雜志, 2020, 36(12): 936-942. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200907-00436 復制
病理性近視（PM）通常是指近視屈光度＞6.00 D、眼軸長度＞26.5 mm并伴有后鞏膜葡萄腫及黃斑區、脈絡膜和視網膜退行性病變的一種可導致低視力甚至致盲的眼病[1]。其確切發病機制尚不明確，現仍處于探索階段。目前多數研究者認為遺傳和環境因素的共同作用可能是其主要的致病原因[2-3]。近年來，隨著蛋白質組學技術的發展，學者們開始嘗試利用蛋白質組學技術來探索多種疾病的病理機制[4-5]。非標記蛋白質組學技術是一種不依賴于昂貴同位素標記的新型蛋白質定量技術，該技術利用液相色譜和質譜串聯對蛋白質酶解肽段進行分析，比較不同樣本中相應肽段的信號強度，通過解析質譜數據對相應的蛋白質進行定量鑒定[6-7]。該技術目前已廣泛應用于疾病標志物篩選、疾病發病機制探索、新藥開發等生物醫學領域。房水是一種重要的眼內液，對維持眼的正常功能有重要意義，其主要作用是為眼組織提供營養并帶走代謝廢物[8-9]。此外，它還參與了眼組織的免疫反應[10]。房水中的蛋白質成分會在眼部疾病中發生變化。越來越多的研究表明，在房水中發生變化的這些蛋白質與許多眼底疾病的發病機制和（或）預后有關[11-13]。但目前有關PM房水蛋白質組學研究的相關報道較少。為此，本研究利用非標記蛋白質組學技術對PM患者房水進行蛋白質組學研究，篩選房水中的差異表達蛋白，觀察PM患者房水蛋白表達譜的改變，以期為深入了解PM的發病機制提供理論依據。
1 對象和方法
1.1 對象
本研究為符合《赫爾辛基宣言》，經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審批[倫理審查號：2020KY（L）-40]，并取得患者書面知情同意的橫斷面研究。
2019年1～8月在天津醫科大學眼科醫院收集32例老年性白內障患者的房水樣本進行質譜檢測。其中，男性11例，女性21例；年齡58～76歲，平均年齡（68.41±6.09）歲。將合并PM的16例作為PM組，不合并近視的16例作為對照組。PM組納入標準：（1）眼軸長度≥26.5 mm；（2）伴有等于或大于彌漫性脈絡膜萎縮的眼底病變[14]。對照組納入標準：（1）眼軸長度22.0～24.0 mm；（2）無眼底病變。兩組患者均無眼外傷史、PM相關并發癥治療史以及除白內障或近視以外的其他眼部疾病，均未使用全身抗代謝藥、免疫抑制劑或皮質類固醇等藥物。兩組患者性別（χ2=1.247，P=0.264）、年齡（t=－1.384，P=0.176）比較，差異均無統計學意義；眼軸長度比較，差異有統計學意義（t=11.302，P=0.000）（表1）。兩組患者晶狀體混濁程度分級均為C2N2P2。
表1
兩組質譜檢測標本基本信息比較
1.2 樣本制備
在白內障手術操作之前從手術眼收集100～150 μl前房水。鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉后，0.5%聚維酮碘溶液沖洗結膜囊2次，平衡鹽溶液充分沖洗結膜囊。在任何眼內操作之前，于手術顯微鏡下用1 ml結核菌素注射器在透明角膜緣處采集房水標本，并將其迅速轉移到離心管中，－80 ℃凍存備用。
50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室溫裂解5 min。冰上超聲破碎后，15 ℃條件下16 000×g離心10 min。取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。取100 μg蛋白加入1 mol/L二硫蘇糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入1 mol/L吲哚乙酸4 μl，避光，37 ℃孵育1 h。平衡相對分子質量10×103超濾管1次（50 mmol/L碳酸氫銨400 μl，14 000×g離心10 min），加入100 μg還原烷基化后的樣本，15 ℃條件下14 000×g離心20 min，加入50 mmol/L碳酸氫銨400 μl清洗3次，更換收集管，加入50 mmol/L碳酸氫銨50 μl到超濾管中，加入2 μg胰酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液槍混勻超濾管中的樣本，4 ℃條件下14 000×g離心20 min，加50 mmol/L碳酸氫銨50 μl沖洗3次，向收集管中加入體積比為1%的甲酸終止酶切，60 ℃真空蒸干。用12 μl 0.1%甲酸重懸樣本，Nanodrop分光光度計測量，取等量的肽段進行質譜的檢測。
1.3 非標記液相色譜-串聯質譜檢測
采用EkspertnanoLC 415（美國AB SCIEX公司）液相色譜和TripleTOF 6600（美國AB SCIEX公司）質譜系統進行質譜分析。用上樣緩沖液（0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水）將2 μg酶切后的肽段載入到C18填充的離子阱上（100 μm×2 cm，填料規格3 μm，120A）。使用不同梯度的梯度緩沖液（0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水）洗脫離子阱，肽段經過C18填充的柱子后（150 μm×15 cm，填料規格1.9 μm，120A），形成帶電的離子噴霧，離子噴霧進入質譜進行檢測。梯度緩沖液的有效洗脫梯度為5%～35%，有效時間為91 min，流速為400 nl/min。質譜參數：飛行時間質譜累加時間為0.25 s，質量掃描范圍為相對分子質量300～1500，電荷選擇+2～+5價離子，質量偏差50 ppm以內，每個循環內最大監測離子數為60，每次檢測隔離已檢測離子16 s，碎裂能量模式為動態的碎裂模式。產物離子累加時間為0.04 s，采用高靈敏的掃描模式，其余參數與飛行時間質譜參數相同。
1.4 差異表達蛋白鑒定
使用Maxquant軟件1.6.3.4版本對質譜采集的原始數據進行數據庫的搜索。對搜索后的數據進行統計學分析，篩選可定量蛋白，使用兩獨立樣本t檢驗計算蛋白表達的P值。篩選P＜0.05且差異倍數大于1.5的差異表達蛋白，去除有0的結果后得到差異表達蛋白的火山圖。
1.5 ELISA驗證實驗
為了進一步驗證質譜結果的可靠性，另收集20例合并PM的老年性白內障患者（PM組）和20例不合并近視的單純性老年性白內障患者（對照組），患者納入和排除標準均同質譜檢測樣本。兩組患者性別（χ2=0.960，P=0.327）、年齡（t=－1.252，P=0.220）比較，差異均無統計學意義；眼軸長度比較，差異有統計學意義（t=14.306，P=0.000）（表2）。兩組患者晶狀體混濁程度均為C2N2P2。隨機選取5個差異表達蛋白在PM組和對照組中進行ELISA驗證。
表2
兩組ELISA驗證標本基本信息比較
1.6 生物信息學分析
為了進一步探索差異蛋白表達的變化，用基因注釋（GO）功能富集對差異表達蛋白進行生物學過程、分子功能和細胞成分三方面分析。為了探索重要的代謝通路，采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析差異表達蛋白的生物學功能。
1.7 統計學分析
采用SPSS 19.0軟件行統計學分析。兩組間患者性別比較采用χ2檢驗，年齡和眼軸長度比較采用兩獨立樣本t檢驗。分析差異表達蛋白時，對每個可定量蛋白的變化倍數以2為底取對數（Log2FC）作為橫坐標，將P值以10為底取負對數［－log10（P值）］作為縱坐標繪制火山圖。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 差異表達蛋白分析
PM組、對照組患者房水標本平均蛋白濃度分別為（1 303.06±131.62）ng/L和（734.83±62.54）ng/L。在32份房水標本中共鑒定出583個可定量蛋白質。PM組和對照組之間有101個差異表達蛋白，包括63個上調蛋白和38個下調蛋白。上調明顯的蛋白有α-胰蛋白酶抑制劑重鏈（IITH）1、補體C4B、單核細胞分化抗原CD14、皮質類固醇結合球蛋白（SERPINA6）、IITH2、補體C8B等。下調明顯的蛋白有免疫球蛋白kappa變量（IGKV）3-11、IGKV3-15、乳酸脫氫酶、載脂蛋白D、視網膜劈裂蛋白（RS1）、肌營養不良蛋白相關糖蛋白1（DAG1）、溶菌酶、TGFβ誘導蛋白（TGFBI）等（圖1）。這101個差異表達蛋白的分類主要是蛋白結合活性調節因子（25.70%）、防御/免疫蛋白（24.80%）、蛋白質修飾酶（11.40%）、代謝物間轉換酶（8.70%）、細胞外基質蛋白（7.80%）等（圖2）。
圖1
差異表達蛋白火山圖。IITH1：α-胰蛋白酶抑制劑重鏈1；SERPINA6：皮質類固醇結合球蛋白；IITH2：α-胰蛋白酶抑制劑重鏈2；IGKV3-11：免疫球蛋白kappa變量3-11；IGKV3-15：免疫球蛋白kappa變量3-15；LDHA：乳酸脫氫酶；APOD：載脂蛋白D；RS1：視網膜劈裂蛋白；DAG1：肌營養不良蛋白相關糖蛋白1；LYZ：溶菌酶；TGFBI：TGFβ誘導蛋白
圖2
不同分類差異表達蛋白的富集度對比
2.2 ELISA驗證質譜結果的可靠性
ELISA驗證結果顯示，隨機選取的5個差異表達蛋白在PM組和對照組之間的表達變化趨勢均與非標記定量蛋白質組學分析結果一致（圖3）。
圖3
隨機選擇的5個差異表達蛋白的ELISA驗證結果均與非標記定量蛋白質組學分析結果一致。3A示視網膜劈裂蛋白（RS1）；3B示乳酸脫氫酶（LDHA）；3C示CD14；3D示C4B；3E示溶菌酶（LYZ）。*：P＜0.05，***：P＜0.001
2.3 生物信息學分析
GO功能富集分析結果表明，101個差異表達蛋白與不同的生物學過程、分子功能和細胞組分有關。在生物學過程方面，差異表達蛋白主要富集在補體激活、炎癥應答、細胞黏附等方面。在分子功能方面，差異表達蛋白主要富集在補體結合、細胞外基質結合等方面。在細胞組分方面，差異表達蛋白主要富集于細胞外囊泡、細胞外區域等方面（圖4）。
圖4
差異表達蛋白基因注釋分析結果。1：補體激活；2：炎癥應答；3：細胞黏附；4：蛋白水解；5：血小板脫顆粒；6：補體激活的調節；7：內肽酶活性的負調節；8：先天免疫反應；9：受體介導細胞攝粒作用；10：免疫應答；11：補體結合；12：細胞外基質結合；13：絲氨酸型內肽酶活性；14：絲氨酸型內肽酶抑制活性；15：肝素結合；16：內肽酶抑制活性；17：受體結合；18：脂質結合；19：蛋白結合；20：鈣離子結合；21：細胞外囊泡；22：細胞外區域；23：細胞外間隙；24：血液微粒；25：細胞質膜；26：細胞外基質；27：血小板α顆粒；28：蛋白胞外基質；29：細胞表面；30：基底膜
KEGG通路富集分析結果表明，101個差異表達蛋白富集于7條代謝通路（表3）。其中，26個差異表達蛋白富集于補體和凝血級聯通路，10個差異表達蛋白富集于金黃色葡萄球菌感染通路，11個差異表達蛋白富集于系統性紅斑狼瘡通路，4個差異表達蛋白富集于細胞外基質-受體相互作用通路。
表3
差異表達蛋白KEGG通路富集結果
3 討論
當PM出現黃斑脈絡膜新生血管、脈絡膜和視網膜退行性病變時將嚴重影響患者視力，甚至致盲。積極尋找PM的潛在發病機制，開發有效的治療靶點，并預測其進展和預后具有重要的臨床意義。雖然PM的病理改變主要表現在眼后節，但已有多項研究證據表明房水蛋白質組的變化與眼底疾病密切相關[15-16]。本研究通過對白內障手術中獲取到的房水標本進行檢測分析，發現32份房水標本中存在581個蛋白質，其中101個蛋白存在差異表達，包括63個上調蛋白和38個下調蛋白。由于PM組和對照組患者的白內障基線病情相同，所以我們認為在房水中發現的差異表達蛋白可以排除白內障病情對結果的影響，僅與PM的發生和發展存在密切聯系。通過生物信息學分析，我們發現免疫和炎癥的相互作用以及細胞外基質重塑在PM的發病機制中起著主要作用。
KEGG通路富集分析結果表明，富集度最顯著的通路為補體和凝血級聯，包含26個差異表達蛋白，這與GO功能富集分析結果相一致。這些蛋白質中的大多數具有促炎功能，其中一些在近視患者中呈上調趨勢。此外，其他的KEGG富集通路（金黃色葡萄球菌感染、系統性紅斑狼瘡、朊病毒病、百日咳等通路）都與免疫和炎癥相互作用有關。GO功能富集分析結果也表明，差異表達蛋白的生物學過程在補體激活和炎癥應答反應中富集度高。值得注意的是，屬于胰蛋白酶抑制劑家族的ITIH1和ITIH2在炎癥中起著重要的作用，在PM患者中表現為上調[17]。此外，與對照組相比，PM組中有更高水平的SERPIN家族的許多炎癥蛋白，如SERPIN6和SERPIN1。這和另一項近視的蛋白質組學研究結果相似[18]。另外，已發現補體系統在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病視網膜病變和老年性黃斑變性等多種眼部疾病中表達紊亂[19-20]。在本研究中，許多差異表達蛋白，如C4B、CD14、C8B、C8A等，都是參與補體激活和調節的關鍵免疫蛋白，在PM組中明顯上調。從差異表達蛋白的GO功能富集分析結果來看，差異表達蛋白生物學過程中補體激活的明顯富集提示PM患者免疫調節活化。由此可見，補體激活與炎癥的相互作用在PM的發病機制中起著重要的作用。免疫和炎癥相關治療可能是PM的一種新的臨床治療策略，但是目前尚未得到足夠的關注。
鞏膜是PM發展過程中的活躍組織。眼軸長短和屈光狀態受鞏膜細胞外基質組成及其生物力學性能的調節[21]。本研究KEGG通路富集分析中富集了細胞外基質-受體相互作用途徑，這與GO功能富集分析結果一致。DAG1是肌營養不良蛋白-糖蛋白復合物的組成成分，參與了細胞骨架與細胞外基質之間附著的主要作用機制，經常在肌-眼-腦綜合征中被報道[22]。肌-眼-腦綜合征患者常常合并嚴重的先天性近視，其致病機制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化異常[23]。與對照組相比，PM組TGFBI蛋白明顯下降，這和另一項有關近視蛋白質組學的研究結果相一致[18]。TGFBI蛋白是一種分泌型細胞外基質蛋白，已被證實能調節多種細胞的附著[24]。鞏膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促進與近視發展相關的鞏膜細胞外基質重塑中起著重要作用[25]。TGFBI蛋白可調節人鞏膜成纖維細胞在成纖維細胞層界面附著于Ⅰ型膠原，從而調節層狀滑移量、鞏膜粘彈性和鞏膜延長速率[25]。雖然導致PM發生發展的病因尚不清楚，但這些與鞏膜生物力學特性改變有關的細胞外基質的生化變化被認為是導致眼軸增長和近視發展的原因。
另外值得關注的結果是，本研究發現了RS1在PM患者房水中明顯下調。RS1也稱為X連鎖青少年視網膜劈裂蛋白，由RS1基因編碼，是一種由光感受器細胞和雙極細胞分泌的相對分子質量24×103的視網膜特異性蛋白，作為維持視網膜突觸結構的細胞黏附蛋白[26]。X連鎖先天性視網膜劈裂是由RS1基因突變引起的，其主要機制是其盤狀蛋白結構域、亞基組裝和內質網加工缺陷[27-28]。鑒于視網膜劈裂是PM的一個常見并發癥，據此我們推測RS1可能是PM發生發展的關鍵蛋白之一，它通過減少細胞黏附和破壞視網膜的突觸結構而發揮作用。GO功能富集分析的生物學過程富集結果即細胞黏附也支持這一結果，但RS1蛋白與PM的內在聯系還有待進一步研究。
本研究首次通過非標記液相色譜-串聯質譜定量蛋白質組學分析發現PM患者房水蛋白質組譜發生了變化，并且這種變化得到了ELISA實驗的進一步證實。這些與PM相關的差異表達蛋白主要參與免疫和炎癥相互作用以及細胞外基質的重塑。本研究結果提供了PM的發生發展與免疫炎癥反應和細胞外基質重塑關系的新證據，指導了PM的致病機制研究和治療方案探索的方向，但其具體的作用機制仍需要進一步研究。本研究的不足之處在于因臨床樣本取材的限制，我們無法獲得年輕PM患者和正常人的房水進行蛋白組學研究，所以只能盡量控制兩組白內障基線病情的一致性，從而減輕白內障對研究結果的干擾。
病理性近視（PM）通常是指近視屈光度＞6.00 D、眼軸長度＞26.5 mm并伴有后鞏膜葡萄腫及黃斑區、脈絡膜和視網膜退行性病變的一種可導致低視力甚至致盲的眼病[1]。其確切發病機制尚不明確，現仍處于探索階段。目前多數研究者認為遺傳和環境因素的共同作用可能是其主要的致病原因[2-3]。近年來，隨著蛋白質組學技術的發展，學者們開始嘗試利用蛋白質組學技術來探索多種疾病的病理機制[4-5]。非標記蛋白質組學技術是一種不依賴于昂貴同位素標記的新型蛋白質定量技術，該技術利用液相色譜和質譜串聯對蛋白質酶解肽段進行分析，比較不同樣本中相應肽段的信號強度，通過解析質譜數據對相應的蛋白質進行定量鑒定[6-7]。該技術目前已廣泛應用于疾病標志物篩選、疾病發病機制探索、新藥開發等生物醫學領域。房水是一種重要的眼內液，對維持眼的正常功能有重要意義，其主要作用是為眼組織提供營養并帶走代謝廢物[8-9]。此外，它還參與了眼組織的免疫反應[10]。房水中的蛋白質成分會在眼部疾病中發生變化。越來越多的研究表明，在房水中發生變化的這些蛋白質與許多眼底疾病的發病機制和（或）預后有關[11-13]。但目前有關PM房水蛋白質組學研究的相關報道較少。為此，本研究利用非標記蛋白質組學技術對PM患者房水進行蛋白質組學研究，篩選房水中的差異表達蛋白，觀察PM患者房水蛋白表達譜的改變，以期為深入了解PM的發病機制提供理論依據。
1 對象和方法
1.1 對象
本研究為符合《赫爾辛基宣言》，經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審批[倫理審查號：2020KY（L）-40]，并取得患者書面知情同意的橫斷面研究。
2019年1～8月在天津醫科大學眼科醫院收集32例老年性白內障患者的房水樣本進行質譜檢測。其中，男性11例，女性21例；年齡58～76歲，平均年齡（68.41±6.09）歲。將合并PM的16例作為PM組，不合并近視的16例作為對照組。PM組納入標準：（1）眼軸長度≥26.5 mm；（2）伴有等于或大于彌漫性脈絡膜萎縮的眼底病變[14]。對照組納入標準：（1）眼軸長度22.0～24.0 mm；（2）無眼底病變。兩組患者均無眼外傷史、PM相關并發癥治療史以及除白內障或近視以外的其他眼部疾病，均未使用全身抗代謝藥、免疫抑制劑或皮質類固醇等藥物。兩組患者性別（χ2=1.247，P=0.264）、年齡（t=－1.384，P=0.176）比較，差異均無統計學意義；眼軸長度比較，差異有統計學意義（t=11.302，P=0.000）（表1）。兩組患者晶狀體混濁程度分級均為C2N2P2。
表1
兩組質譜檢測標本基本信息比較
1.2 樣本制備
在白內障手術操作之前從手術眼收集100～150 μl前房水。鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉后，0.5%聚維酮碘溶液沖洗結膜囊2次，平衡鹽溶液充分沖洗結膜囊。在任何眼內操作之前，于手術顯微鏡下用1 ml結核菌素注射器在透明角膜緣處采集房水標本，并將其迅速轉移到離心管中，－80 ℃凍存備用。
50 μl房水中加入8 mol/L尿素裂解液350 μl，室溫裂解5 min。冰上超聲破碎后，15 ℃條件下16 000×g離心10 min。取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。取100 μg蛋白加入1 mol/L二硫蘇糖醇1 μl，37 ℃孵育1 h。加入1 mol/L吲哚乙酸4 μl，避光，37 ℃孵育1 h。平衡相對分子質量10×103超濾管1次（50 mmol/L碳酸氫銨400 μl，14 000×g離心10 min），加入100 μg還原烷基化后的樣本，15 ℃條件下14 000×g離心20 min，加入50 mmol/L碳酸氫銨400 μl清洗3次，更換收集管，加入50 mmol/L碳酸氫銨50 μl到超濾管中，加入2 μg胰酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液槍混勻超濾管中的樣本，4 ℃條件下14 000×g離心20 min，加50 mmol/L碳酸氫銨50 μl沖洗3次，向收集管中加入體積比為1%的甲酸終止酶切，60 ℃真空蒸干。用12 μl 0.1%甲酸重懸樣本，Nanodrop分光光度計測量，取等量的肽段進行質譜的檢測。
1.3 非標記液相色譜-串聯質譜檢測
采用EkspertnanoLC 415（美國AB SCIEX公司）液相色譜和TripleTOF 6600（美國AB SCIEX公司）質譜系統進行質譜分析。用上樣緩沖液（0.1%甲酸、2%乙腈、97.9%水）將2 μg酶切后的肽段載入到C18填充的離子阱上（100 μm×2 cm，填料規格3 μm，120A）。使用不同梯度的梯度緩沖液（0.1%甲酸、97.9%乙腈、2%水）洗脫離子阱，肽段經過C18填充的柱子后（150 μm×15 cm，填料規格1.9 μm，120A），形成帶電的離子噴霧，離子噴霧進入質譜進行檢測。梯度緩沖液的有效洗脫梯度為5%～35%，有效時間為91 min，流速為400 nl/min。質譜參數：飛行時間質譜累加時間為0.25 s，質量掃描范圍為相對分子質量300～1500，電荷選擇+2～+5價離子，質量偏差50 ppm以內，每個循環內最大監測離子數為60，每次檢測隔離已檢測離子16 s，碎裂能量模式為動態的碎裂模式。產物離子累加時間為0.04 s，采用高靈敏的掃描模式，其余參數與飛行時間質譜參數相同。
1.4 差異表達蛋白鑒定
使用Maxquant軟件1.6.3.4版本對質譜采集的原始數據進行數據庫的搜索。對搜索后的數據進行統計學分析，篩選可定量蛋白，使用兩獨立樣本t檢驗計算蛋白表達的P值。篩選P＜0.05且差異倍數大于1.5的差異表達蛋白，去除有0的結果后得到差異表達蛋白的火山圖。
1.5 ELISA驗證實驗
為了進一步驗證質譜結果的可靠性，另收集20例合并PM的老年性白內障患者（PM組）和20例不合并近視的單純性老年性白內障患者（對照組），患者納入和排除標準均同質譜檢測樣本。兩組患者性別（χ2=0.960，P=0.327）、年齡（t=－1.252，P=0.220）比較，差異均無統計學意義；眼軸長度比較，差異有統計學意義（t=14.306，P=0.000）（表2）。兩組患者晶狀體混濁程度均為C2N2P2。隨機選取5個差異表達蛋白在PM組和對照組中進行ELISA驗證。
表2
兩組ELISA驗證標本基本信息比較
1.6 生物信息學分析
為了進一步探索差異蛋白表達的變化，用基因注釋（GO）功能富集對差異表達蛋白進行生物學過程、分子功能和細胞成分三方面分析。為了探索重要的代謝通路，采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析差異表達蛋白的生物學功能。
1.7 統計學分析
采用SPSS 19.0軟件行統計學分析。兩組間患者性別比較采用χ2檢驗，年齡和眼軸長度比較采用兩獨立樣本t檢驗。分析差異表達蛋白時，對每個可定量蛋白的變化倍數以2為底取對數（Log2FC）作為橫坐標，將P值以10為底取負對數［－log10（P值）］作為縱坐標繪制火山圖。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 差異表達蛋白分析
PM組、對照組患者房水標本平均蛋白濃度分別為（1 303.06±131.62）ng/L和（734.83±62.54）ng/L。在32份房水標本中共鑒定出583個可定量蛋白質。PM組和對照組之間有101個差異表達蛋白，包括63個上調蛋白和38個下調蛋白。上調明顯的蛋白有α-胰蛋白酶抑制劑重鏈（IITH）1、補體C4B、單核細胞分化抗原CD14、皮質類固醇結合球蛋白（SERPINA6）、IITH2、補體C8B等。下調明顯的蛋白有免疫球蛋白kappa變量（IGKV）3-11、IGKV3-15、乳酸脫氫酶、載脂蛋白D、視網膜劈裂蛋白（RS1）、肌營養不良蛋白相關糖蛋白1（DAG1）、溶菌酶、TGFβ誘導蛋白（TGFBI）等（圖1）。這101個差異表達蛋白的分類主要是蛋白結合活性調節因子（25.70%）、防御/免疫蛋白（24.80%）、蛋白質修飾酶（11.40%）、代謝物間轉換酶（8.70%）、細胞外基質蛋白（7.80%）等（圖2）。
圖1
差異表達蛋白火山圖。IITH1：α-胰蛋白酶抑制劑重鏈1；SERPINA6：皮質類固醇結合球蛋白；IITH2：α-胰蛋白酶抑制劑重鏈2；IGKV3-11：免疫球蛋白kappa變量3-11；IGKV3-15：免疫球蛋白kappa變量3-15；LDHA：乳酸脫氫酶；APOD：載脂蛋白D；RS1：視網膜劈裂蛋白；DAG1：肌營養不良蛋白相關糖蛋白1；LYZ：溶菌酶；TGFBI：TGFβ誘導蛋白
圖2
不同分類差異表達蛋白的富集度對比
2.2 ELISA驗證質譜結果的可靠性
ELISA驗證結果顯示，隨機選取的5個差異表達蛋白在PM組和對照組之間的表達變化趨勢均與非標記定量蛋白質組學分析結果一致（圖3）。
圖3
隨機選擇的5個差異表達蛋白的ELISA驗證結果均與非標記定量蛋白質組學分析結果一致。3A示視網膜劈裂蛋白（RS1）；3B示乳酸脫氫酶（LDHA）；3C示CD14；3D示C4B；3E示溶菌酶（LYZ）。*：P＜0.05，***：P＜0.001
2.3 生物信息學分析
GO功能富集分析結果表明，101個差異表達蛋白與不同的生物學過程、分子功能和細胞組分有關。在生物學過程方面，差異表達蛋白主要富集在補體激活、炎癥應答、細胞黏附等方面。在分子功能方面，差異表達蛋白主要富集在補體結合、細胞外基質結合等方面。在細胞組分方面，差異表達蛋白主要富集于細胞外囊泡、細胞外區域等方面（圖4）。
圖4
差異表達蛋白基因注釋分析結果。1：補體激活；2：炎癥應答；3：細胞黏附；4：蛋白水解；5：血小板脫顆粒；6：補體激活的調節；7：內肽酶活性的負調節；8：先天免疫反應；9：受體介導細胞攝粒作用；10：免疫應答；11：補體結合；12：細胞外基質結合；13：絲氨酸型內肽酶活性；14：絲氨酸型內肽酶抑制活性；15：肝素結合；16：內肽酶抑制活性；17：受體結合；18：脂質結合；19：蛋白結合；20：鈣離子結合；21：細胞外囊泡；22：細胞外區域；23：細胞外間隙；24：血液微粒；25：細胞質膜；26：細胞外基質；27：血小板α顆粒；28：蛋白胞外基質；29：細胞表面；30：基底膜
KEGG通路富集分析結果表明，101個差異表達蛋白富集于7條代謝通路（表3）。其中，26個差異表達蛋白富集于補體和凝血級聯通路，10個差異表達蛋白富集于金黃色葡萄球菌感染通路，11個差異表達蛋白富集于系統性紅斑狼瘡通路，4個差異表達蛋白富集于細胞外基質-受體相互作用通路。
表3
差異表達蛋白KEGG通路富集結果
3 討論
當PM出現黃斑脈絡膜新生血管、脈絡膜和視網膜退行性病變時將嚴重影響患者視力，甚至致盲。積極尋找PM的潛在發病機制，開發有效的治療靶點，并預測其進展和預后具有重要的臨床意義。雖然PM的病理改變主要表現在眼后節，但已有多項研究證據表明房水蛋白質組的變化與眼底疾病密切相關[15-16]。本研究通過對白內障手術中獲取到的房水標本進行檢測分析，發現32份房水標本中存在581個蛋白質，其中101個蛋白存在差異表達，包括63個上調蛋白和38個下調蛋白。由于PM組和對照組患者的白內障基線病情相同，所以我們認為在房水中發現的差異表達蛋白可以排除白內障病情對結果的影響，僅與PM的發生和發展存在密切聯系。通過生物信息學分析，我們發現免疫和炎癥的相互作用以及細胞外基質重塑在PM的發病機制中起著主要作用。
KEGG通路富集分析結果表明，富集度最顯著的通路為補體和凝血級聯，包含26個差異表達蛋白，這與GO功能富集分析結果相一致。這些蛋白質中的大多數具有促炎功能，其中一些在近視患者中呈上調趨勢。此外，其他的KEGG富集通路（金黃色葡萄球菌感染、系統性紅斑狼瘡、朊病毒病、百日咳等通路）都與免疫和炎癥相互作用有關。GO功能富集分析結果也表明，差異表達蛋白的生物學過程在補體激活和炎癥應答反應中富集度高。值得注意的是，屬于胰蛋白酶抑制劑家族的ITIH1和ITIH2在炎癥中起著重要的作用，在PM患者中表現為上調[17]。此外，與對照組相比，PM組中有更高水平的SERPIN家族的許多炎癥蛋白，如SERPIN6和SERPIN1。這和另一項近視的蛋白質組學研究結果相似[18]。另外，已發現補體系統在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病視網膜病變和老年性黃斑變性等多種眼部疾病中表達紊亂[19-20]。在本研究中，許多差異表達蛋白，如C4B、CD14、C8B、C8A等，都是參與補體激活和調節的關鍵免疫蛋白，在PM組中明顯上調。從差異表達蛋白的GO功能富集分析結果來看，差異表達蛋白生物學過程中補體激活的明顯富集提示PM患者免疫調節活化。由此可見，補體激活與炎癥的相互作用在PM的發病機制中起著重要的作用。免疫和炎癥相關治療可能是PM的一種新的臨床治療策略，但是目前尚未得到足夠的關注。
鞏膜是PM發展過程中的活躍組織。眼軸長短和屈光狀態受鞏膜細胞外基質組成及其生物力學性能的調節[21]。本研究KEGG通路富集分析中富集了細胞外基質-受體相互作用途徑，這與GO功能富集分析結果一致。DAG1是肌營養不良蛋白-糖蛋白復合物的組成成分，參與了細胞骨架與細胞外基質之間附著的主要作用機制，經常在肌-眼-腦綜合征中被報道[22]。肌-眼-腦綜合征患者常常合并嚴重的先天性近視，其致病機制之一就是外周膜蛋白DAG1糖基化異常[23]。與對照組相比，PM組TGFBI蛋白明顯下降，這和另一項有關近視蛋白質組學的研究結果相一致[18]。TGFBI蛋白是一種分泌型細胞外基質蛋白，已被證實能調節多種細胞的附著[24]。鞏膜合成和分泌TGFBI蛋白，在促進與近視發展相關的鞏膜細胞外基質重塑中起著重要作用[25]。TGFBI蛋白可調節人鞏膜成纖維細胞在成纖維細胞層界面附著于Ⅰ型膠原，從而調節層狀滑移量、鞏膜粘彈性和鞏膜延長速率[25]。雖然導致PM發生發展的病因尚不清楚，但這些與鞏膜生物力學特性改變有關的細胞外基質的生化變化被認為是導致眼軸增長和近視發展的原因。
另外值得關注的結果是，本研究發現了RS1在PM患者房水中明顯下調。RS1也稱為X連鎖青少年視網膜劈裂蛋白，由RS1基因編碼，是一種由光感受器細胞和雙極細胞分泌的相對分子質量24×103的視網膜特異性蛋白，作為維持視網膜突觸結構的細胞黏附蛋白[26]。X連鎖先天性視網膜劈裂是由RS1基因突變引起的，其主要機制是其盤狀蛋白結構域、亞基組裝和內質網加工缺陷[27-28]。鑒于視網膜劈裂是PM的一個常見并發癥，據此我們推測RS1可能是PM發生發展的關鍵蛋白之一，它通過減少細胞黏附和破壞視網膜的突觸結構而發揮作用。GO功能富集分析的生物學過程富集結果即細胞黏附也支持這一結果，但RS1蛋白與PM的內在聯系還有待進一步研究。
本研究首次通過非標記液相色譜-串聯質譜定量蛋白質組學分析發現PM患者房水蛋白質組譜發生了變化，并且這種變化得到了ELISA實驗的進一步證實。這些與PM相關的差異表達蛋白主要參與免疫和炎癥相互作用以及細胞外基質的重塑。本研究結果提供了PM的發生發展與免疫炎癥反應和細胞外基質重塑關系的新證據，指導了PM的致病機制研究和治療方案探索的方向，但其具體的作用機制仍需要進一步研究。本研究的不足之處在于因臨床樣本取材的限制，我們無法獲得年輕PM患者和正常人的房水進行蛋白組學研究，所以只能盡量控制兩組白內障基線病情的一致性，從而減輕白內障對研究結果的干擾。
