引用本文： 謝斐葭, 賀濤, 楊寧, 楊家翼, 花蒂豪, 羅晉媛, 李宗媛, 邢怡橋. 下調熱休克蛋白B8在視神經損傷中對小鼠視網膜神經節細胞的保護作用. 中華眼底病雜志, 2021, 37(4): 298-306. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200609-00271 復制
創傷性視神經病變（TON）以軸突變性和視網膜神經節細胞（RGC）死亡為主要病理特征，可導致永久性視力損害[1-2]。視神經鉗夾（ONC）是最常用于模擬TON的動物實驗模型[3]。研究發現，ONC后視網膜組織中RGC減少且胞體變小，神經纖維層菲薄，同時神經膠質細胞明顯增生[4]。目前對TON基本病理生理和分子機制的認識仍然有限[2]，且尚無有效治療措施[1, 5]。熱休克蛋白B8（HspB8）是小熱休克蛋白家族成員，廣泛存在于各種組織中，并在各類應激后迅速上調[6]。HspB8作為分子伴侶與B淋巴細胞瘤/白血病-2基因相關永生基因3結合并促進自噬，在各種神經退行性疾病發展中具有決定性影響，并在大腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用[7-8]。但有研究發現HspB8的功能毒性增加也可能會促使神經退行性疾病加重[9]。HspB8在細胞凋亡中具有相反作用，而目前仍不清楚其中的分子機制[10]。RGC中HspB8相關研究較少，本研究通過重組腺相關病毒（AAV）2敲低HspB8的表達，探索HspB8對ONC模型小鼠視覺功能及RGC存活率的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組
雄性C57BL/6J小鼠66只，8周齡，體重18～22 g，由武漢大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027）。飼養于標準（12 h光/暗循環）清潔級環境中。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會許可[倫理編號：WDRM動（福）第20190113號]。實驗前常規飼養7 d。小鼠眼前節、眼壓正常，瞳孔對光反射正常；散瞳檢查排除眼部疾病。
采用隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、ONC組、AAV2-小發夾（sh）HspB8組、ONC+AAV2-shHspB8組、ONC+AAV2組，分別為10、20、16、10、10只，雙眼均作為實驗眼。正常對照組不作任何處理；ONC組為單純ONC模型，建模后3、5、7 d處死小鼠取材，據此再分為ONC3組、ONC5組、ONC7組；AAV2-shHspB8組玻璃體腔注射AAV2-shHspB8-綠色熒光蛋白（GFP）后第1、2、3、4周分別取材并作為AAV2-shHspB8-1w組、AAV2-shHspB8-2w組、AAV2-shHspB8-3w組、AAV2-shHspB8-4w組（即AAV2-shHspB8組）；ONC+AAV2-shHspB8組、ONC+AAV2組玻璃體腔注射AAV2-shHspB8-GFP、AAV2-GFP后第23天建立ONC損傷模型。剔除晶狀體受損、手術后出血或眼部感染的小鼠。
1.2 病毒構建
利用AAV2載體（GV478，序列元件U6-MCS-CAG-增強型GFP（EGFP，上海Genechem公司），構建針對HspB8的shRNA-AAV2（靶向序列：5'-CCGGAAGAGCTGATGGTAA-3'）（上海Genechem公司）：AAV2-shHspB8-GFP，無shHspB8的空GV478載體作為陰性病毒：AAV2-GFP，2種病毒均含有EGFP元件及其啟動子CAG元件。提純并使用稀釋梯度法測量病毒滴度。AAV2-shHspB8-GFP、AAV2-GFP滴度分別為1.58×1012、1.95×1012 v.g/ml。分裝凍存于－80 ℃冰箱。
1.3 小鼠玻璃體腔注射病毒（IVT）與ONC建模
IVT參照文獻[11]的方法。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，0.01%丙美卡因點眼表面麻醉。動物麻醉后，使用雙頭玻璃微量移液器拉制儀（日本Narishige公司）拉制的玻璃針、可編程納升注射器（美國Drummond公司）行雙眼IVT。玻璃針避開血管，于角鞏膜緣后方1～2 mm處鞏膜進針，緩慢注射1 μl陽性病毒AAV2-shHspB8-GFP原液或陰性病毒AAV2-GFP原液，注射完畢停留1 min后緩慢退針。IVT后4周對小鼠進行視功能檢測，并分別于1、2、3、4周頸椎脫臼處死摘除眼球，剝離視網膜。
參照文獻[12]的方法建立ONC模型。根據研究結果中的病毒表達高峰，將ONC時間確定為IVT后23 d，使得病毒表達高峰與造模取材時間重合。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，0.01%丙美卡因點眼表面麻醉，于顳側穹結膜處切開，鈍性分離暴露視神經，于球后2 mm處用自閉合的Dumont鑷子鉗夾視神經并持續8 s。注意避開周圍血管，尤其是視網膜中央動脈[13]，檢眼鏡檢查確認視網膜血供無損傷。
1.4 視動反應（OMR）檢測小鼠視敏度
建模后5 d，參照文獻[14]的方法采用MATLAB軟件（美國MathWorks公司）和虛擬光眼視動力儀OptoMotry行OMR檢測。小鼠暗適應4 h后置于裝置平臺中心，周圍4個屏幕上顯示確定對比度的轉動光柵，當小鼠感知到光柵投射出的以一定速度轉動的條紋后，頭部跟隨條紋旋轉并產生角速度與之相近的運動，采用雙盲法確定小鼠能產生反射的最高光柵空間頻率（cyc/deg），并將作為視敏度衡量小鼠的視覺功能[14]。
1.5 全視野閃光視網膜電圖（ff-ERG）
建模后5 d，小鼠暗適應12 h后于紅色照明下腹腔注射戊巴比妥鈉全身麻醉，0.5%鹽酸去氧腎上腺素、0.5%托吡卡因散瞳，1%透明質酸鈉保證全程小鼠角膜濕潤。鍍金線圈電極作為記錄電極置于角膜中央表面，不銹鋼針電極插入兩耳間皮下和尾部，分別作為參考電極、接地電極，關閉暗紅色照明，Ganzfeld全視野刺激器和RetiMINER視覺電生理儀（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）記錄白色刺激光下的暗適應ff-ERG，光強度依次遞增，分別為0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000、10.000 cds/m2。a波波谷至b波波峰的距離記錄為b波振幅，基線到a波波谷的距離記錄為a波振幅，b波上升側的一系列高頻子波記錄為振蕩電位（OPs）。參照文獻[15]的方法記錄明視負向反應（PhNR）：充分暗適應的小鼠于25 cds/m2綠光背景中明適應8 min，給予10.0 cds/m2綠光刺激，將基線至b波后負向波波谷的距離記錄為PhNR振幅。
1.6 全視網膜鋪片及RGC計數
建模后3、5、7 d，處死小鼠并摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min，去除眼前節和玻璃體，分離視網膜并用含有5%牛血清白蛋白（BSA，武漢GoodbioTechnology公司）、0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（PBS）4 ℃封閉過夜，Brn3a抗體（兔抗小鼠，1:1000，德國Synaptic Systems公司）4 ℃孵育48 h，PBS漂洗后Alexa Fluor594 IgG二抗（驢抗兔，1:500，美國Jackson公司）室溫孵育2 h，PBS漂洗后視網膜上剪4個切口呈四葉草狀鋪平，抗熒光淬滅封片劑封片并于正置熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）下觀察，10×40倍視野下，分別在距視盤約0.5、1.6、2.7 mm處取3個視野，4個視網膜瓣共12個視野，拍照并應用ImageJ軟件（美國國立衛生研究院）對存活RGC進行計數。
1.7 免疫組織化學染色觀察AAV2轉染效率
IVT后1、2、3、4周，處死小鼠并摘除眼球，4%多聚甲醛固定1 h，去除眼前節后依次于10%、20%蔗糖溶液中脫水2 h，30%蔗糖溶液中4 ℃過夜，OCT復合物（美國Sakura公司）包埋，冰凍切片機（德國Leica公司）切片，厚度14 μm。視網膜切片置于含5% BSA、0.5%Triton X-100的PBS緩沖液中室溫封閉2 h，抗GFP抗體（兔抗小鼠，1:1000，德國Merck Millipore公司）4 ℃孵育過夜；5 min，5次PBS充分洗滌后與Alexa Fluor 488 IgG二抗（驢抗兔，1:500，美國Jackson公司）室溫孵育2 h。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細胞核進行復染，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡（FV1200，日本Olympus公司）觀察、拍照。
1.8 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠視網膜中HspB8蛋白的相對表達
建模后3、7 d，處死小鼠摘除眼球，于冰上迅速取出視網膜，立即浸于含有苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中，勻漿并離心后收集上清液，二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒檢測視網膜總蛋白濃度。15%十二烷基硫鈉丙烯酰胺凝膠電泳結束后，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜于含5%脫脂牛奶、0.1%Tween-20Tris緩沖鹽（TBS）溶液中室溫封閉2 h，HspB8（兔抗小鼠，1:1000，美國Cell Signaling Technology公司）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（兔抗小鼠，1:1000，中國Servicebio公司）一抗4 ℃孵育過夜，含0.1%Tween-20的TBS溶液洗滌10 min，3次后，辣根過氧化物酶標記的IgG（山羊抗兔，1:3000，中國Servicebio公司）室溫孵育2 h。化學發光底物（超敏）試劑盒（中國Biosharp公司）、化學發光儀（ChemiDocTM Touch Imaging System，美國Bio-Rad公司）顯影，應用ImageJ軟件（美國國立衛生研究院）進行分析。實驗重復10次，取平均值。
1.9 統計學方法
采用Graph Pad Prism 8.0軟件行統計學分析。定量數據以均數±標準差（
±s）表示。2個獨立數據組間比較，任一組數據呈偏態分布時采用Mann-Whitney U檢驗，呈正態分布且方差齊則采用獨立樣本t檢驗，呈正態分布但方差不齊時采用Welch法校正t檢驗。3個組及以上正態數據組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05再采用Bonferroni t檢驗進行兩兩比較，偏態數據采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
Western blot檢測結果顯示，正常對照組、ONC3組、ONC7組小鼠視網膜中HspB8/GAPDH比值即HspB8蛋白相對表達量分別為0.18±0.02、0.44±0.01、0.23±0.03；3個組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=43.63，P＜0.01）。與正常對照組、ONC7組比較，ONC3組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；ONC7組與正常對照組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。
圖1
正常對照組、ONC3組、ONC7組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達情況。1A示電泳圖；1B示3個組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達結果（n=10）。與正常對照組比較，ONC3組小鼠視網膜中HspB8表達顯著升高 **P＜0.01。ONC：視神經鉗夾；HspB8：熱休克蛋白B8；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
暗適應OMR檢測結果顯示，ONC5組、正常對照組小鼠視敏度分別為（0.09±0.04）、（0.41±0.02）cyc/deg；ONC5組小鼠視敏度較正常對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。ff-ERG檢測結果顯示，與正常對照組比較，ONC5組小鼠a波、b波振幅下降，b波潛伏期延長，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1，2；圖2）；OPs、PhNR振幅下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表3）。
表1
正常對照組、ONC5組a波振幅、潛伏期比較（
±s）
圖2
正常對照組、ONC5組小鼠全視野閃光ERG a波、b波振幅、潛伏期比較。2A、2B分別示a波振幅（n=12）、b波振幅（n=10）；2C、2D分別示a波潛伏期（n=10）、b波潛伏期（n=10）。可見ONC5組小鼠a波、b波振幅下降，b波潛伏期延長 *P＜0.05，**P＜0.01。ERG：視網膜電圖；ONC：視神經鉗夾
表2
正常對照組、ONC5組b波振幅、潛伏期比較（
±s）
表3
正常對照組、ONC5組OPs、PhNR振幅比較（μV，
±s）
熒光顯微鏡下觀察發現，正常對照組小鼠RGC邊界清晰，胞核結構清楚，染色正常；不同ONC時間組小鼠RGC邊界及結構模糊，染色較淡（圖3A～3D）。正常對照組、ONC3、ONC5、ONC7組小鼠RGC存活率分別為（100.00±1.50）%、（78.58±2.82）%、（41.44±1.22）%、（16.20±1.03）%，不同ONC時間組小鼠RGC呈時間依賴性降低；與正常對照組比較，差異有統計學意義（F=384.90，P＜0.01）。
圖3
正常對照組、不同ONC時間組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。3A~3D分別示正常對照組、ONC3組、ONC5組、ONC7組。正常對照組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；不同時間ONC組RGC亞結構模糊，染色寡淡，且RGC數目隨鉗夾后時間延長而減少 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。ONC：視神經鉗夾；RGC：視網膜神經節細胞
激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，病毒轉染效率在其轉染后第4周最高，且RGC層（GCL）、內叢狀層（IPL）、內核層（INL）、外叢狀層（OPL）、外核層（ONL）均有GFP表達（圖4）。
圖4
小鼠視網膜重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8 GFP轉染后不同時間激光共聚焦顯微鏡像。4A~4D分別示轉染后1、2、3、4周。轉染效率隨時間升高并于第4周達峰值；GCL、IPL、INL、OPL、ONL均有GFP表達 GFP和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚免疫熒光共染 標尺：50 μm n=3。GCL：視網膜神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；GFP：綠色熒光蛋白
轉染后4周，AAV2-shHspB8組小鼠視敏度為（0.41±0.02）cyc/deg；與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。AAV2-shHspB8組、正常對照組小鼠暗適應a波、b波振幅和潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表4，5；圖5）；AAV2-shHspB8組小鼠OPs、PhNR振幅分別為（361.12±15.20）、（41.35±5.49）μV，與正常對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。與正常對照組相比，AAV2-shHspB8組小鼠RGC形態無明顯差異（圖6）。正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠RGC存活率分別為（100.00±1.50）%、（102.42±2.01）%，差異無統計學意義（P＞0.05）。
表4
正常對照組、AAV2-shHspB8組a波振幅、潛伏期比較（
±s）
圖5
正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠全視野閃光ERG a波、b波振幅、潛伏期比較。5A、5B分別示a波、b波振幅；5C、5D分別示a波、b波潛伏期。a波振幅n=12，其余n=10。ERG：視網膜電圖；AAV2-shHspB8：重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8
圖6
正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。6A示正常對照組；6B示AAV2-shHspB8組。2個組小鼠視網膜神經節細胞結構與數量無明顯差異 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。AAV2-shHspB8：重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8
表5
正常對照組、AAV2-shHspB8組b波振幅、潛伏期比較（
±s）
暗適應OMR檢測結果顯示，ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠視敏度分別為（0.09±0.04）、（0.18±0.05）、（0.11±0.04）cyc/deg；ONC5+AAV2-shHspB8組視敏度較ONC5組、ONC5+AAV2組升高，但差異無統計學意義（H=0.367，P＞0.05）。ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠RGC存活率分別為（41.44± 1.22）%、（52.98±2.00）%、（42.67±1.80）%；3個組RGC存活率比較，差異有統計學意義（F=10.62，P＜0.01）。組間兩兩比較，ONC5+AAV2-shHspB8組較ONC5組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；ONC5+AAV2組與ONC5組差異無統計學意義（P＞0.05）。熒光顯微鏡像觀察結果顯示，ONC5+AAV2-shHspB8組小鼠RGC細胞結構較ONC5組清晰，數目更多（圖7）。
圖7
ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。7A～7C分別示ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組。ONC5組、ONC5+AAV2組視網膜神經節細胞（RGC）染色稍淡，結構較為模糊；ONC5+AAV2-shHspB8組RGC形態規整，數量較前2個組更多 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。 ONC：視神經鉗夾；AAV2：重組腺相關病毒2；shHspB8：小發夾熱休克蛋白B8
3 討論
本研究結果顯示，小鼠視網膜中有HspB8表達且ONC誘導其增加，提示HspB8可能參與了ONC后RGC死亡的調節。為探究HspB8這種變化對RGC的確切作用，我們構建了敲低其表達的AAV2-shHspB8-GFP，病毒成功轉染視網膜各層，并在ONC后保護RGC，使其免于死亡。因此，我們認為，HspB8對ONC模型中的RGC具有損害作用。
ONC以RGC損傷為主要病理特征，但若ONC過程中操作不當則會造成視網膜血供受損，影響外層視網膜發生相應的功能學改變。注意保護睫狀后動脈和視網膜中央動脈，并避免長時間牽引眼球，能夠避免視網膜血供受阻[12, 16]。排除意外造成的缺血性損傷之后，方能將ff-ERG變化歸因于視神經損傷本身。研究顯示，視神經損傷后視網膜中膽堿能無長突細胞免疫染色與正常小鼠比較無明顯變化[17]，而膽堿能視網膜神經元對缺血性損傷非常敏感[18]，說明視神經損傷對視網膜血供無顯著影響。
視覺行為學檢測能準確反映小鼠視覺功能，將其應用于視網膜疾病治療策略有效性評估具有非常重要的意義[19]。RGC缺陷能夠明顯影響小鼠OMR[20]。本研究結果顯示，ONC5組暗適應視敏度明顯低于正常對照組，結果準確反映了ONC造成的功能性變化。雖然本研究中ONC5+AAV2-shHspB8組暗適應視敏度較ONC5組有升高趨勢，但差異并無統計學意義，后續研究可以通過增加病毒液注射量，改變鉗夾時間點等策略進一步探究敲低HspB8對小鼠OMR的積極作用。
暗適應ff-ERG中a波來源于光感受器的光傳導，b波來源于雙極細胞和Müller細胞去極化，OPs由無長突細胞和反饋電路產生[21]。目前，視神經損傷對ff-ERG影響的相關研究結果并不統一。部分研究顯示TON對大鼠ff-ERG沒有影響[22]；但有研究認為，暗適應ff-ERG的a波、b波振幅在視神經損傷后下降，OPs振幅也較正常組降低[23-25]，此與本研究結果一致，ONC后a波、b波、OPs振幅降低，b波潛伏期延長。有學者在ONC后對視網膜進行原位末端標記法（TUNEL）染色發現，GCL、INL均存在TUNEL陽性細胞，說明ONC不僅損害了RGC，也導致了雙極細胞的死亡，這可能是導致b波、OPs振幅下降的原因[25]。另有研究認為，TON后a波、b波的改變可能是由Müller細胞激活所介導，其原因是膠質纖維酸性蛋白mRNA水平在TON后升高了[16]，或是將這種變化歸因于TON后成纖維細胞生長因子2表達顯著上調誘導的視網膜功能抑制[26]。另外，RGC死亡導致視網膜電阻的改變或TON后光感受器細胞相關基因的瞬時下調[23,27]，都可能促成視神經損傷后的a波、b波、OPs受損的這種電生理改變。暗適應ff-ERG中PhNR振幅下降與RGC丟失呈正相關，其被認為能監測RGC的電生理功能[15]。本研究結果顯示，ONC后PhNR振幅較正常對照組下降，此為RGC功能損害，細胞死亡的電生理反映。
研究顯示，全視網膜鋪片RGC計數、TUNEL染色陽性RGC計數、視神經髓磷脂染色以及視神經神經絲染色均可以作為RGC數目、結構變化的指標[28]；此外，PhNR振幅、閃光視覺誘發電位等視覺電生理的檢測則能反映RGC的功能變化。本研究結果顯示，ONC組小鼠RGC存活率約為41%，而視敏度卻下降了78%。有學者認為，視神經損傷后功能損害大于RGC數目、軸突丟失現象，說明殘存的受損軸突通常不能繼續傳遞視覺信號[28]。因此，可以通過以上檢測方法判斷下調HspB8除延長部分RGC的存活，是否還存在減少軸突損失、保護殘余細胞功能的神經保護作用。
HspB8主要在心臟疾病中進行研究，其在心肌缺血再灌注損傷中同時具有保護性和損害性作用，而這種雙重作用是由其表達量決定的[29]。亦有研究認為HspB8功能的毒性增加促進了神經退行性疾病的發展[9]。HspB8被眾多應激因子顯著誘導，而促進受損/錯誤折疊蛋白質的選擇性自噬是HspB8的重要作用[6]。近年眾多研究從mRNA、蛋白水平和超微結構特征等方面證實了視神經損傷后RGC中自噬的激活[30]。部分研究認為ONC后RGC的凋亡可能部分與自噬激活有關[31]。本研究結果發現，視網膜中的HspB8在ONC后增加，而抑制這種增加對RGC存活是有益的。因此，我們推測HspB8對鉗夾后RGC的損害作用可能是通過增加下游自噬流來實現的。與我們的觀點類似，研究發現在平滑肌細胞中，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶干擾了HspB8與BAG3的結合從而抑制了BAG3介導的自噬，最終維持了蛋白質穩態[32]。
本研究證實了HspB8在小鼠視網膜上的表達，并發現下調HspB8對ONC后的RGC死亡具有保護作用，為外傷性視神經病變的神經保護治療提供了思路，但仍欠缺HspB8損害作用的電生理表現及具體下游機制等相關內容，應做進一步探索以完善研究。
創傷性視神經病變（TON）以軸突變性和視網膜神經節細胞（RGC）死亡為主要病理特征，可導致永久性視力損害[1-2]。視神經鉗夾（ONC）是最常用于模擬TON的動物實驗模型[3]。研究發現，ONC后視網膜組織中RGC減少且胞體變小，神經纖維層菲薄，同時神經膠質細胞明顯增生[4]。目前對TON基本病理生理和分子機制的認識仍然有限[2]，且尚無有效治療措施[1, 5]。熱休克蛋白B8（HspB8）是小熱休克蛋白家族成員，廣泛存在于各種組織中，并在各類應激后迅速上調[6]。HspB8作為分子伴侶與B淋巴細胞瘤/白血病-2基因相關永生基因3結合并促進自噬，在各種神經退行性疾病發展中具有決定性影響，并在大腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用[7-8]。但有研究發現HspB8的功能毒性增加也可能會促使神經退行性疾病加重[9]。HspB8在細胞凋亡中具有相反作用，而目前仍不清楚其中的分子機制[10]。RGC中HspB8相關研究較少，本研究通過重組腺相關病毒（AAV）2敲低HspB8的表達，探索HspB8對ONC模型小鼠視覺功能及RGC存活率的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組
雄性C57BL/6J小鼠66只，8周齡，體重18～22 g，由武漢大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027）。飼養于標準（12 h光/暗循環）清潔級環境中。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會許可[倫理編號：WDRM動（福）第20190113號]。實驗前常規飼養7 d。小鼠眼前節、眼壓正常，瞳孔對光反射正常；散瞳檢查排除眼部疾病。
采用隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、ONC組、AAV2-小發夾（sh）HspB8組、ONC+AAV2-shHspB8組、ONC+AAV2組，分別為10、20、16、10、10只，雙眼均作為實驗眼。正常對照組不作任何處理；ONC組為單純ONC模型，建模后3、5、7 d處死小鼠取材，據此再分為ONC3組、ONC5組、ONC7組；AAV2-shHspB8組玻璃體腔注射AAV2-shHspB8-綠色熒光蛋白（GFP）后第1、2、3、4周分別取材并作為AAV2-shHspB8-1w組、AAV2-shHspB8-2w組、AAV2-shHspB8-3w組、AAV2-shHspB8-4w組（即AAV2-shHspB8組）；ONC+AAV2-shHspB8組、ONC+AAV2組玻璃體腔注射AAV2-shHspB8-GFP、AAV2-GFP后第23天建立ONC損傷模型。剔除晶狀體受損、手術后出血或眼部感染的小鼠。
1.2 病毒構建
利用AAV2載體（GV478，序列元件U6-MCS-CAG-增強型GFP（EGFP，上海Genechem公司），構建針對HspB8的shRNA-AAV2（靶向序列：5'-CCGGAAGAGCTGATGGTAA-3'）（上海Genechem公司）：AAV2-shHspB8-GFP，無shHspB8的空GV478載體作為陰性病毒：AAV2-GFP，2種病毒均含有EGFP元件及其啟動子CAG元件。提純并使用稀釋梯度法測量病毒滴度。AAV2-shHspB8-GFP、AAV2-GFP滴度分別為1.58×1012、1.95×1012 v.g/ml。分裝凍存于－80 ℃冰箱。
1.3 小鼠玻璃體腔注射病毒（IVT）與ONC建模
IVT參照文獻[11]的方法。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，0.01%丙美卡因點眼表面麻醉。動物麻醉后，使用雙頭玻璃微量移液器拉制儀（日本Narishige公司）拉制的玻璃針、可編程納升注射器（美國Drummond公司）行雙眼IVT。玻璃針避開血管，于角鞏膜緣后方1～2 mm處鞏膜進針，緩慢注射1 μl陽性病毒AAV2-shHspB8-GFP原液或陰性病毒AAV2-GFP原液，注射完畢停留1 min后緩慢退針。IVT后4周對小鼠進行視功能檢測，并分別于1、2、3、4周頸椎脫臼處死摘除眼球，剝離視網膜。
參照文獻[12]的方法建立ONC模型。根據研究結果中的病毒表達高峰，將ONC時間確定為IVT后23 d，使得病毒表達高峰與造模取材時間重合。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，0.01%丙美卡因點眼表面麻醉，于顳側穹結膜處切開，鈍性分離暴露視神經，于球后2 mm處用自閉合的Dumont鑷子鉗夾視神經并持續8 s。注意避開周圍血管，尤其是視網膜中央動脈[13]，檢眼鏡檢查確認視網膜血供無損傷。
1.4 視動反應（OMR）檢測小鼠視敏度
建模后5 d，參照文獻[14]的方法采用MATLAB軟件（美國MathWorks公司）和虛擬光眼視動力儀OptoMotry行OMR檢測。小鼠暗適應4 h后置于裝置平臺中心，周圍4個屏幕上顯示確定對比度的轉動光柵，當小鼠感知到光柵投射出的以一定速度轉動的條紋后，頭部跟隨條紋旋轉并產生角速度與之相近的運動，采用雙盲法確定小鼠能產生反射的最高光柵空間頻率（cyc/deg），并將作為視敏度衡量小鼠的視覺功能[14]。
1.5 全視野閃光視網膜電圖（ff-ERG）
建模后5 d，小鼠暗適應12 h后于紅色照明下腹腔注射戊巴比妥鈉全身麻醉，0.5%鹽酸去氧腎上腺素、0.5%托吡卡因散瞳，1%透明質酸鈉保證全程小鼠角膜濕潤。鍍金線圈電極作為記錄電極置于角膜中央表面，不銹鋼針電極插入兩耳間皮下和尾部，分別作為參考電極、接地電極，關閉暗紅色照明，Ganzfeld全視野刺激器和RetiMINER視覺電生理儀（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）記錄白色刺激光下的暗適應ff-ERG，光強度依次遞增，分別為0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000、10.000 cds/m2。a波波谷至b波波峰的距離記錄為b波振幅，基線到a波波谷的距離記錄為a波振幅，b波上升側的一系列高頻子波記錄為振蕩電位（OPs）。參照文獻[15]的方法記錄明視負向反應（PhNR）：充分暗適應的小鼠于25 cds/m2綠光背景中明適應8 min，給予10.0 cds/m2綠光刺激，將基線至b波后負向波波谷的距離記錄為PhNR振幅。
1.6 全視網膜鋪片及RGC計數
建模后3、5、7 d，處死小鼠并摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min，去除眼前節和玻璃體，分離視網膜并用含有5%牛血清白蛋白（BSA，武漢GoodbioTechnology公司）、0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（PBS）4 ℃封閉過夜，Brn3a抗體（兔抗小鼠，1:1000，德國Synaptic Systems公司）4 ℃孵育48 h，PBS漂洗后Alexa Fluor594 IgG二抗（驢抗兔，1:500，美國Jackson公司）室溫孵育2 h，PBS漂洗后視網膜上剪4個切口呈四葉草狀鋪平，抗熒光淬滅封片劑封片并于正置熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）下觀察，10×40倍視野下，分別在距視盤約0.5、1.6、2.7 mm處取3個視野，4個視網膜瓣共12個視野，拍照并應用ImageJ軟件（美國國立衛生研究院）對存活RGC進行計數。
1.7 免疫組織化學染色觀察AAV2轉染效率
IVT后1、2、3、4周，處死小鼠并摘除眼球，4%多聚甲醛固定1 h，去除眼前節后依次于10%、20%蔗糖溶液中脫水2 h，30%蔗糖溶液中4 ℃過夜，OCT復合物（美國Sakura公司）包埋，冰凍切片機（德國Leica公司）切片，厚度14 μm。視網膜切片置于含5% BSA、0.5%Triton X-100的PBS緩沖液中室溫封閉2 h，抗GFP抗體（兔抗小鼠，1:1000，德國Merck Millipore公司）4 ℃孵育過夜；5 min，5次PBS充分洗滌后與Alexa Fluor 488 IgG二抗（驢抗兔，1:500，美國Jackson公司）室溫孵育2 h。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細胞核進行復染，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡（FV1200，日本Olympus公司）觀察、拍照。
1.8 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠視網膜中HspB8蛋白的相對表達
建模后3、7 d，處死小鼠摘除眼球，于冰上迅速取出視網膜，立即浸于含有苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中，勻漿并離心后收集上清液，二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒檢測視網膜總蛋白濃度。15%十二烷基硫鈉丙烯酰胺凝膠電泳結束后，電轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜于含5%脫脂牛奶、0.1%Tween-20Tris緩沖鹽（TBS）溶液中室溫封閉2 h，HspB8（兔抗小鼠，1:1000，美國Cell Signaling Technology公司）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（兔抗小鼠，1:1000，中國Servicebio公司）一抗4 ℃孵育過夜，含0.1%Tween-20的TBS溶液洗滌10 min，3次后，辣根過氧化物酶標記的IgG（山羊抗兔，1:3000，中國Servicebio公司）室溫孵育2 h。化學發光底物（超敏）試劑盒（中國Biosharp公司）、化學發光儀（ChemiDocTM Touch Imaging System，美國Bio-Rad公司）顯影，應用ImageJ軟件（美國國立衛生研究院）進行分析。實驗重復10次，取平均值。
1.9 統計學方法
采用Graph Pad Prism 8.0軟件行統計學分析。定量數據以均數±標準差（±s）表示。2個獨立數據組間比較，任一組數據呈偏態分布時采用Mann-Whitney U檢驗，呈正態分布且方差齊則采用獨立樣本t檢驗，呈正態分布但方差不齊時采用Welch法校正t檢驗。3個組及以上正態數據組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05再采用Bonferroni t檢驗進行兩兩比較，偏態數據采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
Western blot檢測結果顯示，正常對照組、ONC3組、ONC7組小鼠視網膜中HspB8/GAPDH比值即HspB8蛋白相對表達量分別為0.18±0.02、0.44±0.01、0.23±0.03；3個組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=43.63，P＜0.01）。與正常對照組、ONC7組比較，ONC3組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；ONC7組與正常對照組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。
圖1
正常對照組、ONC3組、ONC7組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達情況。1A示電泳圖；1B示3個組小鼠視網膜中HspB8蛋白表達結果（n=10）。與正常對照組比較，ONC3組小鼠視網膜中HspB8表達顯著升高 **P＜0.01。ONC：視神經鉗夾；HspB8：熱休克蛋白B8；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶
暗適應OMR檢測結果顯示，ONC5組、正常對照組小鼠視敏度分別為（0.09±0.04）、（0.41±0.02）cyc/deg；ONC5組小鼠視敏度較正常對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。ff-ERG檢測結果顯示，與正常對照組比較，ONC5組小鼠a波、b波振幅下降，b波潛伏期延長，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1，2；圖2）；OPs、PhNR振幅下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表3）。
表1
正常對照組、ONC5組a波振幅、潛伏期比較（±s）
圖2
正常對照組、ONC5組小鼠全視野閃光ERG a波、b波振幅、潛伏期比較。2A、2B分別示a波振幅（n=12）、b波振幅（n=10）；2C、2D分別示a波潛伏期（n=10）、b波潛伏期（n=10）。可見ONC5組小鼠a波、b波振幅下降，b波潛伏期延長 *P＜0.05，**P＜0.01。ERG：視網膜電圖；ONC：視神經鉗夾
表2
正常對照組、ONC5組b波振幅、潛伏期比較（±s）
表3
正常對照組、ONC5組OPs、PhNR振幅比較（μV，±s）
熒光顯微鏡下觀察發現，正常對照組小鼠RGC邊界清晰，胞核結構清楚，染色正常；不同ONC時間組小鼠RGC邊界及結構模糊，染色較淡（圖3A～3D）。正常對照組、ONC3、ONC5、ONC7組小鼠RGC存活率分別為（100.00±1.50）%、（78.58±2.82）%、（41.44±1.22）%、（16.20±1.03）%，不同ONC時間組小鼠RGC呈時間依賴性降低；與正常對照組比較，差異有統計學意義（F=384.90，P＜0.01）。
圖3
正常對照組、不同ONC時間組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。3A~3D分別示正常對照組、ONC3組、ONC5組、ONC7組。正常對照組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；不同時間ONC組RGC亞結構模糊，染色寡淡，且RGC數目隨鉗夾后時間延長而減少 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。ONC：視神經鉗夾；RGC：視網膜神經節細胞
激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，病毒轉染效率在其轉染后第4周最高，且RGC層（GCL）、內叢狀層（IPL）、內核層（INL）、外叢狀層（OPL）、外核層（ONL）均有GFP表達（圖4）。
圖4
小鼠視網膜重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8 GFP轉染后不同時間激光共聚焦顯微鏡像。4A~4D分別示轉染后1、2、3、4周。轉染效率隨時間升高并于第4周達峰值；GCL、IPL、INL、OPL、ONL均有GFP表達 GFP和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚免疫熒光共染 標尺：50 μm n=3。GCL：視網膜神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；GFP：綠色熒光蛋白
轉染后4周，AAV2-shHspB8組小鼠視敏度為（0.41±0.02）cyc/deg；與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。AAV2-shHspB8組、正常對照組小鼠暗適應a波、b波振幅和潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表4，5；圖5）；AAV2-shHspB8組小鼠OPs、PhNR振幅分別為（361.12±15.20）、（41.35±5.49）μV，與正常對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。與正常對照組相比，AAV2-shHspB8組小鼠RGC形態無明顯差異（圖6）。正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠RGC存活率分別為（100.00±1.50）%、（102.42±2.01）%，差異無統計學意義（P＞0.05）。
表4
正常對照組、AAV2-shHspB8組a波振幅、潛伏期比較（±s）
圖5
正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠全視野閃光ERG a波、b波振幅、潛伏期比較。5A、5B分別示a波、b波振幅；5C、5D分別示a波、b波潛伏期。a波振幅n=12，其余n=10。ERG：視網膜電圖；AAV2-shHspB8：重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8
圖6
正常對照組、AAV2-shHspB8組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。6A示正常對照組；6B示AAV2-shHspB8組。2個組小鼠視網膜神經節細胞結構與數量無明顯差異 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。AAV2-shHspB8：重組腺相關病毒2-小發夾熱休克蛋白B8
表5
正常對照組、AAV2-shHspB8組b波振幅、潛伏期比較（±s）
暗適應OMR檢測結果顯示，ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠視敏度分別為（0.09±0.04）、（0.18±0.05）、（0.11±0.04）cyc/deg；ONC5+AAV2-shHspB8組視敏度較ONC5組、ONC5+AAV2組升高，但差異無統計學意義（H=0.367，P＞0.05）。ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠RGC存活率分別為（41.44± 1.22）%、（52.98±2.00）%、（42.67±1.80）%；3個組RGC存活率比較，差異有統計學意義（F=10.62，P＜0.01）。組間兩兩比較，ONC5+AAV2-shHspB8組較ONC5組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；ONC5+AAV2組與ONC5組差異無統計學意義（P＞0.05）。熒光顯微鏡像觀察結果顯示，ONC5+AAV2-shHspB8組小鼠RGC細胞結構較ONC5組清晰，數目更多（圖7）。
圖7
ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。7A～7C分別示ONC5組、ONC5+AAV2-shHspB8組、ONC5+AAV2組。ONC5組、ONC5+AAV2組視網膜神經節細胞（RGC）染色稍淡，結構較為模糊；ONC5+AAV2-shHspB8組RGC形態規整，數量較前2個組更多 Brn3a免疫熒光染色 標尺：50 μm n=6。 ONC：視神經鉗夾；AAV2：重組腺相關病毒2；shHspB8：小發夾熱休克蛋白B8
3 討論
本研究結果顯示，小鼠視網膜中有HspB8表達且ONC誘導其增加，提示HspB8可能參與了ONC后RGC死亡的調節。為探究HspB8這種變化對RGC的確切作用，我們構建了敲低其表達的AAV2-shHspB8-GFP，病毒成功轉染視網膜各層，并在ONC后保護RGC，使其免于死亡。因此，我們認為，HspB8對ONC模型中的RGC具有損害作用。
ONC以RGC損傷為主要病理特征，但若ONC過程中操作不當則會造成視網膜血供受損，影響外層視網膜發生相應的功能學改變。注意保護睫狀后動脈和視網膜中央動脈，并避免長時間牽引眼球，能夠避免視網膜血供受阻[12, 16]。排除意外造成的缺血性損傷之后，方能將ff-ERG變化歸因于視神經損傷本身。研究顯示，視神經損傷后視網膜中膽堿能無長突細胞免疫染色與正常小鼠比較無明顯變化[17]，而膽堿能視網膜神經元對缺血性損傷非常敏感[18]，說明視神經損傷對視網膜血供無顯著影響。
視覺行為學檢測能準確反映小鼠視覺功能，將其應用于視網膜疾病治療策略有效性評估具有非常重要的意義[19]。RGC缺陷能夠明顯影響小鼠OMR[20]。本研究結果顯示，ONC5組暗適應視敏度明顯低于正常對照組，結果準確反映了ONC造成的功能性變化。雖然本研究中ONC5+AAV2-shHspB8組暗適應視敏度較ONC5組有升高趨勢，但差異并無統計學意義，后續研究可以通過增加病毒液注射量，改變鉗夾時間點等策略進一步探究敲低HspB8對小鼠OMR的積極作用。
暗適應ff-ERG中a波來源于光感受器的光傳導，b波來源于雙極細胞和Müller細胞去極化，OPs由無長突細胞和反饋電路產生[21]。目前，視神經損傷對ff-ERG影響的相關研究結果并不統一。部分研究顯示TON對大鼠ff-ERG沒有影響[22]；但有研究認為，暗適應ff-ERG的a波、b波振幅在視神經損傷后下降，OPs振幅也較正常組降低[23-25]，此與本研究結果一致，ONC后a波、b波、OPs振幅降低，b波潛伏期延長。有學者在ONC后對視網膜進行原位末端標記法（TUNEL）染色發現，GCL、INL均存在TUNEL陽性細胞，說明ONC不僅損害了RGC，也導致了雙極細胞的死亡，這可能是導致b波、OPs振幅下降的原因[25]。另有研究認為，TON后a波、b波的改變可能是由Müller細胞激活所介導，其原因是膠質纖維酸性蛋白mRNA水平在TON后升高了[16]，或是將這種變化歸因于TON后成纖維細胞生長因子2表達顯著上調誘導的視網膜功能抑制[26]。另外，RGC死亡導致視網膜電阻的改變或TON后光感受器細胞相關基因的瞬時下調[23,27]，都可能促成視神經損傷后的a波、b波、OPs受損的這種電生理改變。暗適應ff-ERG中PhNR振幅下降與RGC丟失呈正相關，其被認為能監測RGC的電生理功能[15]。本研究結果顯示，ONC后PhNR振幅較正常對照組下降，此為RGC功能損害，細胞死亡的電生理反映。
研究顯示，全視網膜鋪片RGC計數、TUNEL染色陽性RGC計數、視神經髓磷脂染色以及視神經神經絲染色均可以作為RGC數目、結構變化的指標[28]；此外，PhNR振幅、閃光視覺誘發電位等視覺電生理的檢測則能反映RGC的功能變化。本研究結果顯示，ONC組小鼠RGC存活率約為41%，而視敏度卻下降了78%。有學者認為，視神經損傷后功能損害大于RGC數目、軸突丟失現象，說明殘存的受損軸突通常不能繼續傳遞視覺信號[28]。因此，可以通過以上檢測方法判斷下調HspB8除延長部分RGC的存活，是否還存在減少軸突損失、保護殘余細胞功能的神經保護作用。
HspB8主要在心臟疾病中進行研究，其在心肌缺血再灌注損傷中同時具有保護性和損害性作用，而這種雙重作用是由其表達量決定的[29]。亦有研究認為HspB8功能的毒性增加促進了神經退行性疾病的發展[9]。HspB8被眾多應激因子顯著誘導，而促進受損/錯誤折疊蛋白質的選擇性自噬是HspB8的重要作用[6]。近年眾多研究從mRNA、蛋白水平和超微結構特征等方面證實了視神經損傷后RGC中自噬的激活[30]。部分研究認為ONC后RGC的凋亡可能部分與自噬激活有關[31]。本研究結果發現，視網膜中的HspB8在ONC后增加，而抑制這種增加對RGC存活是有益的。因此，我們推測HspB8對鉗夾后RGC的損害作用可能是通過增加下游自噬流來實現的。與我們的觀點類似，研究發現在平滑肌細胞中，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶干擾了HspB8與BAG3的結合從而抑制了BAG3介導的自噬，最終維持了蛋白質穩態[32]。
本研究證實了HspB8在小鼠視網膜上的表達，并發現下調HspB8對ONC后的RGC死亡具有保護作用，為外傷性視神經病變的神經保護治療提供了思路，但仍欠缺HspB8損害作用的電生理表現及具體下游機制等相關內容，應做進一步探索以完善研究。
