引用本文： 楊宋陽, 張明亮, 胡嵐嵐, 王禮明, 張曉敏, 李筱榮. 單分子成像顯示視網膜血管內皮細胞膜上血管內皮生長因子受體2聚集狀態. 中華眼底病雜志, 2021, 37(2): 138-144. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200608-00265 復制
新生血管（NV）在新生血管性老年性黃斑變性（AMD）、增生型糖尿病視網膜病變（PDR）等多種不可逆視力損害性眼病中扮演重要角色[1]。NV是一個復雜而協調的過程，需要大量受體的有序激活，其中血管內皮生長因子（VEGF）及其受體發揮關鍵作用。VEGF受體2（VEGFR2）磷酸化激活后主要誘導血管內皮細胞的增生、遷移和存活等，是血管生成主要的關鍵限速步驟[2]。其細胞外結構域（ECD）與VEGF結合后由單體轉變為二聚體，形成的二聚體復合物介導細胞內酪氨酸激酶結構域活化，該結構變化對于受體磷酸化至關重要[3-5]。深入了解細胞膜表面VEGFR2的聚集狀態可以加深人們對VEGF信號通路的理解。然而，有關無配體狀態下VEGFR2是否存在一定比例的二聚體形式尚存爭議。既往研究多基于體外生物化學方法的測定，無法展示單個細胞上受體分子的聚集狀態。為探討單個細胞膜上VEGFR2的聚集狀態，本研究使用單分子成像技術對猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A）轉染標記有綠色熒光蛋白（GFP）的VEGFR2重組質粒，采用全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）觀察單個VEGFR2分子在細胞膜上的聚集狀態。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
RF/6A由天津醫科大學眼科醫院自行保存[6]。胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、最低基礎培養基（MEM）、非必需氨基酸、谷氨酰胺（GlutaMAX）（美國Gibco公司）；6孔板及T75細胞培養瓶（美國Corning公司）；共聚焦培養皿（美國Cellvis公司）；抗VEGFR2抗體（編號2479）、抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（編號4970）（美國CST公司）；化學發光液、脂質體3000（Lipofectamine3000）（美國Thermo Fisher公司）；細胞總蛋白提取試劑盒（Minute，美國Invent公司）；細胞RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR熒光染料（美國EZBioscience公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料（DAPI，美國Thermo Fisher公司）；共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）；TIRFM（日本奧林巴斯公司，中國科學院化學研究所方曉紅研究員課題組搭建）。
1.2 細胞培養、脂質體轉染及實驗分組
使用含10%胎牛血清、1%雙抗、1%非必需氨基酸和1% GlutaMAX的MEM完全培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，取第3代細胞用于實驗。由生工生物工程股份有限公司構建帶有GFP標記的VEGFR2質粒，將合成的質粒轉入大腸桿菌感受態細胞，倒置培養后從固體培養皿上挑取單個菌落接種于含有卡那霉素的液體培養基中，搖床中37 ℃、220 r/min震蕩14 h。使用質粒小提試劑盒提取VEGFR2質粒測定濃度；酶切后進行電泳實驗以檢測目的條帶并測序，經測序驗證正確的陽性克隆，進行質粒大提。
將RF/6A分為空白對照組、質粒轉染組（VEGFR2-GFP重組質粒轉染）。質粒轉染組將細胞接種于6孔板中，當細胞匯合度達到70%～80%時更換無血清培養基饑餓過夜，次日使用125 μl無血清培養液稀釋3 μl Lipofectamine3000轉染試劑，與質粒DNA混合后室溫孵育10 min再加入細胞中，6 h后更換為完全培養基繼續培養6 h，即細胞總培養12 h后進行后續實驗。空白對照組正常培養，接種12 h后進行后續試驗。
1.3 共聚焦顯微鏡觀察
將細胞接種至共聚焦培養皿中，轉染12 h后使用甲醇固定，PBS洗去殘余甲醇后加入DAPI染色10 min，最后加入PBS保持細胞濕潤。將培養皿放入共聚焦顯微鏡進行成像，觀察質粒轉染組GFP的表達情況。
1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）及蛋白免疫印跡（Western blot）檢測
采用qPCR檢測VEGFR2、GFP和β-actin的mRNA表達。使用細胞RNA提取試劑盒提取總RNA，經分光光度計檢測濃度，以吸光度［A，舊稱光密度（OD）］A260/A280比值介于1.8～2.0之間認為RNA提取質量良好，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄后得到的cDNA產物用于PCR反應。根據美國國家生物技術信息中心數據庫中的VEGFR2、GFP、β-actin設計引物序列（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。擴增反應中將4 μl模板cDNA、正向反向引物各0.4 μl、5.2 μl ddH2O和10 μl SYBR熒光染料依次加入96孔板。每組3個復孔，實驗重復3次。放入qPCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct），依照公式2-ΔΔCt法進行數據分析。
表1
基因擴增測序引物
采用Western blot檢測VEGFR2、β-actin蛋白表達。質粒轉染細胞后12 h收集細胞進行總蛋白提取，調整蛋白濃度等量等體積上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；4 ℃一抗孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后加入化學發光液曝光并拍照。實驗共重復3次。
1.5 單分子成像及數據分析
細胞經甲醇固定后釆用TIRFM進行單分子成像。研究中所涉及到的圖像分析處理均采用美國國立衛生研究院（NIH）Image J軟件完成（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。參照文獻[7-8]的方法分析細胞膜上單個VEGFR2-GFP分子的熒光強度分布和光漂白步數。
釆集圖像時，電子倍增電荷耦合器件照相機增益設為300。激發波長為488 nm，采集速度為10 Hz，每個影像持續采集400幀。數據分析，使用NIH Image J軟件中的滾雪球法（rolling ball method）從固定細胞中獲取的影片中減去背景熒光，然后將前五幀圖片疊加后進行平均，使用Matlab程序（由中國科學院化學研究所袁景和博士編寫）采用高斯擬合的方法尋找所有高于閾值的點。經過算法篩選后，保留符合要求的點，并在圖像中用綠色圓圈圈定。參照文獻[8]的方法，通過統計融合到蛋白質上GFP的漂白步驟確定膜結合蛋白的亞基數和化學計量學狀態。漂白曲線記錄篩選出單分子點每一幀的熒光強度值，用作漂白步數統計分析，激光照射后單個GFP熒光分子的熒光強度隨時間的變化存在臺階狀突然下降現象，是典型的一步光漂白特征，表明目的受體為單體；若復合物具有兩個熒光分子，可以觀測到它們在不同時間相繼淬滅，熒光強度出現兩個臺階狀下降，提示復合物為二聚體，部分漂白臺階無法判斷或者漂白行為異常的點給予舍棄；一段時間后，全部熒光分子都被漂白，使用算法可以自動確定VEGFR2-GFP分子的光漂白步驟并進行統計分析，即可推斷出漂白熒光分子的數目，得到細胞膜目標蛋白的亞基構成比例。熒光強度分析使用多個細胞中找到的單分子熒光點的第一幀熒光強度匯總為熒光強度分布曲線，通過統計細胞膜上熒光分子的熒光強度分布，進行多峰高斯函數擬合判斷不同組分的比例[9]。上述分析方法同時應用，相互驗證。
1.6 統計學分析
采用GraphPad Prism8軟件進行統計分析。數據結果均符合正態分布，以均數±標準差（
）表示。兩組數據比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
共聚焦顯微鏡觀察發現，RF/6A細胞在VEGFR2-GFP重組質粒轉染12 h后可以檢測到GFP綠色熒光表達，細胞核呈藍色熒光表達（圖1）。
圖1
血管內皮生長因子受體2-綠色熒光蛋白（GFP）重組質粒轉染猴視網膜血管內皮細胞12 h后共聚焦顯微鏡像。1A示GFP綠色熒光 GFP 標尺：10 μm；1B示細胞核呈藍色熒光 苯基吲哚 標尺：10 μm；1C示1A和1B合成像 GFP+苯基吲哚 標尺：10 μm
qPCR檢測結果顯示，空白對照組、質粒轉染組細胞中VEGFR2、GFP mRNA相對表達量分別為1.000±0.975、11 532.854±1 777.394和1.000±0.067、5 988.186±840.707。兩組細胞中VEGFR2、GFP mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（t=11.240、12.330，P＜0.001、＜0.001）（圖2）。
圖2
質粒轉染組和空白對照組猴視網膜血管內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、綠色熒光蛋白（GFP）mRNA相對表達量比較。***P＜0.001
Western blot檢測結果顯示，質粒轉染組VEGFR2蛋白表達較空白對照組明顯升高, 差異有統計學意義（t=8.346，P＜0.01）（圖3）。
圖3
質粒轉染組和空白對照組猴視網膜血管內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、綠色熒光蛋白（GFP）蛋白表達比較。3A示蛋白免疫印跡電泳像；3B示VEGFR2、GFP蛋白表達比較統計圖。**P＜0.01
單分子成像結果顯示，無配體刺激時RF/6A細胞膜表面上VEGFR2-GFP的熒光強度分布為雙峰，其中第二個峰的強度（62.98）大約是第一個峰（33.15）的2倍，即它們分別是二聚體和單體，其比例分別為86.0%、14.0%。通過計數GFP熒光漂白步數，靜息狀態下受體單體、二聚體、三聚體和四聚體比例分別為81.4%、12.9%、5.5%、0.3%（圖4）。
圖4
單分子成像及數據分析圖。4A、4B示全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）像（標尺：10 μm）。4A展示了TIRFM觀察到的細胞膜，4B中白箭指示的綠色圓圈（5像素×5像素）為標注的衍射受限點，表示程序實際檢測到的單個血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）-綠色熒光蛋白（GFP）分子，用以進行光漂白步數和熒光強度分析。4C、4D示光漂白步數分析。4C為一步漂白，黑箭提示一個臺階狀下降，表示受體為單體；4D為兩步漂白，黑箭提示兩個臺階狀下降，表示受體為二聚體。4E示熒光強度分析。統計衍射極限熒光強度的分布，曲線顯示了高斯函數的擬合，兩個峰值分別代表了VEGFR2-GFP單體和二聚體的強度，高斯擬合的相關系數為0.97，箭頭指示擬合曲線的峰值位置，括號中的數字分別是單體和二聚體所占比例。4F示光漂白步數統計。顯示VEGFR2-GFP單體、二聚體、三聚體、四聚體所占比例
3 討論
NV是多種致盲性眼病的共同特征。根據NV發生的部位不同，分為視網膜NV和視網膜下NV，前者主要包含PDR、早產兒視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞[10-12]；后者可見于AMD[13]。NV病理過程通常包含兩個階段，首先是各種因素導致的現有視網膜血管閉塞，出現組織相對缺氧，繼而大量產生和釋放缺氧誘導因子，如VEGF、血管生成素2以及促紅細胞生成素等，最終誘導NV生成。其中，VEGF信號通路是一個關鍵限速步驟[14]。VEGFR2屬于受體酪氨酸激酶（RTK），是內皮細胞中傳遞VEGF信號的主要受體，也是促有絲分裂、血管生成和增強通透性的主要介質[15-16]。同多數RTK一樣，VEGFR2由ECD、跨膜結構域和細胞內結構域組成。
對于VEGFR2跨膜信號轉導的結構模型，廣泛接受的是“經典模型”。采用負染色單粒子電子顯微鏡和溶液中小角度X射線散射技術可以發現，未與配體結合狀態下，VEGFR2的ECD呈單體狀態[5, 17]。全長VEGFR2的免疫共沉淀實驗發現，除非以極高的水平表達受體，受體在無配體狀態下不會產生二聚行為，配體同受體結合后，二者的催化結構域緊密靠近形成二聚體從而誘導產生交叉磷酸化[4, 18]。第二種理論則認為受體可以在無配體的情況下預先形成二聚體，受體本身序列具有一定的編碼傾向性，可以通過側面相互作用形成二聚體。因此，受體持續處于單體-二聚體動態平衡狀態。既往研究使用福斯特能量共振轉移（FRET）技術觀察發現，在無配體狀態下，30%～60%的VEGFR2受體呈二聚體狀態[19]。VEGFR2和成纖維細胞生長因子（FGF）同屬于RTK，有學者在觀察FGF時提出RTK激活的“經典模型”與“預先形成的二聚體模型”之間的不同可能并非根本差異，更為關鍵的特點在于非配體結合狀態下二聚體比例的大小，并由此提出一種通用的RTK激活模型，這一模型包括單體、結合配體的二聚體和作為中間體的非配體二聚體[20]。
單分子成像技術由TIRFM成像，通過減少激發和檢測體積，照明區域被限定在細胞表面百納米級厚度的薄層范圍內，有效控制了激發體積，具有其他光學成像技術無法比擬的高信噪比和對比度，而且能夠發現傳統手段難以檢測到的分子在空間和時間上的變化[7]。近年來該技術已廣泛用于膜蛋白復合物亞基組成的相關研究[21]。本研究使用單分子成像技術探索單個細胞上的單個VEGFR2受體的聚集狀態[22]，結果顯示內皮細胞膜表面的VEGFR2在無配體情況下存在14.0%的二聚體以及86.0%的單體。這和Sarabipour等[19]使用FRET技術的研究結論是一致的，同時也驗證了最近提出的通用模型同樣適用于VEGFR2。需要注意的是，FRET基于細胞膜表面受體的平均測量通常需要有高水平受體表達，這可能是與本研究的觀測結果在數值上存在一定差異的原因。
預先形成的無配體二聚體與VEGF的親和力相較于單體強約100倍，可在配體出現時快速激活[23]。VEGF與無配體二聚體結合后可以穩定復合物結構，減少受體的移動性[24]。抗VEGF藥物目前成為治療新生血管性AMD等疾病的一線方案，但是不同的患者卻對其表現出不同的反應性。有些患者的脈絡膜新生血管在初始治療后即穩定，而有些患者的脈絡膜新生血管卻在持續性的每月注藥達12次后仍有活動[25]。有研究發現，雷珠單抗和阿柏西普還展現出上限效應，即不能單純通過增大藥物劑量獲得更好的視力收益[26]。目前應用的單克隆抗體和融合蛋白類藥物均通過結合游離的VEGF阻斷下游信號通路的激活，抗VEGF藥物注射后眼內仍存在較低濃度的VEGF[27]。本研究結果顯示，生理狀態下內皮細胞表面存在約14.0%的無配體二聚體，配體可以和親和力更高的二聚體結合而激活增生遷移信號，從而促進新生血管的生成。這一發現提示在臨床治療中需要轉換思路，使用VEGFR2的抑制劑或可為目前的臨床治療提供補充。雷莫蘆單抗（IMC-1211B，ramucirumab）是人源性IgG抗體，臨床前模型顯示這種單克隆抗體與VEGFR2-ECD的親和力更高，通過阻斷受體避免多種VEGF亞型發揮激活作用[28]。目前該藥物已經獲批用于轉移性非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的治療，已有應用于眼科治療的早期安全性評估報道[29]。
抗VEGF藥物在眼部的應用為眾多眼底新生血管性疾病的患者保留了有用視力，但是這類藥物仍有需要改善的地方。完善VEGF與VEGFR2結合激活的生物學結構模型，有助于人們深入了解VEGF信號通路，為進一步探索阻斷VEGFR2發生二聚體化提供新的理論依據，為最終抑制NV的形成提供新的思路。
新生血管（NV）在新生血管性老年性黃斑變性（AMD）、增生型糖尿病視網膜病變（PDR）等多種不可逆視力損害性眼病中扮演重要角色[1]。NV是一個復雜而協調的過程，需要大量受體的有序激活，其中血管內皮生長因子（VEGF）及其受體發揮關鍵作用。VEGF受體2（VEGFR2）磷酸化激活后主要誘導血管內皮細胞的增生、遷移和存活等，是血管生成主要的關鍵限速步驟[2]。其細胞外結構域（ECD）與VEGF結合后由單體轉變為二聚體，形成的二聚體復合物介導細胞內酪氨酸激酶結構域活化，該結構變化對于受體磷酸化至關重要[3-5]。深入了解細胞膜表面VEGFR2的聚集狀態可以加深人們對VEGF信號通路的理解。然而，有關無配體狀態下VEGFR2是否存在一定比例的二聚體形式尚存爭議。既往研究多基于體外生物化學方法的測定，無法展示單個細胞上受體分子的聚集狀態。為探討單個細胞膜上VEGFR2的聚集狀態，本研究使用單分子成像技術對猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A）轉染標記有綠色熒光蛋白（GFP）的VEGFR2重組質粒，采用全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）觀察單個VEGFR2分子在細胞膜上的聚集狀態。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
RF/6A由天津醫科大學眼科醫院自行保存[6]。胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、最低基礎培養基（MEM）、非必需氨基酸、谷氨酰胺（GlutaMAX）（美國Gibco公司）；6孔板及T75細胞培養瓶（美國Corning公司）；共聚焦培養皿（美國Cellvis公司）；抗VEGFR2抗體（編號2479）、抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（編號4970）（美國CST公司）；化學發光液、脂質體3000（Lipofectamine3000）（美國Thermo Fisher公司）；細胞總蛋白提取試劑盒（Minute，美國Invent公司）；細胞RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR熒光染料（美國EZBioscience公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚染料（DAPI，美國Thermo Fisher公司）；共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）；TIRFM（日本奧林巴斯公司，中國科學院化學研究所方曉紅研究員課題組搭建）。
1.2 細胞培養、脂質體轉染及實驗分組
使用含10%胎牛血清、1%雙抗、1%非必需氨基酸和1% GlutaMAX的MEM完全培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，取第3代細胞用于實驗。由生工生物工程股份有限公司構建帶有GFP標記的VEGFR2質粒，將合成的質粒轉入大腸桿菌感受態細胞，倒置培養后從固體培養皿上挑取單個菌落接種于含有卡那霉素的液體培養基中，搖床中37 ℃、220 r/min震蕩14 h。使用質粒小提試劑盒提取VEGFR2質粒測定濃度；酶切后進行電泳實驗以檢測目的條帶并測序，經測序驗證正確的陽性克隆，進行質粒大提。
將RF/6A分為空白對照組、質粒轉染組（VEGFR2-GFP重組質粒轉染）。質粒轉染組將細胞接種于6孔板中，當細胞匯合度達到70%～80%時更換無血清培養基饑餓過夜，次日使用125 μl無血清培養液稀釋3 μl Lipofectamine3000轉染試劑，與質粒DNA混合后室溫孵育10 min再加入細胞中，6 h后更換為完全培養基繼續培養6 h，即細胞總培養12 h后進行后續實驗。空白對照組正常培養，接種12 h后進行后續試驗。
1.3 共聚焦顯微鏡觀察
將細胞接種至共聚焦培養皿中，轉染12 h后使用甲醇固定，PBS洗去殘余甲醇后加入DAPI染色10 min，最后加入PBS保持細胞濕潤。將培養皿放入共聚焦顯微鏡進行成像，觀察質粒轉染組GFP的表達情況。
1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）及蛋白免疫印跡（Western blot）檢測
采用qPCR檢測VEGFR2、GFP和β-actin的mRNA表達。使用細胞RNA提取試劑盒提取總RNA，經分光光度計檢測濃度，以吸光度［A，舊稱光密度（OD）］A260/A280比值介于1.8～2.0之間認為RNA提取質量良好，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄后得到的cDNA產物用于PCR反應。根據美國國家生物技術信息中心數據庫中的VEGFR2、GFP、β-actin設計引物序列（表1），由生工生物工程股份有限公司合成。擴增反應中將4 μl模板cDNA、正向反向引物各0.4 μl、5.2 μl ddH2O和10 μl SYBR熒光染料依次加入96孔板。每組3個復孔，實驗重復3次。放入qPCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct），依照公式2-ΔΔCt法進行數據分析。
表1
基因擴增測序引物
采用Western blot檢測VEGFR2、β-actin蛋白表達。質粒轉染細胞后12 h收集細胞進行總蛋白提取，調整蛋白濃度等量等體積上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。濕轉后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；4 ℃一抗孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；最后加入化學發光液曝光并拍照。實驗共重復3次。
1.5 單分子成像及數據分析
細胞經甲醇固定后釆用TIRFM進行單分子成像。研究中所涉及到的圖像分析處理均采用美國國立衛生研究院（NIH）Image J軟件完成（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。參照文獻[7-8]的方法分析細胞膜上單個VEGFR2-GFP分子的熒光強度分布和光漂白步數。
釆集圖像時，電子倍增電荷耦合器件照相機增益設為300。激發波長為488 nm，采集速度為10 Hz，每個影像持續采集400幀。數據分析，使用NIH Image J軟件中的滾雪球法（rolling ball method）從固定細胞中獲取的影片中減去背景熒光，然后將前五幀圖片疊加后進行平均，使用Matlab程序（由中國科學院化學研究所袁景和博士編寫）采用高斯擬合的方法尋找所有高于閾值的點。經過算法篩選后，保留符合要求的點，并在圖像中用綠色圓圈圈定。參照文獻[8]的方法，通過統計融合到蛋白質上GFP的漂白步驟確定膜結合蛋白的亞基數和化學計量學狀態。漂白曲線記錄篩選出單分子點每一幀的熒光強度值，用作漂白步數統計分析，激光照射后單個GFP熒光分子的熒光強度隨時間的變化存在臺階狀突然下降現象，是典型的一步光漂白特征，表明目的受體為單體；若復合物具有兩個熒光分子，可以觀測到它們在不同時間相繼淬滅，熒光強度出現兩個臺階狀下降，提示復合物為二聚體，部分漂白臺階無法判斷或者漂白行為異常的點給予舍棄；一段時間后，全部熒光分子都被漂白，使用算法可以自動確定VEGFR2-GFP分子的光漂白步驟并進行統計分析，即可推斷出漂白熒光分子的數目，得到細胞膜目標蛋白的亞基構成比例。熒光強度分析使用多個細胞中找到的單分子熒光點的第一幀熒光強度匯總為熒光強度分布曲線，通過統計細胞膜上熒光分子的熒光強度分布，進行多峰高斯函數擬合判斷不同組分的比例[9]。上述分析方法同時應用，相互驗證。
1.6 統計學分析
采用GraphPad Prism8軟件進行統計分析。數據結果均符合正態分布，以均數±標準差（）表示。兩組數據比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
共聚焦顯微鏡觀察發現，RF/6A細胞在VEGFR2-GFP重組質粒轉染12 h后可以檢測到GFP綠色熒光表達，細胞核呈藍色熒光表達（圖1）。
圖1
血管內皮生長因子受體2-綠色熒光蛋白（GFP）重組質粒轉染猴視網膜血管內皮細胞12 h后共聚焦顯微鏡像。1A示GFP綠色熒光 GFP 標尺：10 μm；1B示細胞核呈藍色熒光 苯基吲哚 標尺：10 μm；1C示1A和1B合成像 GFP+苯基吲哚 標尺：10 μm
qPCR檢測結果顯示，空白對照組、質粒轉染組細胞中VEGFR2、GFP mRNA相對表達量分別為1.000±0.975、11 532.854±1 777.394和1.000±0.067、5 988.186±840.707。兩組細胞中VEGFR2、GFP mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（t=11.240、12.330，P＜0.001、＜0.001）（圖2）。
圖2
質粒轉染組和空白對照組猴視網膜血管內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、綠色熒光蛋白（GFP）mRNA相對表達量比較。***P＜0.001
Western blot檢測結果顯示，質粒轉染組VEGFR2蛋白表達較空白對照組明顯升高, 差異有統計學意義（t=8.346，P＜0.01）（圖3）。
圖3
質粒轉染組和空白對照組猴視網膜血管內皮細胞中血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）、綠色熒光蛋白（GFP）蛋白表達比較。3A示蛋白免疫印跡電泳像；3B示VEGFR2、GFP蛋白表達比較統計圖。**P＜0.01
單分子成像結果顯示，無配體刺激時RF/6A細胞膜表面上VEGFR2-GFP的熒光強度分布為雙峰，其中第二個峰的強度（62.98）大約是第一個峰（33.15）的2倍，即它們分別是二聚體和單體，其比例分別為86.0%、14.0%。通過計數GFP熒光漂白步數，靜息狀態下受體單體、二聚體、三聚體和四聚體比例分別為81.4%、12.9%、5.5%、0.3%（圖4）。
圖4
單分子成像及數據分析圖。4A、4B示全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）像（標尺：10 μm）。4A展示了TIRFM觀察到的細胞膜，4B中白箭指示的綠色圓圈（5像素×5像素）為標注的衍射受限點，表示程序實際檢測到的單個血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）-綠色熒光蛋白（GFP）分子，用以進行光漂白步數和熒光強度分析。4C、4D示光漂白步數分析。4C為一步漂白，黑箭提示一個臺階狀下降，表示受體為單體；4D為兩步漂白，黑箭提示兩個臺階狀下降，表示受體為二聚體。4E示熒光強度分析。統計衍射極限熒光強度的分布，曲線顯示了高斯函數的擬合，兩個峰值分別代表了VEGFR2-GFP單體和二聚體的強度，高斯擬合的相關系數為0.97，箭頭指示擬合曲線的峰值位置，括號中的數字分別是單體和二聚體所占比例。4F示光漂白步數統計。顯示VEGFR2-GFP單體、二聚體、三聚體、四聚體所占比例
3 討論
NV是多種致盲性眼病的共同特征。根據NV發生的部位不同，分為視網膜NV和視網膜下NV，前者主要包含PDR、早產兒視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞[10-12]；后者可見于AMD[13]。NV病理過程通常包含兩個階段，首先是各種因素導致的現有視網膜血管閉塞，出現組織相對缺氧，繼而大量產生和釋放缺氧誘導因子，如VEGF、血管生成素2以及促紅細胞生成素等，最終誘導NV生成。其中，VEGF信號通路是一個關鍵限速步驟[14]。VEGFR2屬于受體酪氨酸激酶（RTK），是內皮細胞中傳遞VEGF信號的主要受體，也是促有絲分裂、血管生成和增強通透性的主要介質[15-16]。同多數RTK一樣，VEGFR2由ECD、跨膜結構域和細胞內結構域組成。
對于VEGFR2跨膜信號轉導的結構模型，廣泛接受的是“經典模型”。采用負染色單粒子電子顯微鏡和溶液中小角度X射線散射技術可以發現，未與配體結合狀態下，VEGFR2的ECD呈單體狀態[5, 17]。全長VEGFR2的免疫共沉淀實驗發現，除非以極高的水平表達受體，受體在無配體狀態下不會產生二聚行為，配體同受體結合后，二者的催化結構域緊密靠近形成二聚體從而誘導產生交叉磷酸化[4, 18]。第二種理論則認為受體可以在無配體的情況下預先形成二聚體，受體本身序列具有一定的編碼傾向性，可以通過側面相互作用形成二聚體。因此，受體持續處于單體-二聚體動態平衡狀態。既往研究使用福斯特能量共振轉移（FRET）技術觀察發現，在無配體狀態下，30%～60%的VEGFR2受體呈二聚體狀態[19]。VEGFR2和成纖維細胞生長因子（FGF）同屬于RTK，有學者在觀察FGF時提出RTK激活的“經典模型”與“預先形成的二聚體模型”之間的不同可能并非根本差異，更為關鍵的特點在于非配體結合狀態下二聚體比例的大小，并由此提出一種通用的RTK激活模型，這一模型包括單體、結合配體的二聚體和作為中間體的非配體二聚體[20]。
單分子成像技術由TIRFM成像，通過減少激發和檢測體積，照明區域被限定在細胞表面百納米級厚度的薄層范圍內，有效控制了激發體積，具有其他光學成像技術無法比擬的高信噪比和對比度，而且能夠發現傳統手段難以檢測到的分子在空間和時間上的變化[7]。近年來該技術已廣泛用于膜蛋白復合物亞基組成的相關研究[21]。本研究使用單分子成像技術探索單個細胞上的單個VEGFR2受體的聚集狀態[22]，結果顯示內皮細胞膜表面的VEGFR2在無配體情況下存在14.0%的二聚體以及86.0%的單體。這和Sarabipour等[19]使用FRET技術的研究結論是一致的，同時也驗證了最近提出的通用模型同樣適用于VEGFR2。需要注意的是，FRET基于細胞膜表面受體的平均測量通常需要有高水平受體表達，這可能是與本研究的觀測結果在數值上存在一定差異的原因。
預先形成的無配體二聚體與VEGF的親和力相較于單體強約100倍，可在配體出現時快速激活[23]。VEGF與無配體二聚體結合后可以穩定復合物結構，減少受體的移動性[24]。抗VEGF藥物目前成為治療新生血管性AMD等疾病的一線方案，但是不同的患者卻對其表現出不同的反應性。有些患者的脈絡膜新生血管在初始治療后即穩定，而有些患者的脈絡膜新生血管卻在持續性的每月注藥達12次后仍有活動[25]。有研究發現，雷珠單抗和阿柏西普還展現出上限效應，即不能單純通過增大藥物劑量獲得更好的視力收益[26]。目前應用的單克隆抗體和融合蛋白類藥物均通過結合游離的VEGF阻斷下游信號通路的激活，抗VEGF藥物注射后眼內仍存在較低濃度的VEGF[27]。本研究結果顯示，生理狀態下內皮細胞表面存在約14.0%的無配體二聚體，配體可以和親和力更高的二聚體結合而激活增生遷移信號，從而促進新生血管的生成。這一發現提示在臨床治療中需要轉換思路，使用VEGFR2的抑制劑或可為目前的臨床治療提供補充。雷莫蘆單抗（IMC-1211B，ramucirumab）是人源性IgG抗體，臨床前模型顯示這種單克隆抗體與VEGFR2-ECD的親和力更高，通過阻斷受體避免多種VEGF亞型發揮激活作用[28]。目前該藥物已經獲批用于轉移性非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的治療，已有應用于眼科治療的早期安全性評估報道[29]。
抗VEGF藥物在眼部的應用為眾多眼底新生血管性疾病的患者保留了有用視力，但是這類藥物仍有需要改善的地方。完善VEGF與VEGFR2結合激活的生物學結構模型，有助于人們深入了解VEGF信號通路，為進一步探索阻斷VEGFR2發生二聚體化提供新的理論依據，為最終抑制NV的形成提供新的思路。
