引用本文： 李宗媛, 楊寧, 羅晉媛, 楊家翼, 賀濤, 邢怡橋. Krüppel樣因子7對視網膜缺血再灌注損傷小鼠視網膜神經節細胞存活及視網膜電圖的影響. 中華眼底病雜志, 2020, 36(11): 846-852. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200602-00256 復制
青光眼作為一種以RGC及其軸突變性或缺失為特征的神經退行性疾病，已成為全球第二大致盲原因[1-2]。眼壓升高是導致這一損害的主要危險因素。除了降眼壓治療，其他神經保護策略如新靶點的研究迫在眉睫。Krüppel樣因子7（KLF7）屬于鋅指轉錄因子家族，通過與特異性DNA序列結合從而發揮其生物學效應[3]。有研究發現，KLF7與神經疾病密切相關，參與并調控神經損傷后的神經元發育、分化及軸突再生[4-6]。而目前關于KLF7在眼內的研究甚少，在青光眼中的具體作用也并不明確。為此，本研究建立了小鼠視網膜缺血再灌注（RIR）損傷模型，通過重組腺相關病毒載體過表達小鼠視網膜KLF7，從形態及功能兩方面探討KLF7在RIR損傷中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗分組及建模
8周齡雄性C57BL/6J小鼠132只，體重18～22 g，由武漢大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027），飼養于標準清潔環境（明/暗循環：12 h/12 h）。本研究嚴格按照《武漢大學實驗動物護理與使用指南》的規定，并獲得武漢大學實驗動物倫理委員會許可。過表達KLF7的重組腺相關病毒載體（AAV2-KLF7-GFP）、僅帶綠色熒光蛋白（GFP）的空白腺相關病毒載體（AAV2-GFP）均由上海吉凱基因有限公司提供，病毒滴度均大于1.0×1012 vg/ml。抗GFP抗體（1∶1000，產品目錄號598，日本Medical and Biological Laboratories公司）；抗KLF7抗體[愛必信（上海）生物科技有限公司]；抗GAPDH抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）。全自動顯微注射裝置Nanoject Ⅲ（美國Drummond公司）；冰切機CM1900（德國Leica公司）；激光共聚焦顯微鏡FV1200、熒光顯微鏡BX51（日本Olympus公司）；視覺電生理儀RetiMINER（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）；虛擬光眼視動儀OptoMotry，由武漢大學人民醫院眼科中心實驗室搭建完成。
剔除晶狀體受損、手術后出血或眼部感染的小鼠6只，最終126只小鼠進行實驗。采用隨機數字表法將小鼠分為正常組（29只）、RIR組（21只）、玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP組（正常-KLF7組，29只）、玻璃體腔注射AAV2-GFP組（正常-GFP組，5只）、RIR-玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP組（RIR-KLF7組，21只）、RIR-玻璃體腔注射AAV2-GFP組（RIR-GFP組，21只）。根據前期預實驗結果，小鼠8周齡時，正常-KLF7組及RIR-KLF7組小鼠于角鞏膜緣下2.0 mm處用全自動顯微注射裝置對雙眼行玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體1 μl，病毒滴度為1.0×1012 vg/ml[7]；正常-GFP組及RIR-GFP組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量AAV2-GFP。小鼠11周齡時，采用30號胰島素注射用針針頭于RIR組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠距角膜緣約1.0 mm處刺入前房中以升高眼壓，建立RIR模型[7]。用彈力眼壓儀檢測小鼠眼壓。正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組不做RIR處理。眼部操作結束后給予氧氟沙星眼膏涂眼以防感染。
1.2 視網膜冰凍切片熒光顯微鏡觀察
玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，取正常組和正常-KLF7組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球用于視網膜冰凍切片的制備[8]。用冰切機將視杯經視神經矢狀精確切成厚度為14 μm的切片，用抗GFP抗體（1∶1000）孵育以加強其綠色熒光，用激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況。
1.3 全視網膜鋪片免疫熒光染色
RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死小鼠。參照文獻[7]的方法，取眼球去除眼前節后用4%多聚甲醛固定1 h，于含有5%牛血清白蛋白和0.5%TritonX-100的溶液中4 °C封閉過夜，用抗Brn3a抗體（1∶1000）標記RGC，將視網膜剪切成“四葉草”形狀并用抗熒光淬滅劑封片，用熒光顯微鏡觀察和拍攝。以視盤為中心，每個瓣膜為一象限，每個象限距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間及外周3個區域，每個區域隨機選取視野，于熒光顯微鏡400倍鏡下按序拍攝。最后使用ImageJ軟件統計存活的RGC以計算其存活率。
1.4 全視野ERG
RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各9只，將其提前暗適應12 h，由視覺電生理儀進行ERG記錄[9]。用鍍金鋼絲環接觸小鼠角膜表面作為記錄電極，將不銹鋼電極插入兩耳間皮下作為參考電極，另一個電極夾住尾部作為地線。依次使用光強為0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000、10.000 cd.s/m2的白光作為閃光刺激，并記錄小鼠a、b波潛伏期及振幅。振蕩電位（Ops）則在光強為3.0 cd.s/m2時記錄，Ops的大小確定為主要振幅的總和。對于光負性反應（PhNR），小鼠先于25.0 cd.s/m2的綠色背景中明適應8 min，再以光強10.0 cd.s/m2閃光刺激，記錄PhNR潛伏期及振幅，其振幅為該波谷相對于基線的距離。
1.5 視動反應（OMR）
參照文獻[10-11]的方法檢測小鼠視敏度。RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各9只，使用MATLAB軟件（美國MathWorks公司）和虛擬光眼視動儀檢測其視敏度。各組小鼠提前暗適應4 h后轉移至一組方形電腦顯示器中間的平臺中心上，此時顯示器上顯示移動光柵，小鼠通過向光柵旋轉方向移動頭部，反射性地對光柵旋轉作出反應。
1.6 Western blot
采用Western blot檢測正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7的蛋白表達。玻璃體腔注射病毒4周后，取3組小鼠各5只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球，于冰上迅速取出視網膜組織。提取蛋白后，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白質定量。經15% SDS-PAGE電泳、轉膜、孵育抗KLF7（1∶1000）、抗GAPDH（1∶2000）抗體后，用ECL試劑盒制備免疫反應條帶，并使用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值，以KLF7與GAPDH的灰度值之比反映KLF7的蛋白表達水平。
1.7 統計學分析
所有數據均采用Graph Pad Prism 7.0軟件進行分析。數據均以均數
標準差（
）表示。多組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正檢驗水準。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常組小鼠眼壓為（8.400
1.075）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；RIR組小鼠建模前、建模中、建模后眼壓分別為（6.800
1.476）、（74.300
6.273）、（7.700
1.494）mmHg。與正常組小鼠眼壓相比，RIR組小鼠建模前及建模后眼壓均無明顯變化，差異無統計學意義（t=0.467、0.801，P=0.245、0.052）；建模中即前房灌注時眼壓迅速升高，差異有統計學意義（t=43.980，P＜0.01）。
共聚焦顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜各細胞層未見綠色熒光染色（圖1A）；玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，正常-KLF7組小鼠RGC層（GCL）、內核層（INL）及內叢狀層（IPL）、外叢狀層（OPL）均可見強綠色熒光，而外核層（ONL）僅見微弱熒光（圖1B）。
圖1
小鼠視網膜共聚焦顯微鏡像。1A示正常組，視網膜各細胞層未見綠色熒光染色；1B示正常-KLF7組，玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，小鼠視網膜GCL、IPL、INL、OPL均可見綠色強熒光，ONL僅見微弱熒光 GFP+DAPI 標尺：50 μm
熒光顯微鏡觀察發現，正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠總RGC存活率分別為（100.000 ±8.789）%、（54.090
6.249）%、（98.980
6.922）%、（78.120
2.354）%、（55.080
4.613）%。與正常組比較，RIR組小鼠總RGC存活率明顯降低，差異有統計學意義（t=12.860，P＜0.01）。與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠總RGC存活率明顯增高，差異有統計學意義（t=6.350，P＜0.01）（圖2～3）。
圖2
各組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。2A～2E分別示正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組。可見RIR組紅色熒光信號較正常組明顯減少，RIR-KLF7組紅色熒光信號較RIR組明顯增多 抗Brn3a抗體 標尺：50 μm
圖3
各組小鼠視網膜總RGC存活率比較。** P＜0.01
全視野ERG檢查結果顯示，隨著刺激光強的增加，正常組小鼠暗適應ERG a、b波振幅逐漸升高，其潛伏期逐漸縮短（圖4A，4B）。與正常組比較，在10.0 cd.s/m2光強刺激下，RIR組小鼠暗適應a、b波振幅明顯降低，差異有統計學意義（t=7.157、5.735，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠暗適應ERG a、b波振幅明顯升高，差異有統計學意義（t=3.253、3.695，P=0.021、0.020）。與正常組比較，RIR組小鼠Ops、PhNR振幅明顯降低，差異均有統計學意義（t=8.953、4.744，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠Ops、PhNR振幅明顯升高，差異均有統計學意義（t=5.825、5.325，P＜0.01）（圖4C～4F）。各組小鼠暗適應a、b波及PhNR潛伏期比較，差異均無統計學意義（F=1.228、1.330、1.489，P=0.314、0.276、0.225）（圖5）。
圖4
各組小鼠ERG各波形振幅比較。4A、4B分別示正常組小鼠暗適應a、b波振幅和潛伏期。隨著刺激光強的增加，振幅逐漸升高，潛伏期逐漸縮短。4C、4D分別示在10.0 cd.s/m2光強刺激下各組小鼠a、b波振幅比較。4E示各組小鼠Ops振幅比較。4F示各組小鼠PhNR振幅比較。*P＜0.05，**P＜0.01
圖5
各組小鼠ERG各波形潛伏期比較。5A、5B分別示在10.0 cd.s/m2光強刺激下各組小鼠a、b波潛伏期比較。5C示各組小鼠PhNR潛伏期比較
OMR檢測結果顯示，正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠視敏度分別為（0.411
0.078）、（0.131
0.039）、（0.417±0.061）、（0.261
0.055）、（0.139
0.060）dB。與正常組小鼠比較，RIR組小鼠視敏度明顯下降，差異有統計學意義（t=9.887，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠視敏度明顯提高，差異有統計學意義（t=4.591，P＜0.01）（圖6）。
圖6
各組小鼠視敏度比較。 ** P＜0.01
Western blot檢測結果顯示，正常組小鼠視網膜上有KLF7蛋白表達。與正常組比較，正常-KLF7組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義（t=4.105，P＜0.01）；正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義（t=0.288，P＞0.05）（圖7）。
圖7
正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達水平比較。7A示電泳像；7B示KLF7與GAPDH灰度值之比。** P＜0.01
3 討論
轉錄因子KLF7在成體各組織中低水平廣泛表達，最早通過簡并PCR技術從人血管內皮細胞中克隆得到[12]。其作為鋅指轉錄因子家族中的一員在體內參與許多生物學過程[4-5]。既往研究表明，KLF7在神經系統發育中發揮重要作用[6, 13-14]。Tang等[15]研究發現，在培養的RGC和皮質神經元中過表達KLF7可促進神經元突起向外生長。但KLF7在RIR小鼠模型中的作用尚不明確。因此，我們通過建立RIR模型，觀察KLF7過表達在小鼠RIR損傷中對視網膜形態和功能的影響，以探討KLF7的神經保護作用。
小鼠RIR損傷是青光眼等多種缺血性視網膜疾病的重要病理生理基礎，通過增高眼壓切斷氧氣和葡萄糖的供應，使視網膜缺血缺氧，最終導致RGC死亡和視野不可逆喪失[16-19]。本研究通過眼壓測量和視網膜鋪片熒光顯微鏡觀察確定RIR模型建立成功。在前期預實驗中，我們通過視網膜切片免疫熒光染色觀察AAV2病毒載體不同轉染時間下的轉染效率，發現病毒轉染效率于3周后顯著增加，該結果與文獻報道結果一致[20]。因此，為了保持最佳病毒轉染效率，本研究于病毒轉染3周后進行RIR建模，并于建模后第7天取材。通過Western blot檢測發現，正常-KLF7組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達明顯高于正常組和正常-GFP組。這證實AAV2-KLF7-GFP病毒載體可有效轉染視網膜并過表達KLF7蛋白。但值得注意的是，雖然玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體后KLF7蛋白表達升高，但其升高的水平并不十分顯著；后續實驗可以通過加大病毒液注射量、提高病毒液滴度等策略進一步探究AAV2-KLF7-GFP病毒載體過表達KLF7的積極作用。
研究表明，抗體Brn3a可特異性標記RGC[21]。本研究進行視網膜鋪片免疫熒光染色以評估總RGC存活率。結果顯示，建模成功后第7天，RIR組小鼠總RGC存活率較正常組明顯降低，RIR-KLF7組小鼠總RGC存活率較RIR組明顯增高。這說明高代謝的視網膜耗氧量高，缺血缺氧誘導RGC死亡，而KLF7過表達可對RIR損傷后的RGC發揮神經保護作用。同時，我們利用PhNR的測量確定存活的RGC對光是否仍有反應，以評估各組小鼠RGC的生物電活動。從既往研究結果得出，PhNR的產生與視網膜RGC及其軸突的動作電位活動有關[22-23]。本研究結果顯示，PhNR振幅在小鼠RIR損傷后明顯降低，KLF7過表達后可提高至正常小鼠的75%。這表明KLF7過表達在RIR損傷后對RGC不僅在形態上有神經保護作用，還能夠保護其電生理功能。
本研究進一步觀察ERG a、b波和Ops的變化來評估KLF7過表達對小鼠視網膜功能的影響。ERG是評估視網膜完整性和生理狀態的一種有價值的方法[24-25]。視網膜病變如青光眼、視網膜微血管疾病等常導致ERG的顯著改變。在ERG的各成分中，光刺激引起的電位變化可提供視網膜內不同細胞群的活動信息。在暗適應ERG中，a波即早期的負電位，反映視網膜桿狀光感受器的活動，而b波反映視網膜INL雙極細胞和Müller細胞的電位活動[24-26]。Ops則反映內層視網膜的血液供應狀態[27]。本研究結果顯示，隨著刺激光強的增強，小鼠視網膜ERG a、b波振幅逐漸增高，其潛伏期逐漸縮短。這表明隨著光強的增強，小鼠視網膜光感受器和INL細胞的電活動逐漸增強，且敏感度也隨之增加。然而小鼠在RIR損傷后，其a、b波振幅均明顯降低，提示小鼠視網膜結構受到破壞以及視網膜功能障礙。此外，在小鼠RIR損傷后，Ops振幅明顯降低，提示小鼠內層視網膜血液循環情況不佳。我們還發現，RIR-KLF7組小鼠a、b波和Ops振幅均明顯提高，表明KLF7過表達可改善視網膜功能障礙并可改善內層視網膜血供。然而，RIR-KLF7組小鼠ERG各組成波的潛伏期無明顯變化，表明KLF7過表達不影響小鼠視網膜各層細胞群對閃光刺激的敏感性。
OMR已廣泛應用于視網膜病變如視網膜退行性疾病、青光眼等小鼠的視功能測試[28]。本研究通過OMR來確定改善的電生理反應可否導致在行為意義上的視力改善。本研究結果顯示，小鼠RIR損傷后視敏度明顯下降，RIR-KLF7組小鼠視敏度明顯增高。這說明KLF7過表達可改善小鼠的視力，進一步提示KLF7在小鼠RIR模型中的神經保護作用。
本研究證實，KLF7過表達在小鼠RIR模型中對RGC不僅在形態上有神經保護作用，還可保留其電生理功能，并可改善RIR損傷導致的視網膜功能障礙和血液循環障礙，最終能有效改善小鼠視力。然而暗適應ERG主要反映的是視桿系統的功能，尚不清楚KLF7過表達是否對視錐細胞也有保護作用，以及對雙極細胞和Müller細胞的特異性作用，還需進一步的研究來量化各層細胞的數量，以區分其對每個視網膜細胞群體的影響。此外，本研究僅以RIR建模后第7天為觀察時間點，未連續多次觀察RGC的存活情況，后續實驗將延長觀察時間并設立多個觀察時間點，進一步探究KLF7過表達對RGC存活的影響。盡管如此，本研究結果仍然提示KLF7可能成為治療青光眼的潛在新靶點，在今后的研究中，擬進一步研究KLF7對不同視網膜細胞群體的作用并將從分子生物學水平探索其中具體的分子機制與信號通路。
青光眼作為一種以RGC及其軸突變性或缺失為特征的神經退行性疾病，已成為全球第二大致盲原因[1-2]。眼壓升高是導致這一損害的主要危險因素。除了降眼壓治療，其他神經保護策略如新靶點的研究迫在眉睫。Krüppel樣因子7（KLF7）屬于鋅指轉錄因子家族，通過與特異性DNA序列結合從而發揮其生物學效應[3]。有研究發現，KLF7與神經疾病密切相關，參與并調控神經損傷后的神經元發育、分化及軸突再生[4-6]。而目前關于KLF7在眼內的研究甚少，在青光眼中的具體作用也并不明確。為此，本研究建立了小鼠視網膜缺血再灌注（RIR）損傷模型，通過重組腺相關病毒載體過表達小鼠視網膜KLF7，從形態及功能兩方面探討KLF7在RIR損傷中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗分組及建模
8周齡雄性C57BL/6J小鼠132只，體重18～22 g，由武漢大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027），飼養于標準清潔環境（明/暗循環：12 h/12 h）。本研究嚴格按照《武漢大學實驗動物護理與使用指南》的規定，并獲得武漢大學實驗動物倫理委員會許可。過表達KLF7的重組腺相關病毒載體（AAV2-KLF7-GFP）、僅帶綠色熒光蛋白（GFP）的空白腺相關病毒載體（AAV2-GFP）均由上海吉凱基因有限公司提供，病毒滴度均大于1.0×1012 vg/ml。抗GFP抗體（1∶1000，產品目錄號598，日本Medical and Biological Laboratories公司）；抗KLF7抗體[愛必信（上海）生物科技有限公司]；抗GAPDH抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）。全自動顯微注射裝置Nanoject Ⅲ（美國Drummond公司）；冰切機CM1900（德國Leica公司）；激光共聚焦顯微鏡FV1200、熒光顯微鏡BX51（日本Olympus公司）；視覺電生理儀RetiMINER（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）；虛擬光眼視動儀OptoMotry，由武漢大學人民醫院眼科中心實驗室搭建完成。
剔除晶狀體受損、手術后出血或眼部感染的小鼠6只，最終126只小鼠進行實驗。采用隨機數字表法將小鼠分為正常組（29只）、RIR組（21只）、玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP組（正常-KLF7組，29只）、玻璃體腔注射AAV2-GFP組（正常-GFP組，5只）、RIR-玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP組（RIR-KLF7組，21只）、RIR-玻璃體腔注射AAV2-GFP組（RIR-GFP組，21只）。根據前期預實驗結果，小鼠8周齡時，正常-KLF7組及RIR-KLF7組小鼠于角鞏膜緣下2.0 mm處用全自動顯微注射裝置對雙眼行玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體1 μl，病毒滴度為1.0×1012 vg/ml[7]；正常-GFP組及RIR-GFP組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量AAV2-GFP。小鼠11周齡時，采用30號胰島素注射用針針頭于RIR組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠距角膜緣約1.0 mm處刺入前房中以升高眼壓，建立RIR模型[7]。用彈力眼壓儀檢測小鼠眼壓。正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組不做RIR處理。眼部操作結束后給予氧氟沙星眼膏涂眼以防感染。
1.2 視網膜冰凍切片熒光顯微鏡觀察
玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，取正常組和正常-KLF7組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球用于視網膜冰凍切片的制備[8]。用冰切機將視杯經視神經矢狀精確切成厚度為14 μm的切片，用抗GFP抗體（1∶1000）孵育以加強其綠色熒光，用激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況。
1.3 全視網膜鋪片免疫熒光染色
RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死小鼠。參照文獻[7]的方法，取眼球去除眼前節后用4%多聚甲醛固定1 h，于含有5%牛血清白蛋白和0.5%TritonX-100的溶液中4 °C封閉過夜，用抗Brn3a抗體（1∶1000）標記RGC，將視網膜剪切成“四葉草”形狀并用抗熒光淬滅劑封片，用熒光顯微鏡觀察和拍攝。以視盤為中心，每個瓣膜為一象限，每個象限距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間及外周3個區域，每個區域隨機選取視野，于熒光顯微鏡400倍鏡下按序拍攝。最后使用ImageJ軟件統計存活的RGC以計算其存活率。
1.4 全視野ERG
RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各9只，將其提前暗適應12 h，由視覺電生理儀進行ERG記錄[9]。用鍍金鋼絲環接觸小鼠角膜表面作為記錄電極，將不銹鋼電極插入兩耳間皮下作為參考電極，另一個電極夾住尾部作為地線。依次使用光強為0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000、10.000 cd.s/m2的白光作為閃光刺激，并記錄小鼠a、b波潛伏期及振幅。振蕩電位（Ops）則在光強為3.0 cd.s/m2時記錄，Ops的大小確定為主要振幅的總和。對于光負性反應（PhNR），小鼠先于25.0 cd.s/m2的綠色背景中明適應8 min，再以光強10.0 cd.s/m2閃光刺激，記錄PhNR潛伏期及振幅，其振幅為該波谷相對于基線的距離。
1.5 視動反應（OMR）
參照文獻[10-11]的方法檢測小鼠視敏度。RIR建模后第7天，取正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠各9只，使用MATLAB軟件（美國MathWorks公司）和虛擬光眼視動儀檢測其視敏度。各組小鼠提前暗適應4 h后轉移至一組方形電腦顯示器中間的平臺中心上，此時顯示器上顯示移動光柵，小鼠通過向光柵旋轉方向移動頭部，反射性地對光柵旋轉作出反應。
1.6 Western blot
采用Western blot檢測正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7的蛋白表達。玻璃體腔注射病毒4周后，取3組小鼠各5只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球，于冰上迅速取出視網膜組織。提取蛋白后，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白質定量。經15% SDS-PAGE電泳、轉膜、孵育抗KLF7（1∶1000）、抗GAPDH（1∶2000）抗體后，用ECL試劑盒制備免疫反應條帶，并使用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值，以KLF7與GAPDH的灰度值之比反映KLF7的蛋白表達水平。
1.7 統計學分析
所有數據均采用Graph Pad Prism 7.0軟件進行分析。數據均以均數標準差（）表示。多組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正檢驗水準。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常組小鼠眼壓為（8.4001.075）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；RIR組小鼠建模前、建模中、建模后眼壓分別為（6.8001.476）、（74.3006.273）、（7.7001.494）mmHg。與正常組小鼠眼壓相比，RIR組小鼠建模前及建模后眼壓均無明顯變化，差異無統計學意義（t=0.467、0.801，P=0.245、0.052）；建模中即前房灌注時眼壓迅速升高，差異有統計學意義（t=43.980，P＜0.01）。
共聚焦顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜各細胞層未見綠色熒光染色（圖1A）；玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，正常-KLF7組小鼠RGC層（GCL）、內核層（INL）及內叢狀層（IPL）、外叢狀層（OPL）均可見強綠色熒光，而外核層（ONL）僅見微弱熒光（圖1B）。
圖1
小鼠視網膜共聚焦顯微鏡像。1A示正常組，視網膜各細胞層未見綠色熒光染色；1B示正常-KLF7組，玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體4周后，小鼠視網膜GCL、IPL、INL、OPL均可見綠色強熒光，ONL僅見微弱熒光 GFP+DAPI 標尺：50 μm
熒光顯微鏡觀察發現，正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠總RGC存活率分別為（100.000 ±8.789）%、（54.0906.249）%、（98.9806.922）%、（78.1202.354）%、（55.0804.613）%。與正常組比較，RIR組小鼠總RGC存活率明顯降低，差異有統計學意義（t=12.860，P＜0.01）。與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠總RGC存活率明顯增高，差異有統計學意義（t=6.350，P＜0.01）（圖2～3）。
圖2
各組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。2A～2E分別示正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組。可見RIR組紅色熒光信號較正常組明顯減少，RIR-KLF7組紅色熒光信號較RIR組明顯增多 抗Brn3a抗體 標尺：50 μm
圖3
各組小鼠視網膜總RGC存活率比較。** P＜0.01
全視野ERG檢查結果顯示，隨著刺激光強的增加，正常組小鼠暗適應ERG a、b波振幅逐漸升高，其潛伏期逐漸縮短（圖4A，4B）。與正常組比較，在10.0 cd.s/m2光強刺激下，RIR組小鼠暗適應a、b波振幅明顯降低，差異有統計學意義（t=7.157、5.735，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠暗適應ERG a、b波振幅明顯升高，差異有統計學意義（t=3.253、3.695，P=0.021、0.020）。與正常組比較，RIR組小鼠Ops、PhNR振幅明顯降低，差異均有統計學意義（t=8.953、4.744，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠Ops、PhNR振幅明顯升高，差異均有統計學意義（t=5.825、5.325，P＜0.01）（圖4C～4F）。各組小鼠暗適應a、b波及PhNR潛伏期比較，差異均無統計學意義（F=1.228、1.330、1.489，P=0.314、0.276、0.225）（圖5）。
圖4
各組小鼠ERG各波形振幅比較。4A、4B分別示正常組小鼠暗適應a、b波振幅和潛伏期。隨著刺激光強的增加，振幅逐漸升高，潛伏期逐漸縮短。4C、4D分別示在10.0 cd.s/m2光強刺激下各組小鼠a、b波振幅比較。4E示各組小鼠Ops振幅比較。4F示各組小鼠PhNR振幅比較。*P＜0.05，**P＜0.01
圖5
各組小鼠ERG各波形潛伏期比較。5A、5B分別示在10.0 cd.s/m2光強刺激下各組小鼠a、b波潛伏期比較。5C示各組小鼠PhNR潛伏期比較
OMR檢測結果顯示，正常組、RIR組、正常-KLF7組、RIR-KLF7組、RIR-GFP組小鼠視敏度分別為（0.4110.078）、（0.1310.039）、（0.417±0.061）、（0.2610.055）、（0.1390.060）dB。與正常組小鼠比較，RIR組小鼠視敏度明顯下降，差異有統計學意義（t=9.887，P＜0.01）；與RIR組比較，RIR-KLF7組小鼠視敏度明顯提高，差異有統計學意義（t=4.591，P＜0.01）（圖6）。
圖6
各組小鼠視敏度比較。 ** P＜0.01
Western blot檢測結果顯示，正常組小鼠視網膜上有KLF7蛋白表達。與正常組比較，正常-KLF7組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義（t=4.105，P＜0.01）；正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義（t=0.288，P＞0.05）（圖7）。
圖7
正常組、正常-KLF7組、正常-GFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達水平比較。7A示電泳像；7B示KLF7與GAPDH灰度值之比。** P＜0.01
3 討論
轉錄因子KLF7在成體各組織中低水平廣泛表達，最早通過簡并PCR技術從人血管內皮細胞中克隆得到[12]。其作為鋅指轉錄因子家族中的一員在體內參與許多生物學過程[4-5]。既往研究表明，KLF7在神經系統發育中發揮重要作用[6, 13-14]。Tang等[15]研究發現，在培養的RGC和皮質神經元中過表達KLF7可促進神經元突起向外生長。但KLF7在RIR小鼠模型中的作用尚不明確。因此，我們通過建立RIR模型，觀察KLF7過表達在小鼠RIR損傷中對視網膜形態和功能的影響，以探討KLF7的神經保護作用。
小鼠RIR損傷是青光眼等多種缺血性視網膜疾病的重要病理生理基礎，通過增高眼壓切斷氧氣和葡萄糖的供應，使視網膜缺血缺氧，最終導致RGC死亡和視野不可逆喪失[16-19]。本研究通過眼壓測量和視網膜鋪片熒光顯微鏡觀察確定RIR模型建立成功。在前期預實驗中，我們通過視網膜切片免疫熒光染色觀察AAV2病毒載體不同轉染時間下的轉染效率，發現病毒轉染效率于3周后顯著增加，該結果與文獻報道結果一致[20]。因此，為了保持最佳病毒轉染效率，本研究于病毒轉染3周后進行RIR建模，并于建模后第7天取材。通過Western blot檢測發現，正常-KLF7組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達明顯高于正常組和正常-GFP組。這證實AAV2-KLF7-GFP病毒載體可有效轉染視網膜并過表達KLF7蛋白。但值得注意的是，雖然玻璃體腔注射AAV2-KLF7-GFP病毒載體后KLF7蛋白表達升高，但其升高的水平并不十分顯著；后續實驗可以通過加大病毒液注射量、提高病毒液滴度等策略進一步探究AAV2-KLF7-GFP病毒載體過表達KLF7的積極作用。
研究表明，抗體Brn3a可特異性標記RGC[21]。本研究進行視網膜鋪片免疫熒光染色以評估總RGC存活率。結果顯示，建模成功后第7天，RIR組小鼠總RGC存活率較正常組明顯降低，RIR-KLF7組小鼠總RGC存活率較RIR組明顯增高。這說明高代謝的視網膜耗氧量高，缺血缺氧誘導RGC死亡，而KLF7過表達可對RIR損傷后的RGC發揮神經保護作用。同時，我們利用PhNR的測量確定存活的RGC對光是否仍有反應，以評估各組小鼠RGC的生物電活動。從既往研究結果得出，PhNR的產生與視網膜RGC及其軸突的動作電位活動有關[22-23]。本研究結果顯示，PhNR振幅在小鼠RIR損傷后明顯降低，KLF7過表達后可提高至正常小鼠的75%。這表明KLF7過表達在RIR損傷后對RGC不僅在形態上有神經保護作用，還能夠保護其電生理功能。
本研究進一步觀察ERG a、b波和Ops的變化來評估KLF7過表達對小鼠視網膜功能的影響。ERG是評估視網膜完整性和生理狀態的一種有價值的方法[24-25]。視網膜病變如青光眼、視網膜微血管疾病等常導致ERG的顯著改變。在ERG的各成分中，光刺激引起的電位變化可提供視網膜內不同細胞群的活動信息。在暗適應ERG中，a波即早期的負電位，反映視網膜桿狀光感受器的活動，而b波反映視網膜INL雙極細胞和Müller細胞的電位活動[24-26]。Ops則反映內層視網膜的血液供應狀態[27]。本研究結果顯示，隨著刺激光強的增強，小鼠視網膜ERG a、b波振幅逐漸增高，其潛伏期逐漸縮短。這表明隨著光強的增強，小鼠視網膜光感受器和INL細胞的電活動逐漸增強，且敏感度也隨之增加。然而小鼠在RIR損傷后，其a、b波振幅均明顯降低，提示小鼠視網膜結構受到破壞以及視網膜功能障礙。此外，在小鼠RIR損傷后，Ops振幅明顯降低，提示小鼠內層視網膜血液循環情況不佳。我們還發現，RIR-KLF7組小鼠a、b波和Ops振幅均明顯提高，表明KLF7過表達可改善視網膜功能障礙并可改善內層視網膜血供。然而，RIR-KLF7組小鼠ERG各組成波的潛伏期無明顯變化，表明KLF7過表達不影響小鼠視網膜各層細胞群對閃光刺激的敏感性。
OMR已廣泛應用于視網膜病變如視網膜退行性疾病、青光眼等小鼠的視功能測試[28]。本研究通過OMR來確定改善的電生理反應可否導致在行為意義上的視力改善。本研究結果顯示，小鼠RIR損傷后視敏度明顯下降，RIR-KLF7組小鼠視敏度明顯增高。這說明KLF7過表達可改善小鼠的視力，進一步提示KLF7在小鼠RIR模型中的神經保護作用。
本研究證實，KLF7過表達在小鼠RIR模型中對RGC不僅在形態上有神經保護作用，還可保留其電生理功能，并可改善RIR損傷導致的視網膜功能障礙和血液循環障礙，最終能有效改善小鼠視力。然而暗適應ERG主要反映的是視桿系統的功能，尚不清楚KLF7過表達是否對視錐細胞也有保護作用，以及對雙極細胞和Müller細胞的特異性作用，還需進一步的研究來量化各層細胞的數量，以區分其對每個視網膜細胞群體的影響。此外，本研究僅以RIR建模后第7天為觀察時間點，未連續多次觀察RGC的存活情況，后續實驗將延長觀察時間并設立多個觀察時間點，進一步探究KLF7過表達對RGC存活的影響。盡管如此，本研究結果仍然提示KLF7可能成為治療青光眼的潛在新靶點，在今后的研究中，擬進一步研究KLF7對不同視網膜細胞群體的作用并將從分子生物學水平探索其中具體的分子機制與信號通路。
