引用本文: 楊婭玲, 何太雯, 陳利榮, 柏林, 張仁芳, 劉倩, 盧洪洲. 獲得性免疫缺陷綜合征合并感染性葡萄膜炎患者眼內液病原微生物研究. 中華眼底病雜志, 2020, 36(9): 675-679. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200518-00219 復制
感染性葡萄膜炎是一組嚴重威脅視力的眼內疾病,在普通人群中感染性葡萄膜炎病原微生物分布情況各文獻報道不同[1-4]。獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者機體細胞免疫功能低下,感染性葡萄膜炎及感染性眼內炎的發病率增加,人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者感染性葡萄膜炎發生率是HIV陰性患者的5.6倍[5]。外周血CD4+T淋巴細胞計數(CD4+TC)低的HIV陽性患者更易發生感染性葡萄膜炎。CD4+TC<200個/μl的患者中,94.7%發生感染性葡萄膜炎;而計數>200個/μl的患者中,66.7%發生感染性葡萄膜炎[6-7]。HIV陽性/AIDS患者感染性葡萄膜炎致病微生物因地區、患者免疫狀態及檢測手段不同而各不相同[6-11]。本研究采用二代基因測序技術對臨床診斷為AIDS合并感染性葡萄膜炎患者的眼內液進行檢測,初步了解AIDS患者感染性葡萄膜炎致病微生物分布情況。
1 對象和方法
回顧性病例研究。本研究經上海市公共衛生臨床中心倫理委員會審批(批準號:公衛倫審2020-Y053-01號)。
2018年6月至2019年12月于上海市公共衛生臨床中心住院或門診就診的AIDS合并感染性葡萄膜炎患者31例52只眼納入本研究。其中,男性30例51只眼,女性1例1只眼;年齡26~68歲,平均年齡(38.51±11.17)歲。雙眼20例;單眼11例,其中右眼4例,左眼7例。全葡萄膜炎20例39只眼,壞死性視網膜炎或視神經視網膜炎8例10只眼,脈絡膜視網膜炎2例2只眼,感染性眼內炎1例1只眼。同期血清CD4+TC 0~239個/μl。
納入標準:臨床診斷為病原微生物不明確的AIDS合并感染性葡萄膜炎;已接受高效抗病毒治療;既往無外傷史及眼部手術史。根據病史及自身免疫指標排除自身免疫性因素。
患眼均行視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相、OCT、B型超聲檢查。詳細記錄患者內科疾病診斷情況。患者均獲知情并簽署書面手術知情同意書。無菌條件下采集患眼前房水、玻璃體液標本進行致病微生物檢測。抽取房水0.10~0.15 ml或玻璃體液0.20 ml,其中房水27份,玻璃體液4份。標本于-80 ℃冰箱保存。
采用二代基因測序技術對采集的眼內液進行檢測。應用TIANamp Micro DNA Kit微量樣品基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA,構建DNA文庫。應用Agilent 2100生物芯片分析系統[安捷倫科技(中國)有限公司]質控文庫插入片段大小。應用QubitTM dsDNA HS Assay Kit核酸熒光高敏定量試劑盒(賽默飛世爾科技公司)質控DNA文庫濃度,經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNB納米球,制備好的DNB納米球加載到測序芯片,應用BGISEQ-50高通量基因測序儀(深圳華大智造科技有限公司)進行測序。測序數據下機后去除低質量和長度小于35堿基對的數據以獲得高質量數據,通過BioWebAuth(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)與人類基因參考組對比并去除低復雜度和較短讀取數的數據,得到最終測序數據。然后與專用細菌(3446種)、真菌(206種)、病毒(4152種)、寄生蟲(140種)等4種微生物大數據庫比對,獲得能夠匹配到某種病原體的序列數,根據序列數的高低以及臨床其他檢測判斷可能的病原體。
采用SPSS22.0軟件行統計學分析。年齡、CD4+TC、微生物基因序列數以均數±標準差()表示,進行描述性統計。不同病原微生物感染者CD4+TC比較采用獨立樣本非參數檢驗Kruskal-Wallis單因素方差分析(α=0.05)。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
31份標本中,檢測到巨細胞病毒(CMV)18份(58.1%,18/31),其中單一CMV 9份(50.0%,9/18);水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)5份(16.1%,5/31),其中單一VZV 3份(60.0%,3/5);Epstein-Barr病毒(EBV)9份(29.0%,9/31),其中單一EBV1份(11.1%,1/9);人類β皰疹病毒6型(HHV6)3份(9.7%,3/31),人乳頭狀軟疣病毒(HPV)、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒各1份(3.2%,1/31),均與其他微生物共存;細環病毒8份(25.8%,8/31),其中單一細環病毒1份(12.5%,1/8);梅毒螺旋體5份(16.1%,5/31),其中單一梅毒螺旋體1份(20.0%,1/5);剛地弓形蟲和哈蒙哈蒙球蟲 1份(3.2%,1/31);Synitelium Polycarpum 1份(3.2%,1/31);結核分支桿菌復合群、真菌、微桿菌共存1份(3.2%,1/31)。31份標本中,檢測到病原微生物≥2種15份(48.4%)(表1)。

CMV、VZV、剛地弓形蟲讀取到的基因序列數較高。CMV 18份標本中,基因序列數>105 9份(50.0%),104~105 5份(27.7%),103 1份(5.6%),<102 3份(16.7%)。VZV 5份標本中,基因序列數>104 4份(80.0%)。結核分支桿菌復合群、青霉菌、近平滑念珠菌、季也蒙麥爾酵母菌、微桿菌共存1份標本中,基因序列數<102。所有標本中讀取到HHV6、HPV、人多瘤病毒、庚型炎病毒、細環病毒基因序列數均較低(表1)。
CMV、VZV感染者同期血清CD4+TC均較低。CMV感染者16例,CD4+TC為0~138個/μl,平均CD4+TC為(41.87±51.79)個/μl;CD4+TC<50個/μl者11例(68.8%,11/16)。VZV感染者5例,CD4+TC為10~76個/μl,平均CD4+TC(29.8±26.51)個/μl;CD4+TC<50個/μl者4例(80.0%,4/5)。CMV、VZV感染者21例中,CD4+TC<100個/μl者17例(80.95%,17/21)。CMV、VZV感染者間CD4+TC比較,差異無統計學意義(t=0.688,P>0.05)。梅毒原蟲(梅毒螺旋體、剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum)感染者6例,平均CD4+TC為(172.22±76.62)個/μl,其中CD4+TC>150個/μl者4例(66.7%,4/6),較病毒感染(CMV、VZV、EBV、HHV6)者高。梅毒原蟲感染者CD4+TC與病毒感染者比較,差異有統計學意義(t=-5.192,P<0.05)。結核分支桿菌復合群、真菌、微桿菌共存者1例,CD4+TC為43個/μl。
CMV、梅毒螺旋體感染者病原微生物檢測結果與臨床可疑病原學診斷均符合。根據檢測結果修正病原學診斷5例(16.13%,5/31),其中VZV、剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌合并真菌感染分別為2、1、1、1例。根據修正后的病原學診斷進行治療均有效。細環病毒和(或)HHV6感染者2例,因病原微生物基因序列數少,根據系統疾病診斷仍維持非結核分支桿菌及結核分支桿菌病原學診斷,加強抗非結核分支桿菌或抗結核治療后有效。
3 討論
本研究采用二代基因測序技術在31份AIDS合并感染性葡萄膜炎患者眼內液標本中檢測到多種病原微生物基因序列,其中CMV、VZV基因序列數較高,梅毒螺旋體、剛地弓形蟲及哈蒙哈蒙球蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌及真菌、EBV、HHV6、細環病毒、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒等基因序列數較低。根據病原微生物基因測序序列數及臨床數據,我們認為,CMV、VZV、梅毒螺旋體、剛地弓形蟲、結核分支桿菌復合群、真菌是本組感染性葡萄膜炎患者的致病微生物,其中CMV為最常見致病微生物,其次是VZV、梅毒螺旋體、寄生蟲、結核分支桿菌復合群、真菌。而文獻報道與本研究結果并非一致。南非西北部HIV陽性者感染性葡萄膜炎最常見病原體為單純皰疹病毒(HSV)(52.7%,主要是VZV),其次是結核桿菌(20%)、梅毒螺旋體(7.2%)[6];開普敦HIV陽性者感染性葡萄膜炎最常見病原體為結核桿菌(27.5%),其次是梅毒螺旋體(22.5%)、皰疹病毒(12.2%),包括VZV(10%)、CMV(7.5%)、弓形體(5.0%)、HSV(2.5%)、風疹病毒(2.8%)、HIV(0.9%)[7]。剛果民主共和國HIV合并感染性葡萄膜炎患者中,VZV、結核桿菌、CMV、弓形蟲、HSV分別為43%、16%、12%、10%、4%,隱球菌、肺孢子蟲各為1%[8]。另有文獻報道,HIV合并感染性葡萄膜炎患者眼內液中,CMV為最多見的致病微生物(22%~64%),其次為VZV(5%~22%)、剛地弓形蟲(7%~18%)、HSV(5%~13%)[9-11]。文獻報道中HSV是常見可檢測到的致病微生物,但本組患者眼內液中未檢測到HSV基因序列。其原因我們推測可能與病例數量少有關,是否與地區或種族有關尚不知。本組48.4%的眼內液標本檢測到≥2種病原微生物。這提示AIDS合并感染性葡萄膜炎患眼眼內液中2種及以上病原微生物共感染并不少見。有文獻報道,采用多通道PCR方法在感染性葡萄膜炎眼內液中檢測到2種病原微生物共感染[2,12]。本組眼內液中檢測到基因序列數較低的微生物如EBV、HHV6、細環病毒、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒多與其他病原微生物共存,結合臨床數據,我們認為上述病原微生物毒力低,不是主要致病微生物。既往文獻中對這些這些微生物的報道尚少,原因可能與檢測方法有關。隨著檢測技術的發展,會有更多未知微生物被檢測到。這些微生物與眼部感染是否有明顯關系尚不清楚,但Sandhu等[13]認為部分傳統低毒力無致病性的微生物,即便與感染沒有直接因果關系,但可能是炎癥二次惡化的增強劑。我們推測,對于免疫功能較低的AIDS患者,這些微生物在一定條件下可能也會參與疾病發生發展。
本研究結果顯示,機體細胞免疫功能與眼內液中致病微生物種類有相關性。外周血CD4+TC<100個/μl的患者,更容易發生CMV及VZV葡萄膜炎;CD4+TC>100個/μl的患者,更容易發生梅毒螺旋體及剛地弓形蟲或其他寄生蟲性葡萄膜炎。Rose-Nussbaumer等[14]研究結果顯示,外周血CD4+TC>200個/μl的感染性葡萄膜炎患者中,近50%為梅毒性葡萄膜炎,其次為皰疹病毒、念珠菌及弓形蟲。
本組31例患者中,根據病原微生物檢測結果修正病原學診斷5例,其中2例初診為CMV感染修正為VZV感染,3例初診病原學不明患者修正為剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌合并真菌感染各1例,根據修正后的病原學診斷進行的治療均有效。2例病原微生物檢測基因序列數少的細環病毒和HHV6,根據系統疾病診斷仍維持非結核分支桿菌及結核分支桿菌病原學診斷,加強抗非結核分支桿菌或抗結核治療有效。這2例患者結核分枝桿菌及非結核分支桿菌脈絡膜視網膜炎診斷未得到眼內液二代基因測序結果支持,其原因推測與標本種類有關。其標本均為房水,難以檢測到感染性后葡萄膜炎的致病微生物。這提示,對于單純性感染性后葡萄膜炎的病原學檢測,應盡可能采用玻璃體液標本。
本研究為回顧性病例研究,且納入分析病例數較少,需進一步對更多病例進行前瞻性研究,更準確探討本地區該人群感染性葡萄膜炎眼內液中致病微生物構成狀況。
感染性葡萄膜炎是一組嚴重威脅視力的眼內疾病,在普通人群中感染性葡萄膜炎病原微生物分布情況各文獻報道不同[1-4]。獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者機體細胞免疫功能低下,感染性葡萄膜炎及感染性眼內炎的發病率增加,人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性患者感染性葡萄膜炎發生率是HIV陰性患者的5.6倍[5]。外周血CD4+T淋巴細胞計數(CD4+TC)低的HIV陽性患者更易發生感染性葡萄膜炎。CD4+TC<200個/μl的患者中,94.7%發生感染性葡萄膜炎;而計數>200個/μl的患者中,66.7%發生感染性葡萄膜炎[6-7]。HIV陽性/AIDS患者感染性葡萄膜炎致病微生物因地區、患者免疫狀態及檢測手段不同而各不相同[6-11]。本研究采用二代基因測序技術對臨床診斷為AIDS合并感染性葡萄膜炎患者的眼內液進行檢測,初步了解AIDS患者感染性葡萄膜炎致病微生物分布情況。
1 對象和方法
回顧性病例研究。本研究經上海市公共衛生臨床中心倫理委員會審批(批準號:公衛倫審2020-Y053-01號)。
2018年6月至2019年12月于上海市公共衛生臨床中心住院或門診就診的AIDS合并感染性葡萄膜炎患者31例52只眼納入本研究。其中,男性30例51只眼,女性1例1只眼;年齡26~68歲,平均年齡(38.51±11.17)歲。雙眼20例;單眼11例,其中右眼4例,左眼7例。全葡萄膜炎20例39只眼,壞死性視網膜炎或視神經視網膜炎8例10只眼,脈絡膜視網膜炎2例2只眼,感染性眼內炎1例1只眼。同期血清CD4+TC 0~239個/μl。
納入標準:臨床診斷為病原微生物不明確的AIDS合并感染性葡萄膜炎;已接受高效抗病毒治療;既往無外傷史及眼部手術史。根據病史及自身免疫指標排除自身免疫性因素。
患眼均行視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相、OCT、B型超聲檢查。詳細記錄患者內科疾病診斷情況。患者均獲知情并簽署書面手術知情同意書。無菌條件下采集患眼前房水、玻璃體液標本進行致病微生物檢測。抽取房水0.10~0.15 ml或玻璃體液0.20 ml,其中房水27份,玻璃體液4份。標本于-80 ℃冰箱保存。
采用二代基因測序技術對采集的眼內液進行檢測。應用TIANamp Micro DNA Kit微量樣品基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA,構建DNA文庫。應用Agilent 2100生物芯片分析系統[安捷倫科技(中國)有限公司]質控文庫插入片段大小。應用QubitTM dsDNA HS Assay Kit核酸熒光高敏定量試劑盒(賽默飛世爾科技公司)質控DNA文庫濃度,經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNB納米球,制備好的DNB納米球加載到測序芯片,應用BGISEQ-50高通量基因測序儀(深圳華大智造科技有限公司)進行測序。測序數據下機后去除低質量和長度小于35堿基對的數據以獲得高質量數據,通過BioWebAuth(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)與人類基因參考組對比并去除低復雜度和較短讀取數的數據,得到最終測序數據。然后與專用細菌(3446種)、真菌(206種)、病毒(4152種)、寄生蟲(140種)等4種微生物大數據庫比對,獲得能夠匹配到某種病原體的序列數,根據序列數的高低以及臨床其他檢測判斷可能的病原體。
采用SPSS22.0軟件行統計學分析。年齡、CD4+TC、微生物基因序列數以均數±標準差()表示,進行描述性統計。不同病原微生物感染者CD4+TC比較采用獨立樣本非參數檢驗Kruskal-Wallis單因素方差分析(α=0.05)。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
31份標本中,檢測到巨細胞病毒(CMV)18份(58.1%,18/31),其中單一CMV 9份(50.0%,9/18);水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)5份(16.1%,5/31),其中單一VZV 3份(60.0%,3/5);Epstein-Barr病毒(EBV)9份(29.0%,9/31),其中單一EBV1份(11.1%,1/9);人類β皰疹病毒6型(HHV6)3份(9.7%,3/31),人乳頭狀軟疣病毒(HPV)、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒各1份(3.2%,1/31),均與其他微生物共存;細環病毒8份(25.8%,8/31),其中單一細環病毒1份(12.5%,1/8);梅毒螺旋體5份(16.1%,5/31),其中單一梅毒螺旋體1份(20.0%,1/5);剛地弓形蟲和哈蒙哈蒙球蟲 1份(3.2%,1/31);Synitelium Polycarpum 1份(3.2%,1/31);結核分支桿菌復合群、真菌、微桿菌共存1份(3.2%,1/31)。31份標本中,檢測到病原微生物≥2種15份(48.4%)(表1)。

CMV、VZV、剛地弓形蟲讀取到的基因序列數較高。CMV 18份標本中,基因序列數>105 9份(50.0%),104~105 5份(27.7%),103 1份(5.6%),<102 3份(16.7%)。VZV 5份標本中,基因序列數>104 4份(80.0%)。結核分支桿菌復合群、青霉菌、近平滑念珠菌、季也蒙麥爾酵母菌、微桿菌共存1份標本中,基因序列數<102。所有標本中讀取到HHV6、HPV、人多瘤病毒、庚型炎病毒、細環病毒基因序列數均較低(表1)。
CMV、VZV感染者同期血清CD4+TC均較低。CMV感染者16例,CD4+TC為0~138個/μl,平均CD4+TC為(41.87±51.79)個/μl;CD4+TC<50個/μl者11例(68.8%,11/16)。VZV感染者5例,CD4+TC為10~76個/μl,平均CD4+TC(29.8±26.51)個/μl;CD4+TC<50個/μl者4例(80.0%,4/5)。CMV、VZV感染者21例中,CD4+TC<100個/μl者17例(80.95%,17/21)。CMV、VZV感染者間CD4+TC比較,差異無統計學意義(t=0.688,P>0.05)。梅毒原蟲(梅毒螺旋體、剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum)感染者6例,平均CD4+TC為(172.22±76.62)個/μl,其中CD4+TC>150個/μl者4例(66.7%,4/6),較病毒感染(CMV、VZV、EBV、HHV6)者高。梅毒原蟲感染者CD4+TC與病毒感染者比較,差異有統計學意義(t=-5.192,P<0.05)。結核分支桿菌復合群、真菌、微桿菌共存者1例,CD4+TC為43個/μl。
CMV、梅毒螺旋體感染者病原微生物檢測結果與臨床可疑病原學診斷均符合。根據檢測結果修正病原學診斷5例(16.13%,5/31),其中VZV、剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌合并真菌感染分別為2、1、1、1例。根據修正后的病原學診斷進行治療均有效。細環病毒和(或)HHV6感染者2例,因病原微生物基因序列數少,根據系統疾病診斷仍維持非結核分支桿菌及結核分支桿菌病原學診斷,加強抗非結核分支桿菌或抗結核治療后有效。
3 討論
本研究采用二代基因測序技術在31份AIDS合并感染性葡萄膜炎患者眼內液標本中檢測到多種病原微生物基因序列,其中CMV、VZV基因序列數較高,梅毒螺旋體、剛地弓形蟲及哈蒙哈蒙球蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌及真菌、EBV、HHV6、細環病毒、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒等基因序列數較低。根據病原微生物基因測序序列數及臨床數據,我們認為,CMV、VZV、梅毒螺旋體、剛地弓形蟲、結核分支桿菌復合群、真菌是本組感染性葡萄膜炎患者的致病微生物,其中CMV為最常見致病微生物,其次是VZV、梅毒螺旋體、寄生蟲、結核分支桿菌復合群、真菌。而文獻報道與本研究結果并非一致。南非西北部HIV陽性者感染性葡萄膜炎最常見病原體為單純皰疹病毒(HSV)(52.7%,主要是VZV),其次是結核桿菌(20%)、梅毒螺旋體(7.2%)[6];開普敦HIV陽性者感染性葡萄膜炎最常見病原體為結核桿菌(27.5%),其次是梅毒螺旋體(22.5%)、皰疹病毒(12.2%),包括VZV(10%)、CMV(7.5%)、弓形體(5.0%)、HSV(2.5%)、風疹病毒(2.8%)、HIV(0.9%)[7]。剛果民主共和國HIV合并感染性葡萄膜炎患者中,VZV、結核桿菌、CMV、弓形蟲、HSV分別為43%、16%、12%、10%、4%,隱球菌、肺孢子蟲各為1%[8]。另有文獻報道,HIV合并感染性葡萄膜炎患者眼內液中,CMV為最多見的致病微生物(22%~64%),其次為VZV(5%~22%)、剛地弓形蟲(7%~18%)、HSV(5%~13%)[9-11]。文獻報道中HSV是常見可檢測到的致病微生物,但本組患者眼內液中未檢測到HSV基因序列。其原因我們推測可能與病例數量少有關,是否與地區或種族有關尚不知。本組48.4%的眼內液標本檢測到≥2種病原微生物。這提示AIDS合并感染性葡萄膜炎患眼眼內液中2種及以上病原微生物共感染并不少見。有文獻報道,采用多通道PCR方法在感染性葡萄膜炎眼內液中檢測到2種病原微生物共感染[2,12]。本組眼內液中檢測到基因序列數較低的微生物如EBV、HHV6、細環病毒、人多瘤病毒、庚型肝炎病毒多與其他病原微生物共存,結合臨床數據,我們認為上述病原微生物毒力低,不是主要致病微生物。既往文獻中對這些這些微生物的報道尚少,原因可能與檢測方法有關。隨著檢測技術的發展,會有更多未知微生物被檢測到。這些微生物與眼部感染是否有明顯關系尚不清楚,但Sandhu等[13]認為部分傳統低毒力無致病性的微生物,即便與感染沒有直接因果關系,但可能是炎癥二次惡化的增強劑。我們推測,對于免疫功能較低的AIDS患者,這些微生物在一定條件下可能也會參與疾病發生發展。
本研究結果顯示,機體細胞免疫功能與眼內液中致病微生物種類有相關性。外周血CD4+TC<100個/μl的患者,更容易發生CMV及VZV葡萄膜炎;CD4+TC>100個/μl的患者,更容易發生梅毒螺旋體及剛地弓形蟲或其他寄生蟲性葡萄膜炎。Rose-Nussbaumer等[14]研究結果顯示,外周血CD4+TC>200個/μl的感染性葡萄膜炎患者中,近50%為梅毒性葡萄膜炎,其次為皰疹病毒、念珠菌及弓形蟲。
本組31例患者中,根據病原微生物檢測結果修正病原學診斷5例,其中2例初診為CMV感染修正為VZV感染,3例初診病原學不明患者修正為剛地弓形蟲、Synitelium Polycarpum、結核分枝桿菌合并真菌感染各1例,根據修正后的病原學診斷進行的治療均有效。2例病原微生物檢測基因序列數少的細環病毒和HHV6,根據系統疾病診斷仍維持非結核分支桿菌及結核分支桿菌病原學診斷,加強抗非結核分支桿菌或抗結核治療有效。這2例患者結核分枝桿菌及非結核分支桿菌脈絡膜視網膜炎診斷未得到眼內液二代基因測序結果支持,其原因推測與標本種類有關。其標本均為房水,難以檢測到感染性后葡萄膜炎的致病微生物。這提示,對于單純性感染性后葡萄膜炎的病原學檢測,應盡可能采用玻璃體液標本。
本研究為回顧性病例研究,且納入分析病例數較少,需進一步對更多病例進行前瞻性研究,更準確探討本地區該人群感染性葡萄膜炎眼內液中致病微生物構成狀況。