引用本文： 白周現, 邵敬芝, 陳義兵, 孔祥東. Leber先天性黑矇六家系臨床表現和遺傳分析. 中華眼底病雜志, 2021, 37(3): 195-200. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200430-00191 復制
Leber先天性黒矇（LCA）是一種嚴重遺傳性視網膜疾病，一般在新生兒出生不久即發病。患者多數為常染色體隱性遺傳，少數為常染色體顯性遺傳[1-2]。臨床特征包括眼球震顫、瞳孔反射遲鈍或消失、畏光、指眼征；視網膜表型多樣，個體差異較大。視網膜電圖（ERG）呈熄滅或近熄滅型。LCA具有臨床表型多樣性和遺傳異質性特點[3]，其致病機制與臨床表現以及兩者間的關系一直是國內外研究的難點。本研究采用外顯子捕獲結合高通量測序技術對6個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，明確其致病基因變異并初步分析與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準（批準號：KS-2018-KY-36）；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。眼部臨床資料采集自患者門診和（或）住院病歷及患者提供的既往檢查結果（其中外院檢查采信三甲專科醫院的結果并由本院眼科醫師復核），其中4例患者臨床資料較為詳細。
基因檢測確診的LCA患者6例及其家系成員18名納入本研究。患者分別來自6個無血緣關系家系（圖1）。納入標準：（1）眼球震顫、指壓眼球等表現；（2）視網膜相關病變；（3）ERG呈熄滅或近熄滅型；（4）基因檢測檢出相關致病基因的致病性變異。由于不同患者年齡不同、疾病進程不同以及LCA的臨床表型異質性，其中第4條為必備條件，其他條件為參考條件。
圖1
6個Leber先天性黑矇患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；◇：性別不明胎兒；采集受檢者外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用美國Omega bio-tek公司Blood DNA Midi Kit D3494試劑盒按照操作規程提取全基因組DNA。應用美國Agilent公司Sureselect外顯子靶向序列富集系統對463個相關致病基因的外顯子區域進行液相捕獲；美國Illumina公司Illumina NextSeq 500平臺進行高通量測序，測序深度100×。人類基因組參考序列版本為GRCh37；測序結果注釋篩選分析得到候選致病變異位點。可疑致病變異位點篩選要點：充分了解患者疾病表型、家族史以及相關疾病的臨床表現、相關致病基因突變遺傳方式；根據患者表型和家族史并結合測序所得基因變異注釋信息鎖定致病基因的相關變異；通過變異位點致病性分析，最后確認候選致病變異位點。
應用人類基因變異數據庫（HGMD）、單核苷酸多態性數據庫（dbSNP，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）對目標變異位點進行查詢。通過查詢基因組整合數據庫（gnomAD）了解該變異在人群中出現的頻率。通過PubMed數據庫查詢是否有相關論文報道，已報道的相關致病變異確定為致病性變異。采用GERP++軟件和MutationTaster工具對變異位點的氨基酸進行序列保守性分析；利用SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster等蛋白預測軟件分析錯義變異對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性。SIFT范圍[0,1]，分值越低越有害；MutationTaster范圍[0,1]，分值越高越有害。使用Swiss-PDB-Viewer和PredictProtein生物信息學工具對TULP1基因c.1142T＞G（p.V381G）變異的氨基酸序列進行結構、致病性和氨基酸替換影響分析，評估該錯義變異的影響[4]。
對測序變異結果進行Sanger測序法驗證。以提取的家系成員基因組DNA為模板，使用Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）和特異引物（GeneTool設計）對目標序列進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環32次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。聚合酶鏈反應（PCR）擴增的目的DNA片段純化后，應用美國ABI公司dGTP BigDye?熒光標記終止物試劑盒測序。測序反應參數：96 ℃預變性1 min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環25次，4 ℃保存。按照BigDyeV3.1操作手冊，乙醇/醋酸鈉純化，美國ABI公司ABI 3130xl測序儀進行測序。
2 結果
家系1患者（Ⅱ2），男，3歲。以雙眼視力差6個月余，眼球水平震顫、指眼征、夜盲就診。雙眼視盤邊界模糊，視網膜色澤較暗。光相干斷層掃描（OCT）檢查，黃斑顳側視網膜神經上皮層變薄，黃斑中心凹后凹。家系2患者（Ⅱ1），女，4歲。3月齡發現眼球水平震顫，3歲出現夜盲。雙眼黃斑中心凹形態存在。OCT檢查，黃斑中心凹視網膜厚度未見明顯異常。ERG近熄滅型。家系3患者（Ⅱ2），女，33歲。雙眼視力手動。自幼雙眼視力差，6月齡發現眼球震顫、指眼征，既往有夜盲史。雙眼眼底周邊視網膜色素沉著，視盤顏色淡，血管纖細。熒光素眼底血管造影（FFA）檢查，雙眼視網膜色素變性（RP），黃斑中心凹變平。OCT檢查，右眼視盤平均視網膜神經纖維層（RNFL）厚度降低、杯盤比增大；左眼視盤下方RNFL變薄。ERG應答反應未檢測出。家系4患者（Ⅱ1），男，5歲。4月齡發現眼球水平震顫、畏光、指眼征，夜間視力差。眼底檢查未見明顯異常改變；ERG呈熄滅型。家系5患者（Ⅱ2），女，30歲。5歲發現夜盲；無眼球震顫、指眼征。9歲行視神經手術，具體不詳。雙眼眼底RP。家系6患者（Ⅱ1），男，6歲。雙眼視力光感。無早產史，3月齡目視不能追物，眼球水平震顫、指眼征；視物模糊；曾誤診為皮質盲。雙眼視盤邊界清楚，顏色尚可；視網膜血管發育至Ⅲ區，無加速病變；黃斑中心凹反光可見，視網膜平復。ERG檢查幾乎呈熄滅型。所有患者父母眼部表型均未見異常。
DNA測序結果顯示，6例患者均檢測到與表型高度相關的基因變異（表1，圖2）。其他家系成員測序結果顯示，家系1中Ⅰ1、Ⅱ1均攜帶TULP1 c.1142T＞G雜合變異，Ⅰ2、Ⅱ3均攜帶TULP1 c.1318C＞T雜合變異；家系2中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ2均攜帶TULP1 c.1318C＞T雜合變異；家系3中Ⅰ1攜帶RPGRIP1 c.1468-2A＞G雜合變異，Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ2均攜帶RPGRIP1 c.391delG雜合變異；家系4中Ⅰ1、Ⅰ2均攜帶GUCY2D c.3177_3178delAC雜合變異；家系5中Ⅰ2、Ⅰ3分別攜帶TULP1 c.1153G＞A、c.1561C＞T雜合變異；家系6中Ⅰ1、Ⅰ2分別攜帶RPGRIP1 c.715delA、c.1765C＞T雜合變異，Ⅱ2未見此變異。
表1
LCA 6個家系患者的基因變異檢測結果
圖2
Leber先天性黑矇家系患者基因Sanger測序圖。2A、2B分別示家系1 TULP1基因c.1142T＞G、c.1318C＞T雜合突變（紅箭）；2C、2D分別示家系2 TULP1基因c.1318C＞T純合突變、c.1318C＞T雜合突變（紅箭）；2E、2F示家系3 RPGRIP1基因c.391delG、c.1468-2A＞G雜合突變（紅箭）；2G、2H分別示家系6 RPGRIP1基因c.715delA、c.1765C＞T雜合突變（紅箭）
Sanger測序驗證結果顯示，所有患者各相關基因變異結果與測序結果一致，其父母均為相關致病突變基因攜帶者；家系內基因型和疾病表型共分離。
變異致病性分析結果顯示，TULP1基因c.1142T＞G（p.V381G）、RPGRIP1基因c.391delG（p.V131Sfs*39）、c.715delA（p.K239Sfs*36）及c.1765C＞T（p.Q589X）、GUCY2D基因c.3177_3178delAC（p.R1060Rfs*11）在PubMed數據庫中未見報道；在HGMD專業版中未見收錄。其中，RPGRIP1基因c.391delG、c.715delA和GUCY2D基因c.3177_3178delAC為移碼突變；RPGRIP1基因c.1765C＞T、TULP1基因c.1142T＞G分別為無義突變、錯義突變。依據《遺傳變異分類標準與指南》和2015年版《ACMG Standard and Guidelines》判斷上述3個移碼突變和1個無義突變為致病性變異（致病性極強，等級PVS1）。其致病性變異主要表現為翻譯過程提前終止而產生了截短的無功能產物蛋白。
TULP1基因c.1142T＞G位點在dbSNP數據庫中無記錄編號，不屬于多態性位點，人群發生頻率極低。gnomAD數據庫查詢該變異在人群中發生頻率未記錄。SIFT、PolyPhen2、MutationTaster蛋白預測軟件對該位點的預測值分別為0.000、0.994、1.000，均為有害或致病。c.1142T＞G（p.V381G）位點綜合預測分析結果為具有致病性（圖3）。Swiss-PDB-Viewer、PredictProtein分析結果顯示，p.V381G變異位于β折疊結構上且覆蓋在內部，第381位氨基酸由非極性二級結構趨向β折疊的纈氨酸替換為極性不帶電二級結構趨向β轉角的甘氨酸（圖3A，3B）。c.1145T＞C（p.F382S）是位置相近類型相同的已知致病性錯義突變[8]。PredictProtein分析顯示，錯義突變p.V381G、p.F382S分值分別為65、77分，均為有害變異。c.1142T＞G（p.V381G）氨基酸序列保守性GERP++估值2.54（＞2表示保守），預測為保守區域。氨基酸保守性分析發現，TULP1基因p.V381位點在人類、黑猩猩、小鼠、家雞、河豚、斑馬魚、非洲爪蟾等脊椎動物中高度保守（圖3C）。
圖3
TULP1基因p.V381G變異位點的生物信息學分析。3A示蛋白二級結構；3B示致病預測，錯義突變p.V381G（黑框交叉處）、p.F382S（黃框交叉處）分值分別為65、77分，為有害變異 圖中藍色、紅色色塊分別為良性、有害，圖下紅色長方框表示β折疊二級結構；3C示物種間序列保守性
3 討論
本研究6個不同家系患者的主要臨床表現（全部或部分）包含眼球震顫、指壓眼球、畏光、夜盲、ERG熄滅或近熄滅型、視網膜病變，符合LCA臨床表型特征。根據孟德爾遺傳定律，多數LCA屬于常染色體隱性遺傳單基因遺傳病，本研究針對相關眼遺傳致病基因靶向捕獲并測序進行變異篩查，結果顯示，家系1、2、5為TULP1基因變異的LCA 15型，家系3、6為RPGRIP1基因變異的LCA 6型，家系4為GUCY2D基因變異的LCA 1型。所有家系患者父母表型正常且均攜帶相關雜合變異。通過臨床表型結合遺傳分析，本研究6例患者均為相關基因變異所致。
TULP1基因編碼TUB樣蛋白1，主要位于光感受器細胞，參與轉錄、激活視蛋白和囊泡蛋白等轉運，對視網膜發育具有重要作用[9]。TULP1基因敲除小鼠實驗證明TULP1缺失表達導致光感受器細胞的視紫紅質異位[10]。TULP1基因變異可導致LCA 15型和RP 14型。RPGRIP1基因編碼一種與視網膜色素沉著GTPase調節蛋白相互作用的光感受器蛋白，參與調節纖毛間的蛋白質轉運及光感受器外節膜盤的脫落和更新，是視錐細胞和視桿細胞的關鍵組成部分[11]。該基因變異后將導致視網膜萎縮及嚴重視功能損害[12]。RPGRIP1基因變異可導致LCA 6型。GUCY2D基因編碼視網膜特異性鳥苷酸環化酶，該酶具有疏水性氨基末端信號序列，作為一種跨膜蛋白不被利鈉肽激活。GUCY2D變異會導致光感受器細胞發生快速變性，影響光信號向電信號傳導[13]。GUCY2D基因變異可導致LCA 1型。LCA 15型有LCA的一般特點，疾病嚴重程度輕于其他2個亞型，但發病年齡早、表型嚴重于RP。LCA 6型特點為視力嚴重損害，早期視網膜形態多為正常，逐漸進展為RP；早期中心凹處外核層厚度正常，但快速變薄至無法測量，并逐漸向外周視網膜擴展[12]。LCA 1型特點為視力嚴重損害，眼底通常無明顯病變，畏光明顯[14]。上述3個基因在視覺通路中的角色和作用可能導致了LCA疾病的具體特點和嚴重程度的差異。
高通量基因組測序技術能夠幫助疑似LCA的臨床確診及其亞型的鑒別。Eisenberger等[15]對歐洲人群LCA患者行二代測序發現，前3位致病基因為RPGRIP1、GUCY2D、TULP1，分別占12.5%、10.7%、10.7%。Li等[6]對中國人群LCA患者測序顯示前3位致病基因為GUCY2D、CRB1、RPGRIP1，分別占16.0%、11.0%、8.0%。依據臨床表現和突變型，本研究6個家系中家系1、2患者符合LCA 15型；家系5患者LCA表型不典型，但發病早且較RP視力損害嚴重，所攜帶的TULP1基因c.1153G＞A和c.1561C＞T突變既往已有報道[5,7]，分別與LCA 15型和RP 14型相關，綜合判斷為LCA 15型可能性大；家系3、6患者符合LCA 6型；家系4患者符合LCA 1型。本研究6例患者3個亞型的眼底表型多有差異，LCA 15型（TULP1）雙眼視盤邊界模糊、RP、黃斑顳側視網膜神經上皮變薄、黃斑中心凹后凹厚度尚可。家系3患者為LCA 6型（RPGRIP1），雙眼RP、黃斑中心凹變平；右眼視盤平均RNFL厚度降低、杯盤比增大，左眼視盤下方RNFL變薄、周邊視網膜色素沉著、視盤顏色淡、血管纖細；然而家系6患者雙眼視盤邊界清楚，顏色尚可，視網膜血管發育至III區，無加速病變，黃斑中心凹反光可見，視網膜平復。家系4患者為LCA 1型（GUCY2D），病歷記錄眼底未見明顯異常。本研究結果提示，不同基因型LCA亞型患者眼底表現存在差異，即使相同基因型患者其眼底表現也可能表現不同。
本研究從LCA臨床表現和遺傳變異水平闡明了6個不同家系患者的致病原因，分析了TULP1、RPGRIP1和GUCY2D基因相關變異的致病性；發現導致LCA的5個新的變異位點，拓展了常染色體隱性遺傳LCA致病基因變異譜；為LCA檢查確診、遺傳咨詢和產前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據。但由于LCA眼部臨床表型的多樣性和致病基因的異質性，本研究的有限樣本并不能涵蓋本病的全部情況，臨床及科研工作還需要全面和具體的分析。
Leber先天性黒矇（LCA）是一種嚴重遺傳性視網膜疾病，一般在新生兒出生不久即發病。患者多數為常染色體隱性遺傳，少數為常染色體顯性遺傳[1-2]。臨床特征包括眼球震顫、瞳孔反射遲鈍或消失、畏光、指眼征；視網膜表型多樣，個體差異較大。視網膜電圖（ERG）呈熄滅或近熄滅型。LCA具有臨床表型多樣性和遺傳異質性特點[3]，其致病機制與臨床表現以及兩者間的關系一直是國內外研究的難點。本研究采用外顯子捕獲結合高通量測序技術對6個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，明確其致病基因變異并初步分析與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準（批準號：KS-2018-KY-36）；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。眼部臨床資料采集自患者門診和（或）住院病歷及患者提供的既往檢查結果（其中外院檢查采信三甲專科醫院的結果并由本院眼科醫師復核），其中4例患者臨床資料較為詳細。
基因檢測確診的LCA患者6例及其家系成員18名納入本研究。患者分別來自6個無血緣關系家系（圖1）。納入標準：（1）眼球震顫、指壓眼球等表現；（2）視網膜相關病變；（3）ERG呈熄滅或近熄滅型；（4）基因檢測檢出相關致病基因的致病性變異。由于不同患者年齡不同、疾病進程不同以及LCA的臨床表型異質性，其中第4條為必備條件，其他條件為參考條件。
圖1
6個Leber先天性黑矇患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；●：女性患者；◇：性別不明胎兒；采集受檢者外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用美國Omega bio-tek公司Blood DNA Midi Kit D3494試劑盒按照操作規程提取全基因組DNA。應用美國Agilent公司Sureselect外顯子靶向序列富集系統對463個相關致病基因的外顯子區域進行液相捕獲；美國Illumina公司Illumina NextSeq 500平臺進行高通量測序，測序深度100×。人類基因組參考序列版本為GRCh37；測序結果注釋篩選分析得到候選致病變異位點。可疑致病變異位點篩選要點：充分了解患者疾病表型、家族史以及相關疾病的臨床表現、相關致病基因突變遺傳方式；根據患者表型和家族史并結合測序所得基因變異注釋信息鎖定致病基因的相關變異；通過變異位點致病性分析，最后確認候選致病變異位點。
應用人類基因變異數據庫（HGMD）、單核苷酸多態性數據庫（dbSNP，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）對目標變異位點進行查詢。通過查詢基因組整合數據庫（gnomAD）了解該變異在人群中出現的頻率。通過PubMed數據庫查詢是否有相關論文報道，已報道的相關致病變異確定為致病性變異。采用GERP++軟件和MutationTaster工具對變異位點的氨基酸進行序列保守性分析；利用SIFT、PolyPhen_2、MutationTaster等蛋白預測軟件分析錯義變異對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性。SIFT范圍[0,1]，分值越低越有害；MutationTaster范圍[0,1]，分值越高越有害。使用Swiss-PDB-Viewer和PredictProtein生物信息學工具對TULP1基因c.1142T＞G（p.V381G）變異的氨基酸序列進行結構、致病性和氨基酸替換影響分析，評估該錯義變異的影響[4]。
對測序變異結果進行Sanger測序法驗證。以提取的家系成員基因組DNA為模板，使用Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）和特異引物（GeneTool設計）對目標序列進行擴增。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環32次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。聚合酶鏈反應（PCR）擴增的目的DNA片段純化后，應用美國ABI公司dGTP BigDye?熒光標記終止物試劑盒測序。測序反應參數：96 ℃預變性1 min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環25次，4 ℃保存。按照BigDyeV3.1操作手冊，乙醇/醋酸鈉純化，美國ABI公司ABI 3130xl測序儀進行測序。
2 結果
家系1患者（Ⅱ2），男，3歲。以雙眼視力差6個月余，眼球水平震顫、指眼征、夜盲就診。雙眼視盤邊界模糊，視網膜色澤較暗。光相干斷層掃描（OCT）檢查，黃斑顳側視網膜神經上皮層變薄，黃斑中心凹后凹。家系2患者（Ⅱ1），女，4歲。3月齡發現眼球水平震顫，3歲出現夜盲。雙眼黃斑中心凹形態存在。OCT檢查，黃斑中心凹視網膜厚度未見明顯異常。ERG近熄滅型。家系3患者（Ⅱ2），女，33歲。雙眼視力手動。自幼雙眼視力差，6月齡發現眼球震顫、指眼征，既往有夜盲史。雙眼眼底周邊視網膜色素沉著，視盤顏色淡，血管纖細。熒光素眼底血管造影（FFA）檢查，雙眼視網膜色素變性（RP），黃斑中心凹變平。OCT檢查，右眼視盤平均視網膜神經纖維層（RNFL）厚度降低、杯盤比增大；左眼視盤下方RNFL變薄。ERG應答反應未檢測出。家系4患者（Ⅱ1），男，5歲。4月齡發現眼球水平震顫、畏光、指眼征，夜間視力差。眼底檢查未見明顯異常改變；ERG呈熄滅型。家系5患者（Ⅱ2），女，30歲。5歲發現夜盲；無眼球震顫、指眼征。9歲行視神經手術，具體不詳。雙眼眼底RP。家系6患者（Ⅱ1），男，6歲。雙眼視力光感。無早產史，3月齡目視不能追物，眼球水平震顫、指眼征；視物模糊；曾誤診為皮質盲。雙眼視盤邊界清楚，顏色尚可；視網膜血管發育至Ⅲ區，無加速病變；黃斑中心凹反光可見，視網膜平復。ERG檢查幾乎呈熄滅型。所有患者父母眼部表型均未見異常。
DNA測序結果顯示，6例患者均檢測到與表型高度相關的基因變異（表1，圖2）。其他家系成員測序結果顯示，家系1中Ⅰ1、Ⅱ1均攜帶TULP1 c.1142T＞G雜合變異，Ⅰ2、Ⅱ3均攜帶TULP1 c.1318C＞T雜合變異；家系2中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ2均攜帶TULP1 c.1318C＞T雜合變異；家系3中Ⅰ1攜帶RPGRIP1 c.1468-2A＞G雜合變異，Ⅰ2、Ⅲ1、Ⅲ2均攜帶RPGRIP1 c.391delG雜合變異；家系4中Ⅰ1、Ⅰ2均攜帶GUCY2D c.3177_3178delAC雜合變異；家系5中Ⅰ2、Ⅰ3分別攜帶TULP1 c.1153G＞A、c.1561C＞T雜合變異；家系6中Ⅰ1、Ⅰ2分別攜帶RPGRIP1 c.715delA、c.1765C＞T雜合變異，Ⅱ2未見此變異。
表1
LCA 6個家系患者的基因變異檢測結果
圖2
Leber先天性黑矇家系患者基因Sanger測序圖。2A、2B分別示家系1 TULP1基因c.1142T＞G、c.1318C＞T雜合突變（紅箭）；2C、2D分別示家系2 TULP1基因c.1318C＞T純合突變、c.1318C＞T雜合突變（紅箭）；2E、2F示家系3 RPGRIP1基因c.391delG、c.1468-2A＞G雜合突變（紅箭）；2G、2H分別示家系6 RPGRIP1基因c.715delA、c.1765C＞T雜合突變（紅箭）
Sanger測序驗證結果顯示，所有患者各相關基因變異結果與測序結果一致，其父母均為相關致病突變基因攜帶者；家系內基因型和疾病表型共分離。
變異致病性分析結果顯示，TULP1基因c.1142T＞G（p.V381G）、RPGRIP1基因c.391delG（p.V131Sfs*39）、c.715delA（p.K239Sfs*36）及c.1765C＞T（p.Q589X）、GUCY2D基因c.3177_3178delAC（p.R1060Rfs*11）在PubMed數據庫中未見報道；在HGMD專業版中未見收錄。其中，RPGRIP1基因c.391delG、c.715delA和GUCY2D基因c.3177_3178delAC為移碼突變；RPGRIP1基因c.1765C＞T、TULP1基因c.1142T＞G分別為無義突變、錯義突變。依據《遺傳變異分類標準與指南》和2015年版《ACMG Standard and Guidelines》判斷上述3個移碼突變和1個無義突變為致病性變異（致病性極強，等級PVS1）。其致病性變異主要表現為翻譯過程提前終止而產生了截短的無功能產物蛋白。
TULP1基因c.1142T＞G位點在dbSNP數據庫中無記錄編號，不屬于多態性位點，人群發生頻率極低。gnomAD數據庫查詢該變異在人群中發生頻率未記錄。SIFT、PolyPhen2、MutationTaster蛋白預測軟件對該位點的預測值分別為0.000、0.994、1.000，均為有害或致病。c.1142T＞G（p.V381G）位點綜合預測分析結果為具有致病性（圖3）。Swiss-PDB-Viewer、PredictProtein分析結果顯示，p.V381G變異位于β折疊結構上且覆蓋在內部，第381位氨基酸由非極性二級結構趨向β折疊的纈氨酸替換為極性不帶電二級結構趨向β轉角的甘氨酸（圖3A，3B）。c.1145T＞C（p.F382S）是位置相近類型相同的已知致病性錯義突變[8]。PredictProtein分析顯示，錯義突變p.V381G、p.F382S分值分別為65、77分，均為有害變異。c.1142T＞G（p.V381G）氨基酸序列保守性GERP++估值2.54（＞2表示保守），預測為保守區域。氨基酸保守性分析發現，TULP1基因p.V381位點在人類、黑猩猩、小鼠、家雞、河豚、斑馬魚、非洲爪蟾等脊椎動物中高度保守（圖3C）。
圖3
TULP1基因p.V381G變異位點的生物信息學分析。3A示蛋白二級結構；3B示致病預測，錯義突變p.V381G（黑框交叉處）、p.F382S（黃框交叉處）分值分別為65、77分，為有害變異 圖中藍色、紅色色塊分別為良性、有害，圖下紅色長方框表示β折疊二級結構；3C示物種間序列保守性
3 討論
本研究6個不同家系患者的主要臨床表現（全部或部分）包含眼球震顫、指壓眼球、畏光、夜盲、ERG熄滅或近熄滅型、視網膜病變，符合LCA臨床表型特征。根據孟德爾遺傳定律，多數LCA屬于常染色體隱性遺傳單基因遺傳病，本研究針對相關眼遺傳致病基因靶向捕獲并測序進行變異篩查，結果顯示，家系1、2、5為TULP1基因變異的LCA 15型，家系3、6為RPGRIP1基因變異的LCA 6型，家系4為GUCY2D基因變異的LCA 1型。所有家系患者父母表型正常且均攜帶相關雜合變異。通過臨床表型結合遺傳分析，本研究6例患者均為相關基因變異所致。
TULP1基因編碼TUB樣蛋白1，主要位于光感受器細胞，參與轉錄、激活視蛋白和囊泡蛋白等轉運，對視網膜發育具有重要作用[9]。TULP1基因敲除小鼠實驗證明TULP1缺失表達導致光感受器細胞的視紫紅質異位[10]。TULP1基因變異可導致LCA 15型和RP 14型。RPGRIP1基因編碼一種與視網膜色素沉著GTPase調節蛋白相互作用的光感受器蛋白，參與調節纖毛間的蛋白質轉運及光感受器外節膜盤的脫落和更新，是視錐細胞和視桿細胞的關鍵組成部分[11]。該基因變異后將導致視網膜萎縮及嚴重視功能損害[12]。RPGRIP1基因變異可導致LCA 6型。GUCY2D基因編碼視網膜特異性鳥苷酸環化酶，該酶具有疏水性氨基末端信號序列，作為一種跨膜蛋白不被利鈉肽激活。GUCY2D變異會導致光感受器細胞發生快速變性，影響光信號向電信號傳導[13]。GUCY2D基因變異可導致LCA 1型。LCA 15型有LCA的一般特點，疾病嚴重程度輕于其他2個亞型，但發病年齡早、表型嚴重于RP。LCA 6型特點為視力嚴重損害，早期視網膜形態多為正常，逐漸進展為RP；早期中心凹處外核層厚度正常，但快速變薄至無法測量，并逐漸向外周視網膜擴展[12]。LCA 1型特點為視力嚴重損害，眼底通常無明顯病變，畏光明顯[14]。上述3個基因在視覺通路中的角色和作用可能導致了LCA疾病的具體特點和嚴重程度的差異。
高通量基因組測序技術能夠幫助疑似LCA的臨床確診及其亞型的鑒別。Eisenberger等[15]對歐洲人群LCA患者行二代測序發現，前3位致病基因為RPGRIP1、GUCY2D、TULP1，分別占12.5%、10.7%、10.7%。Li等[6]對中國人群LCA患者測序顯示前3位致病基因為GUCY2D、CRB1、RPGRIP1，分別占16.0%、11.0%、8.0%。依據臨床表現和突變型，本研究6個家系中家系1、2患者符合LCA 15型；家系5患者LCA表型不典型，但發病早且較RP視力損害嚴重，所攜帶的TULP1基因c.1153G＞A和c.1561C＞T突變既往已有報道[5,7]，分別與LCA 15型和RP 14型相關，綜合判斷為LCA 15型可能性大；家系3、6患者符合LCA 6型；家系4患者符合LCA 1型。本研究6例患者3個亞型的眼底表型多有差異，LCA 15型（TULP1）雙眼視盤邊界模糊、RP、黃斑顳側視網膜神經上皮變薄、黃斑中心凹后凹厚度尚可。家系3患者為LCA 6型（RPGRIP1），雙眼RP、黃斑中心凹變平；右眼視盤平均RNFL厚度降低、杯盤比增大，左眼視盤下方RNFL變薄、周邊視網膜色素沉著、視盤顏色淡、血管纖細；然而家系6患者雙眼視盤邊界清楚，顏色尚可，視網膜血管發育至III區，無加速病變，黃斑中心凹反光可見，視網膜平復。家系4患者為LCA 1型（GUCY2D），病歷記錄眼底未見明顯異常。本研究結果提示，不同基因型LCA亞型患者眼底表現存在差異，即使相同基因型患者其眼底表現也可能表現不同。
本研究從LCA臨床表現和遺傳變異水平闡明了6個不同家系患者的致病原因，分析了TULP1、RPGRIP1和GUCY2D基因相關變異的致病性；發現導致LCA的5個新的變異位點，拓展了常染色體隱性遺傳LCA致病基因變異譜；為LCA檢查確診、遺傳咨詢和產前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據。但由于LCA眼部臨床表型的多樣性和致病基因的異質性，本研究的有限樣本并不能涵蓋本病的全部情況，臨床及科研工作還需要全面和具體的分析。
