引用本文： 魏圓夢, 李苗, 彭海鷹, 周鐘強, 唐賀, 史平玲, 梁迎娟, 田美芝. 早發性嚴重視網膜營養不良一家系TULP1和CNGB1基因突變. 中華眼底病雜志, 2021, 37(1): 47-53. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200427-00182 復制
早發性嚴重視網膜營養不良（EOSRD）是一種嚴重影響視功能的遺傳性視網膜疾病，目前部分學者認為其是Leber先天性黑矇（LCA）較輕的一種亞型[1-2]。大多EOSRD患者于1～5歲發病，其眼底及全視野視網膜電圖（ff-ERG）表現與LCA相似，但視功能相對LCA更好[1-2]。本病為常染色體隱性遺傳，偶見顯性遺傳。目前確定與LCA/ EOSRD相關的基因有25個，但這些基因僅能解釋70%～80% LCA和（或）EOSRD患者的發病原因[1-2]。我們采用目標區域捕獲測序方法對一個漢族EOSRD家系進行檢測，在Tubby樣蛋白（TULP）1基因、環核苷酸門控通道β1（CNGB1）基因發現3個新的變異位點。現將檢測結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審批[批文號：HNEECKY-2019（15號）]，嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則。所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。
2018年8月于河南省立眼科醫院檢查確診的一個漢族EOSRD家系（圖1）中1例患者及3名家系成員納入本研究。詳細詢問和記錄該家系家族史；患者及3名家系成員均行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、全景眼底彩色照相、頻域光相干斷層掃描（SD-OCT）及ff-ERG檢查。
圖1
早發性嚴重視網膜營養不良患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先證者
采集受試者外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。按照標準提取流程，采用康為試劑生物技術有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒提取4名受試者全基因組DNA；采用美國GE公司的NavoVue微型光度計對提取的DNA進行質量檢測，將符合要求的基因組DNA分裝后于?20 ℃保存待用。
提取得到的基因組DNA，采用北京中因科技有限公司自主開發設計的捕獲芯片，應用安捷倫公司的捕獲試劑盒，構建捕獲片段文庫。通過Illumina HiSeq高通量測序平臺測序，二代Panel的平均測序深度為500X，數據量為1G。測序結果比對人類參考基因組檢出并注釋變異，對變異采用Sanger測序進行驗證。其后根據多個數據庫信息和蛋白功能預測軟件結果，篩選可能的致病變異位點，變異的檢出、注釋和篩選的詳細方法同文獻[3]。所有基因序列參考美國國立生物技術信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因組數據庫網站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
通過NCBI數據庫對變異基因翻譯的氨基酸序列進行保守性分析。應用蛋白功能預測軟件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）和PROVEAN等進行基因變異致病性預測。應用I-TASSER軟件建立蛋白結構模型。參考美國遺傳學和基因組學學院（ACMG）標準和指南[4]，對所有變異位點進行致病等級評估。
2 結果
先證者（Ⅱ2），女，6歲。其父母訴患兒于1歲以后開始出現雙眼夜間視力差。患兒右眼BCVA +1.50/－3.25×180→0.1，左眼BCVA +1.25/－3.75×175→0.1。雙眼眼前節及玻璃體未見異常。雙眼視盤顏色稍淡，視網膜血管管徑稍變細，血管弓外視網膜可見廣泛色素改變（圖2）。雙眼眼球運動正常，未見明顯眼球震顫。眼位檢查33 cm映光外斜15°。SD-OCT檢查可見雙眼黃斑中心凹處外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶結構欠清、斷續；中心凹外可視區神經上皮外叢狀層、外核層、外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶逐漸消失，色素上皮層厚度欠均勻（圖3）。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統功能嚴重下降（圖4）。其他家系成員均無EOSRD典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳。
圖2
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者雙眼彩色眼底像。2A、2B分別示右眼、左眼。雙眼視盤顏色稍淡，視網膜血管管徑稍變細，血管弓外視網膜可見廣泛色素改變
圖3
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者頻域光相干斷層掃描像。左圖為掃描方向，右圖為檢查結果。3A、3B分別示右眼、左眼。雙眼黃斑中心凹處外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶結構欠清、斷續；中心凹外可視區神經上皮外叢狀層、外核層、外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶逐漸消失，色素上皮層厚度欠均勻
圖4
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者全視野視網膜電圖（ERG）像。綠色波形為右眼；藍色波形為左眼。4A示暗適應0.01 ERG；4B示暗適應3.0 ERG；4C示暗適應10.0 ERG；4D示暗適應3.0震蕩電位；4E示明適應3.0 ERG；4F示明適應3.0閃爍光ERG。雙眼均未檢測到明顯波形
先證者檢測到TULP1基因的純合突變c.921C＞A（p.Cys307*）以及CNGB1基因的復合雜合突變c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。先證者父親（Ⅰ1）攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）；母親（Ⅰ2）、兄長（Ⅱ1）攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。3名家系成員的2個基因均為復合雜合突變（圖5）。
圖5
早發性嚴重視網膜營養不良家系基因測序圖。M1：Tubby樣蛋白1（TULP1） c.921C＞A（p.Cys307*）；M2：環核苷酸門控通道β1（CNGB1）c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）；M3：CNGB1 c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）。Ⅱ2：先證者；Ⅰ1：先證者父親；Ⅰ2：先證者母親；Ⅱ1：先證者兄長。先證者父親、母親、兄長攜帶TULP1基因c.921C＞A突變；父親攜帶CNGB1基因c.3121C＞T突變；母親、兄長攜帶CNGB1基因c.3488G＞A突變；先證者同時攜帶3個突變位點
與數據庫對比發現，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在ExAC等數據庫未見收錄；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）在ExAC、GnomAD中收錄的突變頻率均為0.000 01，千人基因組計劃數據庫中未見收錄；CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在ExAC、GnomAD、千人基因組計劃數據庫中收錄的突變頻率分別為0.000 09、0.000 08和0.000 1。
氨基酸保守性分析發現，TULP1基因翻譯的氨基酸序列第307位半胱氨酸在人、黑猩猩、獼猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、雞、爪蟾中高度保守（圖6A），c.921C＞A（p.Cys307*）導致蛋白質翻譯在高度保守區終止并喪失功能。CNGB1基因翻譯的氨基酸序列第1041位精氨酸在人、黑猩猩、卷尾猴、寬吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守（圖6B），c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）導致堿性的精氨酸突變為非極性的色氨酸。CNGB1基因翻譯的氨基酸序列第1163位甘氨酸在人、大猩猩、烏干達紅疣猴、豚尾猴、獅尾狒、野駱駝、東非狒狒中高度保守（圖6C），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）導致中性的甘氨酸突變為酸性的谷氨酸。此3個位點的氨基酸對蛋白質結構和功能具有重要作用。
圖6
Tubby樣蛋白1（TULP1）基因、環核苷酸門控通道β1（CNGB1）基因在多個物種中的保守性分析圖。6A示 TULP1基因氨基酸序列第307位半胱氨酸，在人、黑猩猩、獼猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、雞、爪蟾中高度保守；6B示CNGB1基因氨基酸序列第1163位甘氨酸，在人、大猩猩、烏干達紅疣猴、豚尾猴、獅尾狒、野駱駝、東非狒狒中高度保守；6C示CNGB1基因氨基酸序列第1041位精氨酸，在人、黑猩猩、卷尾猴、寬吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守
生物信息學分析和致病性推斷，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在蛋白質保守區出現翻譯終止，CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在蛋白質保守區出現氨基酸極性變化，導致蛋白質空間結構產生較大改變（圖7）。3個突變位點經Mutation Taster分析預測均為致病突變。CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）SIFT分析預測值分別為0.000和0.087；Polyphen2分析預測值分別為1.000和0.784；PROVEAN分析預測值分別為?7.740和?3.080。根據ACMG標準和指南[3]評判：TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）突變為致病性突變；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）為可能致病性突變。
圖7
環核苷酸門控通道β1（CNGB1）蛋白三維分子結構分析圖。7A示野生型位點；7B示突變型位點。c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）使CNGB1質序列第1041位堿性的精氨酸（p.R1041）突變為非極性的色氨酸（p.1041W），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）使CNGB1蛋白質序列第1163位中性的甘氨酸（p.G1163）突變為酸性的谷氨酸（p.1163E），導致蛋白質空間結構產生較大改變
3 討論
本研究在一個常染色體隱性遺傳漢族EOSRD家系中發現了3個新的致病突變位點，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。雖然根據患者的病史、視力、眼底檢查及ff-ERG表現，EOSRD診斷并不困難，但將其與LCA鑒別卻不易。雖然EOSRD患者視力相對LCA較好，但由于EOSRD與LCA患者就診時視力已經明顯受損，難以通過視力、眼底及ff-ERG表現甚至基因檢測結果將其嚴格區分。目前認為EOSRD與LCA的唯一鑒別點是發病年齡[1-2]。一般認為患者發病年齡＜1歲為LCA，1～5歲為EOSRD[1-2]。本家系中先證者診斷為EOSRD，其主要原因是其父母明確表述患者為1歲后發病。
TULP1定位于6p21.31，由15個外顯子組成，編碼542個氨基酸，是TULP家族中的一員[5]。TULP蛋白以高度保守的c端Tubby結構域為特征，TULP1基因中的大多數致病突變聚集在TULP1的Tubby區域[6]。TULP1是一種光感受器特異性蛋白，參與了由內節合成的若干光轉導蛋白向外節的轉運；其定位于容納內質網、高爾基體和其他生物合成機制的細胞室，并被認為是作為一種伴侶蛋白或適配器蛋白，將裝載貨物的囊泡與運動蛋白連接起來進行運輸，這些蛋白的目的地是光感受器細胞的外節室[7-9]。有研究表明，在視網膜中，TULP1主要通過光感受器細胞表達，光感受器細胞通過突觸與內視網膜進行交流，TULP1在光感受器突觸前末端的活性區高度富集，與主要的內吞作用蛋白一起靠近突觸帶，TULP1基因對于保持內吞作用蛋白在活性區富集以及在突觸帶附近維持高水平的內吞作用活性至關重要[10]。TULP1是目前已確定的與EOSRD發病相關的基因[1-2]，與遺傳性視網膜疾病相關的TULP1突變至少有59種，包括 c.99+1G＞A和c.1204G＞T（p.Glu402X）或c.1376_1377del（p.I459RfsX12）、c.725_728del（p.P242QfsX16）復合雜合突變[11-12]，c.1381C＞G（p.Leu461Val）等雜合突變[13-14]以及c.1102G＞T（p.Gly368Trp）、c.1198C4T（p.Arg400Trp）、c.1145T＞C（p.Phe382Ser）等純合突變[11-12,15]。本研究發現的TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變目前尚未見報道。
CNGB1定位于16q21，由33個外顯子組成，編碼1251個氨基酸。CNGB1與CNGA1基因產物共同形成異四聚體桿狀光感受器環核苷酸門控通道，在桿狀細胞中，CNGB1位點編碼通道β亞基和兩個相關的富含谷氨酸的蛋白（GARP），即GARP1和GARP2[16]。有研究表明，視覺的第一步發生在光感受器的外部，光異構化的視紫紅質激活G蛋白轉導素，而G蛋白轉導素反過來抑制桿狀特異性cGMP磷酸二酯酶（PDE6），激活的PDE6迅速降低cGMP濃度，導致cGMP門控通道關閉，質膜通道和細胞超極化，光信號通過光感受器傳遞給視網膜并最終傳遞給視覺皮層[17]。在桿狀光感受器細胞中，GARP2具有調節PDE6的作用[18]，同時GARP2和β-亞基上的N端GARP延伸可以與桿狀外節圓盤邊緣的外周蛋白-2形成復合物，有助于穩定光感受器桿狀外節高度有序的結構[19]。與遺傳性視網膜疾病相關的CNGB1突變至少有26種，包括c.299A＞G（p.His100Arg）雜合突變[20-21]和c.3444+1G＞A純合突變[15]等。本研究發現的CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變目前尚未見報道。
本研究家系中3名成員攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）雜合突變和CNGB1基因一個雜合突變c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）或c.3488G＞A（p.Gly1163Glu），但其并無臨床表現；而先證者攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變，即出現癥狀。這提示該家系的遺傳方式為常染色體隱性遺傳。但究竟是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變直接致病，還是CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變致病，亦或是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變同時存在時才致病目前尚不能確定，需進一步更為深入地研究。
本研究的優勢在于發現了EOSRD的3個新的突變位點，擴大了已報道基因的突變譜，對更深入了解EOSRD的發病機制提供了一定幫助。但存在以下不足：（1）僅1個家系，因此研究的外推性欠佳；（2）僅對患者及其兄長、父母進行了檢測，未對其他家族成員進行研究，因此不能確認上述3個新的突變位點分別來源于整個家系的哪些家族成員。（3）僅從樣本中測序發現突變基因，尚缺少圍繞基因功能方面的實驗驗證。
早發性嚴重視網膜營養不良（EOSRD）是一種嚴重影響視功能的遺傳性視網膜疾病，目前部分學者認為其是Leber先天性黑矇（LCA）較輕的一種亞型[1-2]。大多EOSRD患者于1～5歲發病，其眼底及全視野視網膜電圖（ff-ERG）表現與LCA相似，但視功能相對LCA更好[1-2]。本病為常染色體隱性遺傳，偶見顯性遺傳。目前確定與LCA/ EOSRD相關的基因有25個，但這些基因僅能解釋70%～80% LCA和（或）EOSRD患者的發病原因[1-2]。我們采用目標區域捕獲測序方法對一個漢族EOSRD家系進行檢測，在Tubby樣蛋白（TULP）1基因、環核苷酸門控通道β1（CNGB1）基因發現3個新的變異位點。現將檢測結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審批[批文號：HNEECKY-2019（15號）]，嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則。所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。
2018年8月于河南省立眼科醫院檢查確診的一個漢族EOSRD家系（圖1）中1例患者及3名家系成員納入本研究。詳細詢問和記錄該家系家族史；患者及3名家系成員均行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、全景眼底彩色照相、頻域光相干斷層掃描（SD-OCT）及ff-ERG檢查。
圖1
早發性嚴重視網膜營養不良患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先證者
采集受試者外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。按照標準提取流程，采用康為試劑生物技術有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒提取4名受試者全基因組DNA；采用美國GE公司的NavoVue微型光度計對提取的DNA進行質量檢測，將符合要求的基因組DNA分裝后于?20 ℃保存待用。
提取得到的基因組DNA，采用北京中因科技有限公司自主開發設計的捕獲芯片，應用安捷倫公司的捕獲試劑盒，構建捕獲片段文庫。通過Illumina HiSeq高通量測序平臺測序，二代Panel的平均測序深度為500X，數據量為1G。測序結果比對人類參考基因組檢出并注釋變異，對變異采用Sanger測序進行驗證。其后根據多個數據庫信息和蛋白功能預測軟件結果，篩選可能的致病變異位點，變異的檢出、注釋和篩選的詳細方法同文獻[3]。所有基因序列參考美國國立生物技術信息中心（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因組數據庫網站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
通過NCBI數據庫對變異基因翻譯的氨基酸序列進行保守性分析。應用蛋白功能預測軟件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org/）和PROVEAN等進行基因變異致病性預測。應用I-TASSER軟件建立蛋白結構模型。參考美國遺傳學和基因組學學院（ACMG）標準和指南[4]，對所有變異位點進行致病等級評估。
2 結果
先證者（Ⅱ2），女，6歲。其父母訴患兒于1歲以后開始出現雙眼夜間視力差。患兒右眼BCVA +1.50/－3.25×180→0.1，左眼BCVA +1.25/－3.75×175→0.1。雙眼眼前節及玻璃體未見異常。雙眼視盤顏色稍淡，視網膜血管管徑稍變細，血管弓外視網膜可見廣泛色素改變（圖2）。雙眼眼球運動正常，未見明顯眼球震顫。眼位檢查33 cm映光外斜15°。SD-OCT檢查可見雙眼黃斑中心凹處外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶結構欠清、斷續；中心凹外可視區神經上皮外叢狀層、外核層、外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶逐漸消失，色素上皮層厚度欠均勻（圖3）。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統功能嚴重下降（圖4）。其他家系成員均無EOSRD典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳。
圖2
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者雙眼彩色眼底像。2A、2B分別示右眼、左眼。雙眼視盤顏色稍淡，視網膜血管管徑稍變細，血管弓外視網膜可見廣泛色素改變
圖3
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者頻域光相干斷層掃描像。左圖為掃描方向，右圖為檢查結果。3A、3B分別示右眼、左眼。雙眼黃斑中心凹處外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶結構欠清、斷續；中心凹外可視區神經上皮外叢狀層、外核層、外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶逐漸消失，色素上皮層厚度欠均勻
圖4
早發性嚴重視網膜營養不良家系中先證者全視野視網膜電圖（ERG）像。綠色波形為右眼；藍色波形為左眼。4A示暗適應0.01 ERG；4B示暗適應3.0 ERG；4C示暗適應10.0 ERG；4D示暗適應3.0震蕩電位；4E示明適應3.0 ERG；4F示明適應3.0閃爍光ERG。雙眼均未檢測到明顯波形
先證者檢測到TULP1基因的純合突變c.921C＞A（p.Cys307*）以及CNGB1基因的復合雜合突變c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。先證者父親（Ⅰ1）攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）；母親（Ⅰ2）、兄長（Ⅱ1）攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）和CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。3名家系成員的2個基因均為復合雜合突變（圖5）。
圖5
早發性嚴重視網膜營養不良家系基因測序圖。M1：Tubby樣蛋白1（TULP1） c.921C＞A（p.Cys307*）；M2：環核苷酸門控通道β1（CNGB1）c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）；M3：CNGB1 c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）。Ⅱ2：先證者；Ⅰ1：先證者父親；Ⅰ2：先證者母親；Ⅱ1：先證者兄長。先證者父親、母親、兄長攜帶TULP1基因c.921C＞A突變；父親攜帶CNGB1基因c.3121C＞T突變；母親、兄長攜帶CNGB1基因c.3488G＞A突變；先證者同時攜帶3個突變位點
與數據庫對比發現，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在ExAC等數據庫未見收錄；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）在ExAC、GnomAD中收錄的突變頻率均為0.000 01，千人基因組計劃數據庫中未見收錄；CNGB1基因c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在ExAC、GnomAD、千人基因組計劃數據庫中收錄的突變頻率分別為0.000 09、0.000 08和0.000 1。
氨基酸保守性分析發現，TULP1基因翻譯的氨基酸序列第307位半胱氨酸在人、黑猩猩、獼猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、雞、爪蟾中高度保守（圖6A），c.921C＞A（p.Cys307*）導致蛋白質翻譯在高度保守區終止并喪失功能。CNGB1基因翻譯的氨基酸序列第1041位精氨酸在人、黑猩猩、卷尾猴、寬吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守（圖6B），c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）導致堿性的精氨酸突變為非極性的色氨酸。CNGB1基因翻譯的氨基酸序列第1163位甘氨酸在人、大猩猩、烏干達紅疣猴、豚尾猴、獅尾狒、野駱駝、東非狒狒中高度保守（圖6C），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）導致中性的甘氨酸突變為酸性的谷氨酸。此3個位點的氨基酸對蛋白質結構和功能具有重要作用。
圖6
Tubby樣蛋白1（TULP1）基因、環核苷酸門控通道β1（CNGB1）基因在多個物種中的保守性分析圖。6A示 TULP1基因氨基酸序列第307位半胱氨酸，在人、黑猩猩、獼猴、犬、牛、小白鼠、褐鼠、雞、爪蟾中高度保守；6B示CNGB1基因氨基酸序列第1163位甘氨酸，在人、大猩猩、烏干達紅疣猴、豚尾猴、獅尾狒、野駱駝、東非狒狒中高度保守；6C示CNGB1基因氨基酸序列第1041位精氨酸，在人、黑猩猩、卷尾猴、寬吻海豚、牛、赤鹿、刺猬、北美鼠兔、吸血蝠中高度保守
生物信息學分析和致病性推斷，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）在蛋白質保守區出現翻譯終止，CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）在蛋白質保守區出現氨基酸極性變化，導致蛋白質空間結構產生較大改變（圖7）。3個突變位點經Mutation Taster分析預測均為致病突變。CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）SIFT分析預測值分別為0.000和0.087；Polyphen2分析預測值分別為1.000和0.784；PROVEAN分析預測值分別為?7.740和?3.080。根據ACMG標準和指南[3]評判：TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）突變為致病性突變；CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）為可能致病性突變。
圖7
環核苷酸門控通道β1（CNGB1）蛋白三維分子結構分析圖。7A示野生型位點；7B示突變型位點。c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）使CNGB1質序列第1041位堿性的精氨酸（p.R1041）突變為非極性的色氨酸（p.1041W），c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）使CNGB1蛋白質序列第1163位中性的甘氨酸（p.G1163）突變為酸性的谷氨酸（p.1163E），導致蛋白質空間結構產生較大改變
3 討論
本研究在一個常染色體隱性遺傳漢族EOSRD家系中發現了3個新的致病突變位點，TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）。雖然根據患者的病史、視力、眼底檢查及ff-ERG表現，EOSRD診斷并不困難，但將其與LCA鑒別卻不易。雖然EOSRD患者視力相對LCA較好，但由于EOSRD與LCA患者就診時視力已經明顯受損，難以通過視力、眼底及ff-ERG表現甚至基因檢測結果將其嚴格區分。目前認為EOSRD與LCA的唯一鑒別點是發病年齡[1-2]。一般認為患者發病年齡＜1歲為LCA，1～5歲為EOSRD[1-2]。本家系中先證者診斷為EOSRD，其主要原因是其父母明確表述患者為1歲后發病。
TULP1定位于6p21.31，由15個外顯子組成，編碼542個氨基酸，是TULP家族中的一員[5]。TULP蛋白以高度保守的c端Tubby結構域為特征，TULP1基因中的大多數致病突變聚集在TULP1的Tubby區域[6]。TULP1是一種光感受器特異性蛋白，參與了由內節合成的若干光轉導蛋白向外節的轉運；其定位于容納內質網、高爾基體和其他生物合成機制的細胞室，并被認為是作為一種伴侶蛋白或適配器蛋白，將裝載貨物的囊泡與運動蛋白連接起來進行運輸，這些蛋白的目的地是光感受器細胞的外節室[7-9]。有研究表明，在視網膜中，TULP1主要通過光感受器細胞表達，光感受器細胞通過突觸與內視網膜進行交流，TULP1在光感受器突觸前末端的活性區高度富集，與主要的內吞作用蛋白一起靠近突觸帶，TULP1基因對于保持內吞作用蛋白在活性區富集以及在突觸帶附近維持高水平的內吞作用活性至關重要[10]。TULP1是目前已確定的與EOSRD發病相關的基因[1-2]，與遺傳性視網膜疾病相關的TULP1突變至少有59種，包括 c.99+1G＞A和c.1204G＞T（p.Glu402X）或c.1376_1377del（p.I459RfsX12）、c.725_728del（p.P242QfsX16）復合雜合突變[11-12]，c.1381C＞G（p.Leu461Val）等雜合突變[13-14]以及c.1102G＞T（p.Gly368Trp）、c.1198C4T（p.Arg400Trp）、c.1145T＞C（p.Phe382Ser）等純合突變[11-12,15]。本研究發現的TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變目前尚未見報道。
CNGB1定位于16q21，由33個外顯子組成，編碼1251個氨基酸。CNGB1與CNGA1基因產物共同形成異四聚體桿狀光感受器環核苷酸門控通道，在桿狀細胞中，CNGB1位點編碼通道β亞基和兩個相關的富含谷氨酸的蛋白（GARP），即GARP1和GARP2[16]。有研究表明，視覺的第一步發生在光感受器的外部，光異構化的視紫紅質激活G蛋白轉導素，而G蛋白轉導素反過來抑制桿狀特異性cGMP磷酸二酯酶（PDE6），激活的PDE6迅速降低cGMP濃度，導致cGMP門控通道關閉，質膜通道和細胞超極化，光信號通過光感受器傳遞給視網膜并最終傳遞給視覺皮層[17]。在桿狀光感受器細胞中，GARP2具有調節PDE6的作用[18]，同時GARP2和β-亞基上的N端GARP延伸可以與桿狀外節圓盤邊緣的外周蛋白-2形成復合物，有助于穩定光感受器桿狀外節高度有序的結構[19]。與遺傳性視網膜疾病相關的CNGB1突變至少有26種，包括c.299A＞G（p.His100Arg）雜合突變[20-21]和c.3444+1G＞A純合突變[15]等。本研究發現的CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變目前尚未見報道。
本研究家系中3名成員攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）雜合突變和CNGB1基因一個雜合突變c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）或c.3488G＞A（p.Gly1163Glu），但其并無臨床表現；而先證者攜帶TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變、CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變，即出現癥狀。這提示該家系的遺傳方式為常染色體隱性遺傳。但究竟是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變直接致病，還是CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變致病，亦或是TULP1基因c.921C＞A（p.Cys307*）純合突變和CNGB1基因c.3121C＞T（p.Arg1041Trp）和c.3488G＞A（p.Gly1163Glu）復合雜合突變同時存在時才致病目前尚不能確定，需進一步更為深入地研究。
本研究的優勢在于發現了EOSRD的3個新的突變位點，擴大了已報道基因的突變譜，對更深入了解EOSRD的發病機制提供了一定幫助。但存在以下不足：（1）僅1個家系，因此研究的外推性欠佳；（2）僅對患者及其兄長、父母進行了檢測，未對其他家族成員進行研究，因此不能確認上述3個新的突變位點分別來源于整個家系的哪些家族成員。（3）僅從樣本中測序發現突變基因，尚缺少圍繞基因功能方面的實驗驗證。
