視網膜退行性病變是由于視網膜色素上皮細胞及光感受器細胞功能改變所致的致盲性眼病。干細胞移植、基因治療、視網膜假體植入等新生物學技術在視網膜退行性病變患者視覺功能恢復上已經取得巨大的進步，但目前仍然面臨許多困難。光遺傳學是一種將光學、生理學和遺傳學結合的交叉學科的新技術，可將光敏蛋白表達在視網膜退行性病變的視網膜神經元上，利用光刺激表達光敏蛋白的細胞，通過產生去極化或超極化反應，使其重獲感光能力。相較于干細胞移植治療的免疫排斥、基因治療的個體化差異及視網膜假體植入的創傷性大等局限，光遺傳學技術具有顯著優勢，同時也亟待解決時空分辨率低和光敏感性不足的問題。隨著光遺傳學技術的逐步發展，其必然和其他領域形成更深層次地交叉、融合，從而有助于視網膜退行性病變患者視覺功能的恢復。
引用本文： 陳飛, 沈吟. 光遺傳學技術治療視網膜退行性病變的應用進展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(6): 483-487. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200408-00150 復制
視網膜色素變性（RP）、老年性黃斑變性（AMD）和黃斑萎縮性疾病等視網膜退行性病變會導致視網膜色素上皮（RPE）細胞或光感受器細胞凋亡，最終導致患者完全失明。其中，青少年多發的RP表現為RPE細胞和光感受器細胞進行性退化，視桿細胞的凋亡早于視錐細胞，從而導致夜盲和視野縮小并進行性加重[1-2]；而中老年多發的AMD則表現為中心暗點或中心視力喪失[3]。盡管如此，視網膜退行性病變在病理過程中均表現出相似性，如殘余的視網膜各層結構相對完整，仍然具有處理視覺信號并向大腦中樞視覺區域傳導的功能[4]。光遺傳學技術正是利用這一特征，將光敏蛋白表達在這些細胞上并賦予其感光能力，或在此基礎上結合其他的技術和設備，從而有助于患者視覺功能的恢復。現就光遺傳學技術治療視網膜退行性病變的應用進展作一綜述。
1 使細胞去極化的微生物光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
使細胞去極化的微生物光敏蛋白ChR2源于真核生物萊茵綠藻，是最先應用于視覺恢復的光敏蛋白[5-6]。ChR2有較好的動力學特征，其撤光反應時間常數τoff約10 ms，需要較強的光照才能激活ChR2通道的開放[7]。人體視覺對光的感應波長在400～700 nm之間，光強在104～1016 photons/（cm2·s）的范圍內[8]。而最適合激活ChR2通道的光為470 nm波長，光強至少為1015 photons/（cm2·s）（相當于晴朗天氣正午時直射陽光）的藍光，超過了視網膜安全的光強閾值[9-10]。根據國際非電離輻射防護委員會的標準，470 nm波長的藍光光強在不超過7.62×1014 photons/（cm2·s）時才為安全光強[11]。很顯然，利用ChR2來恢復視覺功能不可避免地會造成視網膜光毒性反應。因此，發現更高光敏感性的光敏蛋白尤為重要。此后，Pan等[12]在ChR2的基礎上改造了很多可以增加光敏感性的突變體，如ChR2的T159C和L132C突變體具有更大的電流和更好的光敏感性。而兩個位點突變的ChR2突變體可以進一步增加光敏感性，如ChR2的L132C/T159C和L132C/T159S較ChR2可增加15～20倍的光敏感性。Ganjawala等[13]從綠單胞菌（chloromonas oogama）中發現的ChR變體CoChR光敏蛋白大大提高了光敏感性，其中CoChR-L112C和CoChR-H94E/L112C/K246T兩個突變體的τoff分別為372、723 ms，CoChR-H94E/L112C/K246T可以在480 nm波長、光強為2×1012 photons/（cm2·s）的環境下被激活。該突變體的發現具有重要意義，環境光強下能激活光敏蛋白無疑是將視網膜光毒性降到最低，并為光遺傳學在視覺恢復上的應用又往前推進一步。視網膜光化學損傷和激活光的波長有關，所以還可以通過改變激活光的波長來降低視網膜的光毒性反應。如ReaChR有效的激活波長可達600 nm，有效的激活光強為2.5×1013～2.5×1017 photons/（cm2·s）[11]；而590 nm波長的黃光對視網膜的安全光強是5.94×1017 photons/（cm2·s），這也將刺激光強有效地控制在安全范圍內[11]。除此之外，篩選出對Ca2+通透更高的光敏蛋白CatCh，使二價的Ca2+離子內流產生更大的對光反應電流從而增加光敏蛋白的光敏感性[14-15]，這是提高光敏蛋白光敏感性的又一策略。這些都將有效解決微生物光敏蛋白因光敏感性低而不能應用于視覺恢復的窘境。
2 使細胞超極化的微生物光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
有兩類微生物光敏蛋白在光刺激條件下可使細胞發生超極化反應，一類是光刺激后激活細胞由內向細胞外開放的質子泵，如來自蘇打鹽紅菌的Arch[8, 16]、花科小球腔菌的Mac[17]；第二類是光刺激后激活細胞由外向細胞內開放的氯離子泵，如來自鹽堿古菌的NpHR及其基因工程編輯改造的eNpHR[18]、來自嗜鹽菌的Jaws[19]等。以上兩類光敏蛋白均可在其敏感的光刺激條件下使細胞產生超極化反應。而在主要累及視桿細胞類型的視網膜退行性病變的病理過程中，視桿細胞會先凋亡，光感受器細胞外節消失，而視錐細胞胞體會存在很長一段時間。所以，利用光遺傳學技術特異性的在視錐細胞上表達使細胞超極化反應的光敏蛋白，可使視錐細胞接收光信號并產生超極化反應，從而向下游傳遞視覺信號。故該光遺傳學技術在治療視網膜退行性病變中期的RP和全色盲具有一定的治療時間窗。
eNpHR是最先用于恢復RP視覺功能研究的使細胞發生超極化反應的微生物光敏蛋白。有研究將其特異性表達在RP視錐細胞中，并應用Cnga3-/-、Rho-/-雙基因敲除的慢速視網膜退行性病變[20]和Pde6brd1快速視網膜退行性病變兩種模型中進行實驗[20-21]。在視網膜退行性病變的小鼠視網膜中，激活eNpHR的波長范圍在450～650 nm之間，最適刺激波長為550 nm，最小刺激光強約為1×1014 photons/（cm2·s）。在快速和慢速視網膜退行性病變的兩種小鼠的視錐細胞上表達eNpHR可以恢復部分ON型、OFF型、側抑制及方向選擇性反應，并且能恢復一些視覺指導的行為學反應[21]。為進一步探討eNpHR在人視網膜中的情況，有學者取24 h內亡者捐獻眼球的視網膜進行體外培養7 d，轉染載有eNpHR的慢病毒2 d后檢測發現，eNpHR在人視網膜中對光反應的響應波長同樣在450～650 nm之間，最適波長為550 nm，與動物模型上并無差異[21]。這證明了eNpHR在人體視網膜上應用的可行性。
Jaws是通過基因改造后的激活光波普紅移的光敏蛋白[19, 22]。其激活光的最佳波長為575～600 nm，最小光強在1×1015 photons/（cm2·s）左右。有研究發現，在恒河猴視網膜的視錐細胞上表達Jaws，在8×1016 photons/（cm2·s）的光強下穩定的電流響應頻率在2～30 Hz之間[22]。Jaws在不引起視網膜光毒性的前提下有良好的動力學性能，而且Jaws也可高效和特異性地表達在人誘導性多功能干細胞（hiPSCs）3D培養的視網膜類器官中的視錐細胞上[22-23]。所以，Jaws可以很好地應用在視錐細胞上，在一定的治療時間窗內恢復視覺功能。視錐細胞上Jaws介導的神經節細胞的放電頻率要明顯優于eNpHR、Halo57、ArchT和Mac[24]。應用eNpHR和Jaws最主要的是特異性表達在視錐細胞上，異位表達在ON型雙極細胞和ON型神經節細胞上可能會抑制視覺信號向下傳導[21]。
3 哺乳動物內源性光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
G蛋白偶聯受體（GPCRs）家族中的光敏蛋白是哺乳動物視網膜中光敏感性高的內源性光敏蛋白，它有效解決了微生物光敏蛋白光敏感性較低的問題，但動力學差，反應速度較慢，阻礙了其在光遺傳學技術在恢復視覺中的應用。視紫紅質是視桿細胞外節所含的感光色素，視黑素是視網膜感光神經節細胞（iPRGCs）的感光色素[25-27]。視黑素屬于GPCRs家族，它具有極強光敏感性，但動力學差，τoff通常在數秒到數十秒之間，這會影響視覺信號的時間和空間分辨率。視錐蛋白是哺乳動物視錐細胞外節的GPCRs蛋白，其中對中波長光敏感的光敏蛋白叫中等波長的視錐蛋白（MW-opsin）。MW-opsin對光非常敏感，可被有效激活的光強范圍廣。視桿細胞主要分布在視網膜周邊，對暗光敏感，故光敏感性較高，在光線不足的條件下對視覺起重要作用。而視錐細胞則分布在中央凹，視敏度高，光敏感性差，在強光環境下對視覺有重要作用。MW-opsin在動力學上要比視紫紅質快10倍左右[28]。MW-opsin可以恢復對恒定光信號、閃爍光信號的辨別，也可恢復對不同方向靜止和移動的線性光刺激模式的辨別。所以，MW-opsin的性能要明顯優于視紫紅質和視黑素。為了改善視黑素動力學不足的問題，van Wyk等[29]研究發現，通過整合視黑素和mGluR6，可形成Opto-mGluR6嵌合體。這個新型的光遺傳學工具既保留了視黑素的高敏感性，又彌補了其反應速度慢的不足。mGluR6和視黑素同屬于GPCRs家族，mGluR6受體是在ON型雙極細胞中介導光感受器細胞中的谷氨酸信號到TRPM1通道。所以mGluR6受體可以通過細胞內的G蛋白偶聯的第二信使放大谷氨酸信號，激活mGluR6受體可以關閉更多的TRPM1通道，從而提高信號傳遞的速度，彌補了哺乳動物光敏蛋白動力學方面的不足。
4 光遺傳學結合干細胞技術在視覺功能恢復中的應用
視網膜退行性病變干細胞移植治療最大的挑戰是移植的細胞無法分化出可以獲得感光能力的外節，并需依賴功能完整的RPE細胞[30-31]。一種不依賴RPE的干細胞治療方式應運而生，即將光刺激后可使細胞超極化的微生物光敏蛋白引入新生小鼠光感受器細胞的前體細胞，再將該細胞移植進入視網膜退行性病變的模型中。也可從hiPSCs誘導分化出視錐細胞，讓該視錐細胞表達Jaws，然后再移植入視網膜退行性病變的小鼠中[28]。
細胞替代治療給晚期的視網膜退行性病變治療帶來希望，但在光感受器細胞替代治療的移植細胞必須要形成有功能的外節。但是，在視網膜退行性病變的小鼠模型中，移植的光感受器細胞形成有功能的外節很難實現。但有研究發現，移植視網膜片可有助于光感受器細胞外節的形成和恢復光感[32-33]。盡管有令人鼓舞的實驗結果，但仍然有一個主要問題未解決，即光感受器細胞需要和RPE緊密聯系并不停地通過外節脫落和再生來維持其結構和功能。在視網膜退行性病變中，RPE也會受損，所以通過移植的光感受器細胞保持光敏感性的可能性很小。故將光敏蛋白表達在正在發育的視網膜和hiPSCs中，然后再移植到小鼠視網膜退行性病變模型中。因為利用光遺傳學技術改造過的光感受器細胞對光反應依賴表達的微生物光敏蛋白，不再依賴于有功能的光感受器細胞外節和RPE的支持。
新生的小鼠產生表達NpHR的光感受器前體細胞。在野生型小鼠出生的第2天就在眼里注射攜帶光敏蛋白NpHR序列、視紫紅質啟動子的腺相關病毒（AAV-Rho-NpHR-YFP）。在第4天時用磁活化細胞分選的方式收集視網膜光感受器前體細胞[34]，再通過視網膜下腔注射的方式將收集的光感受器前體細胞注射在Cpfl1/Rho-/-和C3H rd/rd（rd1）兩種小鼠模型中。在移植后的第4周，通過全細胞模式膜片鉗技術可以記錄到表達NpHR但缺乏有功能的光感受器細胞外節的移植細胞的對光反應電流，在580 nm波長、光強為1×1016 photons /（cm2·s）的黃光下可產生穩定的對光反應，響應頻率可達25 Hz。為進一步評估該方法在hiPSCs上的性能，選擇比NpHR更容易表達在人組織上的Jaws，3D分化hiPSCs，利用優化的分化系統產生視錐細胞多的視網膜類器官；然后將光刺激后使細胞超極化的氯離子通道光敏蛋白Jaws表達在視錐細胞上，也可以產生穩定的光反應[28]。
5 光遺傳學結合虛擬現實（VR）設備在視覺功能恢復中的應用
視覺假體是通過一個成像設備獲取現實場景的圖像，再通過一種合理的方式將圖像信息刺激傳遞給視覺系統，經過視覺系統處理后經視覺中樞呈現出圖像信息。將圖像信息傳遞給視覺系統的方式很多，比如視網膜前、視網膜下及脈絡膜下的刺激[35-37]。上述的信息交流方式都是基于外界給予的電刺激而來，目前尚很難實現高的分辨率和對比度。而利用光遺傳學技術改造過的視網膜就可以用光信號代替電信號來提高時間和空間的分辨率，光遺傳學技術結合頭戴VR設備就是基于這樣的設想。該設備應用了圖像采集、視覺處理、光刺激脈沖編碼和高光強LED光照顯示等一系列技術，并利用MATLAB整合了攝像機、視頻處理器（如Raspberry Pi）、高密度的μLED陣列、微型電腦、半導體芯片和虛擬現實眼鏡的微型控制器。將μLED矩陣結合虛擬現實/增強的頭戴式系統把視覺信號傳遞給表達了光敏蛋白的退行性病變的視網膜中以實現患者視覺功能的恢復[38-39]。
目前該設備已經實現8100個像素點的μLED陣列發光器，并使用了氮化鎵微型LED（GaN μLEDs）來克服傳統LCD和OLED光源光強不足的問題[38-40]。用32×32（1024）個μLED陣列像素點就可以滿足基本的面部識別功能，所以8100個像素點可以滿足時間、空間及對比度的需求。但呈現一個現實場景中的圖片信息給視覺系統并在視覺中樞反饋出來還很難，所以將圖像簡化成卡通圖像對視覺反饋可有效解決這一問題。有研究在ChR2基礎上進一步探索了這套設備的可行性，470 nm/2.6 eV的藍光激活ChR2足以引起視網膜光損傷。為滿足激活ChR2的光照強度，根據LED光源在視網膜應用中的最大平均輻射度在1000 s的周期內、每球面度不能超過0.1 mW/mm2計算輻射強度至少需要90 332 cd/m2。傳統的LED和OLED的亮度為100～1000 cd/m2，所以研發可增強光強的穿戴設備必不可少，而高密度的GaN μLEDs可以彌補光強不足問題[38]。這是利用ChR2來測試上述設備，今后可以將更多新型的光敏感性高、動力學好的光敏蛋白應用其中以取得更好視覺恢復效果，而且可以最大程度上避免光毒性損害。
6 展望
光遺傳學技術在恢復視網膜退行性病變視覺功能上的研究逐漸深入。隨著越來越多ChR2突變體的發現，新型的光敏蛋白突變體可有效提高光敏感性以降低對視網膜的光損害，又具有較快的動力學特征以滿足視覺信號的傳導。新的GPCRs也提高了動力學以滿足高敏度視覺所需要的時間分辨率。在新的ChR2和GPCRs的基礎上，選擇靶向性更好的特異性啟動子、選擇性和穿透性更好的腺病毒載體，且能在ON型雙極細胞或神經節細胞上特異性表達的光敏蛋白尤為重要。隨著干細胞和光遺傳學技術的發展，將干細胞賦予感光能力，來解決干細胞分化不能形成感光能力的光感受器細胞外節及無法依賴有功能RPE細胞的支持而導致不能形成感光能力的巨大難題。除此之外，視覺假體的發展也取得了巨大的進步，結合光遺傳學技術和VR技術，用光刺激替代了傳統的電刺激模式，實現了時間和空間的高分辨率控制，從而提升了光遺傳學的應用能力。隨著光遺傳學技術的逐步發展，其必然和其他領域形成更深層次的交叉、融合，從而有助于視網膜退行性病變患者視覺功能的恢復。
視網膜色素變性（RP）、老年性黃斑變性（AMD）和黃斑萎縮性疾病等視網膜退行性病變會導致視網膜色素上皮（RPE）細胞或光感受器細胞凋亡，最終導致患者完全失明。其中，青少年多發的RP表現為RPE細胞和光感受器細胞進行性退化，視桿細胞的凋亡早于視錐細胞，從而導致夜盲和視野縮小并進行性加重[1-2]；而中老年多發的AMD則表現為中心暗點或中心視力喪失[3]。盡管如此，視網膜退行性病變在病理過程中均表現出相似性，如殘余的視網膜各層結構相對完整，仍然具有處理視覺信號并向大腦中樞視覺區域傳導的功能[4]。光遺傳學技術正是利用這一特征，將光敏蛋白表達在這些細胞上并賦予其感光能力，或在此基礎上結合其他的技術和設備，從而有助于患者視覺功能的恢復。現就光遺傳學技術治療視網膜退行性病變的應用進展作一綜述。
1 使細胞去極化的微生物光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
使細胞去極化的微生物光敏蛋白ChR2源于真核生物萊茵綠藻，是最先應用于視覺恢復的光敏蛋白[5-6]。ChR2有較好的動力學特征，其撤光反應時間常數τoff約10 ms，需要較強的光照才能激活ChR2通道的開放[7]。人體視覺對光的感應波長在400～700 nm之間，光強在104～1016 photons/（cm2·s）的范圍內[8]。而最適合激活ChR2通道的光為470 nm波長，光強至少為1015 photons/（cm2·s）（相當于晴朗天氣正午時直射陽光）的藍光，超過了視網膜安全的光強閾值[9-10]。根據國際非電離輻射防護委員會的標準，470 nm波長的藍光光強在不超過7.62×1014 photons/（cm2·s）時才為安全光強[11]。很顯然，利用ChR2來恢復視覺功能不可避免地會造成視網膜光毒性反應。因此，發現更高光敏感性的光敏蛋白尤為重要。此后，Pan等[12]在ChR2的基礎上改造了很多可以增加光敏感性的突變體，如ChR2的T159C和L132C突變體具有更大的電流和更好的光敏感性。而兩個位點突變的ChR2突變體可以進一步增加光敏感性，如ChR2的L132C/T159C和L132C/T159S較ChR2可增加15～20倍的光敏感性。Ganjawala等[13]從綠單胞菌（chloromonas oogama）中發現的ChR變體CoChR光敏蛋白大大提高了光敏感性，其中CoChR-L112C和CoChR-H94E/L112C/K246T兩個突變體的τoff分別為372、723 ms，CoChR-H94E/L112C/K246T可以在480 nm波長、光強為2×1012 photons/（cm2·s）的環境下被激活。該突變體的發現具有重要意義，環境光強下能激活光敏蛋白無疑是將視網膜光毒性降到最低，并為光遺傳學在視覺恢復上的應用又往前推進一步。視網膜光化學損傷和激活光的波長有關，所以還可以通過改變激活光的波長來降低視網膜的光毒性反應。如ReaChR有效的激活波長可達600 nm，有效的激活光強為2.5×1013～2.5×1017 photons/（cm2·s）[11]；而590 nm波長的黃光對視網膜的安全光強是5.94×1017 photons/（cm2·s），這也將刺激光強有效地控制在安全范圍內[11]。除此之外，篩選出對Ca2+通透更高的光敏蛋白CatCh，使二價的Ca2+離子內流產生更大的對光反應電流從而增加光敏蛋白的光敏感性[14-15]，這是提高光敏蛋白光敏感性的又一策略。這些都將有效解決微生物光敏蛋白因光敏感性低而不能應用于視覺恢復的窘境。
2 使細胞超極化的微生物光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
有兩類微生物光敏蛋白在光刺激條件下可使細胞發生超極化反應，一類是光刺激后激活細胞由內向細胞外開放的質子泵，如來自蘇打鹽紅菌的Arch[8, 16]、花科小球腔菌的Mac[17]；第二類是光刺激后激活細胞由外向細胞內開放的氯離子泵，如來自鹽堿古菌的NpHR及其基因工程編輯改造的eNpHR[18]、來自嗜鹽菌的Jaws[19]等。以上兩類光敏蛋白均可在其敏感的光刺激條件下使細胞產生超極化反應。而在主要累及視桿細胞類型的視網膜退行性病變的病理過程中，視桿細胞會先凋亡，光感受器細胞外節消失，而視錐細胞胞體會存在很長一段時間。所以，利用光遺傳學技術特異性的在視錐細胞上表達使細胞超極化反應的光敏蛋白，可使視錐細胞接收光信號并產生超極化反應，從而向下游傳遞視覺信號。故該光遺傳學技術在治療視網膜退行性病變中期的RP和全色盲具有一定的治療時間窗。
eNpHR是最先用于恢復RP視覺功能研究的使細胞發生超極化反應的微生物光敏蛋白。有研究將其特異性表達在RP視錐細胞中，并應用Cnga3-/-、Rho-/-雙基因敲除的慢速視網膜退行性病變[20]和Pde6brd1快速視網膜退行性病變兩種模型中進行實驗[20-21]。在視網膜退行性病變的小鼠視網膜中，激活eNpHR的波長范圍在450～650 nm之間，最適刺激波長為550 nm，最小刺激光強約為1×1014 photons/（cm2·s）。在快速和慢速視網膜退行性病變的兩種小鼠的視錐細胞上表達eNpHR可以恢復部分ON型、OFF型、側抑制及方向選擇性反應，并且能恢復一些視覺指導的行為學反應[21]。為進一步探討eNpHR在人視網膜中的情況，有學者取24 h內亡者捐獻眼球的視網膜進行體外培養7 d，轉染載有eNpHR的慢病毒2 d后檢測發現，eNpHR在人視網膜中對光反應的響應波長同樣在450～650 nm之間，最適波長為550 nm，與動物模型上并無差異[21]。這證明了eNpHR在人體視網膜上應用的可行性。
Jaws是通過基因改造后的激活光波普紅移的光敏蛋白[19, 22]。其激活光的最佳波長為575～600 nm，最小光強在1×1015 photons/（cm2·s）左右。有研究發現，在恒河猴視網膜的視錐細胞上表達Jaws，在8×1016 photons/（cm2·s）的光強下穩定的電流響應頻率在2～30 Hz之間[22]。Jaws在不引起視網膜光毒性的前提下有良好的動力學性能，而且Jaws也可高效和特異性地表達在人誘導性多功能干細胞（hiPSCs）3D培養的視網膜類器官中的視錐細胞上[22-23]。所以，Jaws可以很好地應用在視錐細胞上，在一定的治療時間窗內恢復視覺功能。視錐細胞上Jaws介導的神經節細胞的放電頻率要明顯優于eNpHR、Halo57、ArchT和Mac[24]。應用eNpHR和Jaws最主要的是特異性表達在視錐細胞上，異位表達在ON型雙極細胞和ON型神經節細胞上可能會抑制視覺信號向下傳導[21]。
3 哺乳動物內源性光敏蛋白在視覺功能恢復中的應用
G蛋白偶聯受體（GPCRs）家族中的光敏蛋白是哺乳動物視網膜中光敏感性高的內源性光敏蛋白，它有效解決了微生物光敏蛋白光敏感性較低的問題，但動力學差，反應速度較慢，阻礙了其在光遺傳學技術在恢復視覺中的應用。視紫紅質是視桿細胞外節所含的感光色素，視黑素是視網膜感光神經節細胞（iPRGCs）的感光色素[25-27]。視黑素屬于GPCRs家族，它具有極強光敏感性，但動力學差，τoff通常在數秒到數十秒之間，這會影響視覺信號的時間和空間分辨率。視錐蛋白是哺乳動物視錐細胞外節的GPCRs蛋白，其中對中波長光敏感的光敏蛋白叫中等波長的視錐蛋白（MW-opsin）。MW-opsin對光非常敏感，可被有效激活的光強范圍廣。視桿細胞主要分布在視網膜周邊，對暗光敏感，故光敏感性較高，在光線不足的條件下對視覺起重要作用。而視錐細胞則分布在中央凹，視敏度高，光敏感性差，在強光環境下對視覺有重要作用。MW-opsin在動力學上要比視紫紅質快10倍左右[28]。MW-opsin可以恢復對恒定光信號、閃爍光信號的辨別，也可恢復對不同方向靜止和移動的線性光刺激模式的辨別。所以，MW-opsin的性能要明顯優于視紫紅質和視黑素。為了改善視黑素動力學不足的問題，van Wyk等[29]研究發現，通過整合視黑素和mGluR6，可形成Opto-mGluR6嵌合體。這個新型的光遺傳學工具既保留了視黑素的高敏感性，又彌補了其反應速度慢的不足。mGluR6和視黑素同屬于GPCRs家族，mGluR6受體是在ON型雙極細胞中介導光感受器細胞中的谷氨酸信號到TRPM1通道。所以mGluR6受體可以通過細胞內的G蛋白偶聯的第二信使放大谷氨酸信號，激活mGluR6受體可以關閉更多的TRPM1通道，從而提高信號傳遞的速度，彌補了哺乳動物光敏蛋白動力學方面的不足。
4 光遺傳學結合干細胞技術在視覺功能恢復中的應用
視網膜退行性病變干細胞移植治療最大的挑戰是移植的細胞無法分化出可以獲得感光能力的外節，并需依賴功能完整的RPE細胞[30-31]。一種不依賴RPE的干細胞治療方式應運而生，即將光刺激后可使細胞超極化的微生物光敏蛋白引入新生小鼠光感受器細胞的前體細胞，再將該細胞移植進入視網膜退行性病變的模型中。也可從hiPSCs誘導分化出視錐細胞，讓該視錐細胞表達Jaws，然后再移植入視網膜退行性病變的小鼠中[28]。
細胞替代治療給晚期的視網膜退行性病變治療帶來希望，但在光感受器細胞替代治療的移植細胞必須要形成有功能的外節。但是，在視網膜退行性病變的小鼠模型中，移植的光感受器細胞形成有功能的外節很難實現。但有研究發現，移植視網膜片可有助于光感受器細胞外節的形成和恢復光感[32-33]。盡管有令人鼓舞的實驗結果，但仍然有一個主要問題未解決，即光感受器細胞需要和RPE緊密聯系并不停地通過外節脫落和再生來維持其結構和功能。在視網膜退行性病變中，RPE也會受損，所以通過移植的光感受器細胞保持光敏感性的可能性很小。故將光敏蛋白表達在正在發育的視網膜和hiPSCs中，然后再移植到小鼠視網膜退行性病變模型中。因為利用光遺傳學技術改造過的光感受器細胞對光反應依賴表達的微生物光敏蛋白，不再依賴于有功能的光感受器細胞外節和RPE的支持。
新生的小鼠產生表達NpHR的光感受器前體細胞。在野生型小鼠出生的第2天就在眼里注射攜帶光敏蛋白NpHR序列、視紫紅質啟動子的腺相關病毒（AAV-Rho-NpHR-YFP）。在第4天時用磁活化細胞分選的方式收集視網膜光感受器前體細胞[34]，再通過視網膜下腔注射的方式將收集的光感受器前體細胞注射在Cpfl1/Rho-/-和C3H rd/rd（rd1）兩種小鼠模型中。在移植后的第4周，通過全細胞模式膜片鉗技術可以記錄到表達NpHR但缺乏有功能的光感受器細胞外節的移植細胞的對光反應電流，在580 nm波長、光強為1×1016 photons /（cm2·s）的黃光下可產生穩定的對光反應，響應頻率可達25 Hz。為進一步評估該方法在hiPSCs上的性能，選擇比NpHR更容易表達在人組織上的Jaws，3D分化hiPSCs，利用優化的分化系統產生視錐細胞多的視網膜類器官；然后將光刺激后使細胞超極化的氯離子通道光敏蛋白Jaws表達在視錐細胞上，也可以產生穩定的光反應[28]。
5 光遺傳學結合虛擬現實（VR）設備在視覺功能恢復中的應用
視覺假體是通過一個成像設備獲取現實場景的圖像，再通過一種合理的方式將圖像信息刺激傳遞給視覺系統，經過視覺系統處理后經視覺中樞呈現出圖像信息。將圖像信息傳遞給視覺系統的方式很多，比如視網膜前、視網膜下及脈絡膜下的刺激[35-37]。上述的信息交流方式都是基于外界給予的電刺激而來，目前尚很難實現高的分辨率和對比度。而利用光遺傳學技術改造過的視網膜就可以用光信號代替電信號來提高時間和空間的分辨率，光遺傳學技術結合頭戴VR設備就是基于這樣的設想。該設備應用了圖像采集、視覺處理、光刺激脈沖編碼和高光強LED光照顯示等一系列技術，并利用MATLAB整合了攝像機、視頻處理器（如Raspberry Pi）、高密度的μLED陣列、微型電腦、半導體芯片和虛擬現實眼鏡的微型控制器。將μLED矩陣結合虛擬現實/增強的頭戴式系統把視覺信號傳遞給表達了光敏蛋白的退行性病變的視網膜中以實現患者視覺功能的恢復[38-39]。
目前該設備已經實現8100個像素點的μLED陣列發光器，并使用了氮化鎵微型LED（GaN μLEDs）來克服傳統LCD和OLED光源光強不足的問題[38-40]。用32×32（1024）個μLED陣列像素點就可以滿足基本的面部識別功能，所以8100個像素點可以滿足時間、空間及對比度的需求。但呈現一個現實場景中的圖片信息給視覺系統并在視覺中樞反饋出來還很難，所以將圖像簡化成卡通圖像對視覺反饋可有效解決這一問題。有研究在ChR2基礎上進一步探索了這套設備的可行性，470 nm/2.6 eV的藍光激活ChR2足以引起視網膜光損傷。為滿足激活ChR2的光照強度，根據LED光源在視網膜應用中的最大平均輻射度在1000 s的周期內、每球面度不能超過0.1 mW/mm2計算輻射強度至少需要90 332 cd/m2。傳統的LED和OLED的亮度為100～1000 cd/m2，所以研發可增強光強的穿戴設備必不可少，而高密度的GaN μLEDs可以彌補光強不足問題[38]。這是利用ChR2來測試上述設備，今后可以將更多新型的光敏感性高、動力學好的光敏蛋白應用其中以取得更好視覺恢復效果，而且可以最大程度上避免光毒性損害。
6 展望
光遺傳學技術在恢復視網膜退行性病變視覺功能上的研究逐漸深入。隨著越來越多ChR2突變體的發現，新型的光敏蛋白突變體可有效提高光敏感性以降低對視網膜的光損害，又具有較快的動力學特征以滿足視覺信號的傳導。新的GPCRs也提高了動力學以滿足高敏度視覺所需要的時間分辨率。在新的ChR2和GPCRs的基礎上，選擇靶向性更好的特異性啟動子、選擇性和穿透性更好的腺病毒載體，且能在ON型雙極細胞或神經節細胞上特異性表達的光敏蛋白尤為重要。隨著干細胞和光遺傳學技術的發展，將干細胞賦予感光能力，來解決干細胞分化不能形成感光能力的光感受器細胞外節及無法依賴有功能RPE細胞的支持而導致不能形成感光能力的巨大難題。除此之外，視覺假體的發展也取得了巨大的進步，結合光遺傳學技術和VR技術，用光刺激替代了傳統的電刺激模式，實現了時間和空間的高分辨率控制，從而提升了光遺傳學的應用能力。隨著光遺傳學技術的逐步發展，其必然和其他領域形成更深層次的交叉、融合，從而有助于視網膜退行性病變患者視覺功能的恢復。