老年性黃斑變性（AMD）是一種受環境因素和遺傳變異影響的多因素疾病，是老年人不可逆轉性視力喪失的主要原因。miRNA是一類內源性表達的非編碼RNA，通過抑制或沉默轉錄基因的表達在氧化應激、病理性新生血管生成、炎癥反應等AMD的發病機制中發揮重要作用。miRNA在易合成性、靶向性、具有相加效應等方面有獨特優點，已有大量實驗證明了miRNA在AMD中的治療潛力，其有望成為未來治療AMD的新方法。由于AMD的發病機制尚未完全闡明，今后仍需繼續深入研究AMD的發病機制、各種miRNA在AMD發生發展過程中的生物學作用及機制，并觀察其在AMD的治療效果，進而為AMD的精確防治提供更多有效的選擇。
引用本文： 高境繁, 張璐. miRNA在老年性黃斑變性發病機制中的作用研究進展. 中華眼底病雜志, 2021, 37(6): 488-491. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20200312-00109 復制
老年性黃斑變性（AMD）是一種由于黃斑功能喪失引起的進行性退行性疾病，是老年人不可逆轉性視力喪失的主要原因。盡管AMD的發病機制尚未完全明確，但已有大量文獻表明其與氧化應激、病理性血管生成和炎癥反應相關[1]。miRNA是一種單鏈、內源性、非編碼的小RNA分子，通常由18～22個核苷酸組成，其能夠在轉錄后水平改變目標基因的表達。miRNA通過觸發RNA干擾途徑發揮表觀遺傳修飾物的作用，特別是通過干預信使RNA（mRNA）[2]。已有很多研究表明，多個miRNA可通過與靶基因的3個非翻譯區（3′-UTR）結合，通過誘導靶基因的降解或翻譯抑制繼而參與AMD發生和發展的過程。現就miRNA在AMD發病機制中的作用研究進展作一綜述。
1 miRNA影響視網膜色素上皮（RPE）細胞的氧化應激過程
氧化應激是指當機體遭受有害刺激時，產生過多的高分子活性物質，如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基，致使體內的氧化與抗氧化作用失衡。氧化應激可誘導RPE細胞功能障礙，進一步導致光感受器喪失，這被認為是AMD早期的病理原因之一。RPE細胞是位于視網膜外層的單層色素細胞，是構成血視網膜屏障的一部分，可分泌多種生長因子，維持光感受器細胞的再生和修復。由于其自身因素視網膜可成為產生ROS的一種理想場所：視網膜耗氧量高、基礎代謝旺盛；視網膜長期處于光損傷的狀態；RPE層及神經感覺層均含有豐富的光敏劑，對氧化損傷易感；RPE細胞由于自身的吞噬功能可產生較多ROS；光感受器細胞外節盤膜含有豐富的多不飽和脂肪酸，容易發生氧化反應，并且可啟動細胞介導的毒性反應[3]。
在AMD患者的RPE中，miR-184表達下調。Murad等[4]通過蛋白質組學分析證實，Ezrin（EZR）基因是miR-184的靶基因，EZR是一種膜細胞骨架交聯劑，在吞噬空泡形成過程中與溶酶體相關膜蛋白1（LAMP-1）結合，抑制miR-184可導致EZR mRNA和蛋白表達上調，并誘導LAMP-1表達下調。該實驗表明，在視網膜衰老過程中，miR-184表達下調可能會導致RPE細胞功能失調，進一步導致視網膜變性。miR-184的表達不足與萎縮型AMD的發生相關，其通過阻斷絲/蘇氨酸蛋白激酶2/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路繼而促進RPE細胞的分化，可同時抑制細胞的增生和遷移[5]。腫瘤壞死因子超家族成員6（Fas）是一種參與ROS介導細胞死亡的凋亡因子，miR-23a和miR-374a均可與Fas的3′-UTR結合，通過下調Fas保護RPE細胞免受氧化應激的損傷[6-7]。然而Li等[8]發現，H2O2誘導miR-23a表達上調，通過抑制谷氨酰胺攝取和谷氨酰胺酶表達，促進RPE細胞的凋亡。
H2O2通過下調細胞增生及細胞遷移能力繼而誘導細胞凋亡，當不同濃度的H2O2與ARPE-19細胞結合時，與對照組相比，隨著H2O2濃度的上升，miR-200C-3p、miR-525-3p、miR-518d-3p的表達顯著上調，miR-27b-5p、miR-96-5p、miR-33a-5p、miR-345-5p的表達顯著下調[9]。miR-30b可通過與過氧化氫酶的3′-UTR結合并抑制其表達，且miR-30b拮抗物顯著保護RPE細胞免受H2O2介導的細胞凋亡[10]。miR-17-3p的表達在AMD患者的RPE細胞中升高，其通過下調錳超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白還原酶2增加對氧化應激的易感性，此作用可被miR-17-3P抑制劑所消除[11]。核因子E2相關因子是一種參與氧化還原反應的轉錄因子，其可以與靶基因啟動子區域的抗氧化反應元件結合。而miR-144-5p和miR-144-3p通過與核因子E2相關因子的3′-UTR結合，下調下游抗氧化靶基因的表達和谷胱甘肽的水平，繼而促進RPE細胞凋亡[12]。
在H2O2誘導的心肌細胞氧化應激過程中，miR-210的表達上調，并通過抑制鐵硫簇組裝蛋白進而促進能量代謝的轉變，miR-210也可通過影響鐵硫簇組裝蛋白間接調節沉默信息調節因子3[13]。1-甲基-4-苯基吡啶是一種神經毒素，在其誘導的氧化還原反應中，miR-200a和miR-204上調可導致沉默信息調節因子1等抗氧化基因的下調以及氧化應激反應的加劇[14]。這些miRNA在RPE細胞氧化應激中是否發揮相似作用有待進一步的研究。
2 miRNA參與病理性新生血管的生成
在AMD的進展過程中，通常會伴有脈絡膜微循環的障礙，隨著患者年齡的增長，脈絡膜微血管管腔變細、血流密度降低，導致脈絡膜血流量減少，這種低灌注狀態可引起組織的缺血、缺氧，繼而刺激血管內皮生長因子（VEGF）分泌增加。VEGF是一種高度特異性的調控因子，與新生血管的生成和血管通透性的調節密切相關。滲出型AMD是急性中心視力喪失的主要原因，其特征是脈絡膜新生血管（CNV）的形成，其涉及血管從脈絡膜進入視網膜的異常生長過程。
miR-24通過同時調節肌動蛋白細胞骨架通路中的多個成分來抑制CNV的生成，Rho信號下游的多個基因包括p21蛋白激活激酶4、LIM激酶2和哺乳動物透明基因相關蛋白1，均為miR-24的直接作用靶點。miR-24的過表達或其靶基因的敲除都會導致肌動蛋白纖維的形成受阻，繼而抑制新生血管的生成[15]。miR-21通過靶向PTEN基因，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/VEGF信號通路，從而促進視網膜新生血管的生成[16]。miR-150在小鼠巨噬細胞和AMD患者的外周血單個核細胞中都高度上調，由于其獨特的巨噬細胞性作用，通過靶向硬脂酰輔酶A去飽和酶2，以一種不依賴于VEGF的方式促進病理性新生血管的生成[17]。
在CNV模型小鼠中，miR-126明顯下調，CNV可上調VEGF-A、激酶插入區受體和EVH1結構域蛋白1的mRNA和蛋白水平，而miR-126的恢復可改善這些變化，其已被證明是眼血管生成的負性調控因子[18]。p120鳥苷酸激活蛋白（RasGAP）是一種內源性Ras抑制劑，主要表達在對VEGF不敏感的內皮細胞中，并在多個新生血管中下調，miR-132通過負性調控p120RasGAP表達，在促進新生血管生成中發揮重要作用[19]。miR-17家族包括miR-17-5p、miR-20a、miR-20b、miR-106a、miR-106b和miR-93，在視網膜新生血管的早期VEGF-A表達顯著增加，在這個階段所有miR-17家族成員的表達均同時減少；基因報告分析表明，這些miRNA通過與缺氧誘導因子-1α和VEGF-A的3′-UTR結合發揮調控作用[20]。
目前已發現有多種miRNA在血管內皮細胞中高度表達，包括miR-210、miR-221、miR-222、miR-17-92簇和miR-23-27-24簇[21]。有學者通過檢測滲出型AMD患者的血液樣本發現，與對照組相比，滲出型AMD患者血液中miR-486-5p和miR-626表達上調，miR-34-5p、miR-145-5p、miR-885-5p和miR-205-5p的表達均下調[22-23]。Walz等[24]在探討VEGF介導的血管生成對人視網膜微血管內皮細胞影響的實驗中發現，與靜息狀態相比，miR-139-5p和miR-139-3p的表達均顯著升高；miR-29b-3p、miR-192-5p、miR-194-5p和miR-335-5p的表達水平均降低。該結果提示這些miRNA可能在AMD的發病機制中起一定作用，需要進一步的研究來探索這些miRNA作為生物標記物的作用。
3 miRNA調節視網膜炎癥反應
AMD的早期表現之一是形成玻璃膜疣。玻璃膜疣是一種膠樣小體，是RPE異常代謝產物在視網膜上的異常沉積。已知玻璃膜疣含有許多潛在的破壞性成分，包括脂質、脂蛋白、補體、淀粉樣蛋白等因子，繼而在免疫炎癥反應中發揮重要作用。玻璃膜疣對細胞聚集有一定的趨化作用，因此在AMD患者的玻璃膜疣周圍可見大量巨噬細胞聚集。機體補體系統由一組非特異性免疫球蛋白組成，其通過引發一系列炎癥反應清除細胞和組織中的碎片，包括補體因子H（CFH）及衰變加速因子CD46、CD59等補體調節蛋白的改變均在玻璃膜疣的形成和AMD進展中發揮作用。
幾丁質酶3樣蛋白1（CHI3L1）是一種炎癥標記物。Lian等[25]發現，在大鼠視網膜中，CHI3L1通過激活蛋白激酶B/mTOR和細胞外調節蛋白激酶通路，進而導致細胞自噬和RPE功能障礙，miR-24可通過下調CHI3L1保護視網膜免受損害。miR-124可直接靶向趨化因子配體2，減少視網膜炎癥和光感受器細胞的死亡，改善機體視網膜的功能[26]。miR-21-3p通過靶向RPE細胞中的G蛋白信號調節因子4，繼而抑制脂多糖誘導的炎癥和細胞凋亡[27]。miR-27a-5p通過靶向單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1（MCPIP1）的3′-UTR區域，上調MCPIP1的表達，從而抑制在巨噬細胞中脂多糖誘導的炎癥反應[28]。
3種參與核轉錄因子-kB途徑調控的miRNA，miR-125b-5p、miR-146a-5p和miR-155-5p通過與CFH mRNA的3′-UTR特異性靶向結合，繼而下調CFH的表達[29]。淀粉樣β肽（Aβ）是構成玻璃膜疣的主要成分之一，髓樣細胞觸發受體2（TREM2）可通過加強小膠質細胞吞噬功能來參與Aβ的清除，miR-34a通過靶向TREM2 mRNA的3′-UTR區域，下調TREM2的表達[30]。Huang等[31]研究發現，在Aβ誘導的小鼠視網膜變性的實驗中，通過檢測miRNA的表達，其中有38個miRNA上調，23個miRNA下調，這可為后續的研究提供一定的思路。
4 miRNA作為治療AMD的藥物方法
miRNA作為一種可精確靶向的小分子RNA，已有許多實驗提示其可作為一種治療AMD的方案，如miR-30b拮抗物可顯著保護RPE細胞免受H2O2介導的細胞凋亡[10]。miR-126作為一種負性調控因子抑制眼血管的生成[18]。miRNA調節劑主要包括miRNA拮抗劑和miRNA模擬物，主要原理是通過輸送拮抗劑來控制內源性miRNA水平或通過模擬物改變靶基因的表達。miRNA應用于治療主要有以下幾個優點：（1）miRNA的調節序列容易合成；（2）由于單個miRNA可以與多個mRNA的3′-UTR區域結合，繼而單個miRNA可以同時調節單個或多個途徑；（3）miRNA的尺寸很小，同一載體中可含有多個miRNA，以相同的mRNA為目標，進一步進行靶基因的降解或翻譯抑制，并具有相加效應[32]。已有實驗開展了腺相關病毒載體同時表達抗VEGF-A miRNA和分泌型抗血管生成蛋白色素上皮衍生因子雙重作用的療法，結果表明與對照組相比，在接受雙效治療的動物中CNV的減少最為顯著，且CNV的減少都伴隨著VEGF-A的顯著衰減。這提示miRNA治療是未來眼部基因治療的重要工具[33]。
老年性黃斑變性（AMD）是一種由于黃斑功能喪失引起的進行性退行性疾病，是老年人不可逆轉性視力喪失的主要原因。盡管AMD的發病機制尚未完全明確，但已有大量文獻表明其與氧化應激、病理性血管生成和炎癥反應相關[1]。miRNA是一種單鏈、內源性、非編碼的小RNA分子，通常由18～22個核苷酸組成，其能夠在轉錄后水平改變目標基因的表達。miRNA通過觸發RNA干擾途徑發揮表觀遺傳修飾物的作用，特別是通過干預信使RNA（mRNA）[2]。已有很多研究表明，多個miRNA可通過與靶基因的3個非翻譯區（3′-UTR）結合，通過誘導靶基因的降解或翻譯抑制繼而參與AMD發生和發展的過程。現就miRNA在AMD發病機制中的作用研究進展作一綜述。
1 miRNA影響視網膜色素上皮（RPE）細胞的氧化應激過程
氧化應激是指當機體遭受有害刺激時，產生過多的高分子活性物質，如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基，致使體內的氧化與抗氧化作用失衡。氧化應激可誘導RPE細胞功能障礙，進一步導致光感受器喪失，這被認為是AMD早期的病理原因之一。RPE細胞是位于視網膜外層的單層色素細胞，是構成血視網膜屏障的一部分，可分泌多種生長因子，維持光感受器細胞的再生和修復。由于其自身因素視網膜可成為產生ROS的一種理想場所：視網膜耗氧量高、基礎代謝旺盛；視網膜長期處于光損傷的狀態；RPE層及神經感覺層均含有豐富的光敏劑，對氧化損傷易感；RPE細胞由于自身的吞噬功能可產生較多ROS；光感受器細胞外節盤膜含有豐富的多不飽和脂肪酸，容易發生氧化反應，并且可啟動細胞介導的毒性反應[3]。
在AMD患者的RPE中，miR-184表達下調。Murad等[4]通過蛋白質組學分析證實，Ezrin（EZR）基因是miR-184的靶基因，EZR是一種膜細胞骨架交聯劑，在吞噬空泡形成過程中與溶酶體相關膜蛋白1（LAMP-1）結合，抑制miR-184可導致EZR mRNA和蛋白表達上調，并誘導LAMP-1表達下調。該實驗表明，在視網膜衰老過程中，miR-184表達下調可能會導致RPE細胞功能失調，進一步導致視網膜變性。miR-184的表達不足與萎縮型AMD的發生相關，其通過阻斷絲/蘇氨酸蛋白激酶2/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路繼而促進RPE細胞的分化，可同時抑制細胞的增生和遷移[5]。腫瘤壞死因子超家族成員6（Fas）是一種參與ROS介導細胞死亡的凋亡因子，miR-23a和miR-374a均可與Fas的3′-UTR結合，通過下調Fas保護RPE細胞免受氧化應激的損傷[6-7]。然而Li等[8]發現，H2O2誘導miR-23a表達上調，通過抑制谷氨酰胺攝取和谷氨酰胺酶表達，促進RPE細胞的凋亡。
H2O2通過下調細胞增生及細胞遷移能力繼而誘導細胞凋亡，當不同濃度的H2O2與ARPE-19細胞結合時，與對照組相比，隨著H2O2濃度的上升，miR-200C-3p、miR-525-3p、miR-518d-3p的表達顯著上調，miR-27b-5p、miR-96-5p、miR-33a-5p、miR-345-5p的表達顯著下調[9]。miR-30b可通過與過氧化氫酶的3′-UTR結合并抑制其表達，且miR-30b拮抗物顯著保護RPE細胞免受H2O2介導的細胞凋亡[10]。miR-17-3p的表達在AMD患者的RPE細胞中升高，其通過下調錳超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白還原酶2增加對氧化應激的易感性，此作用可被miR-17-3P抑制劑所消除[11]。核因子E2相關因子是一種參與氧化還原反應的轉錄因子，其可以與靶基因啟動子區域的抗氧化反應元件結合。而miR-144-5p和miR-144-3p通過與核因子E2相關因子的3′-UTR結合，下調下游抗氧化靶基因的表達和谷胱甘肽的水平，繼而促進RPE細胞凋亡[12]。
在H2O2誘導的心肌細胞氧化應激過程中，miR-210的表達上調，并通過抑制鐵硫簇組裝蛋白進而促進能量代謝的轉變，miR-210也可通過影響鐵硫簇組裝蛋白間接調節沉默信息調節因子3[13]。1-甲基-4-苯基吡啶是一種神經毒素，在其誘導的氧化還原反應中，miR-200a和miR-204上調可導致沉默信息調節因子1等抗氧化基因的下調以及氧化應激反應的加劇[14]。這些miRNA在RPE細胞氧化應激中是否發揮相似作用有待進一步的研究。
2 miRNA參與病理性新生血管的生成
在AMD的進展過程中，通常會伴有脈絡膜微循環的障礙，隨著患者年齡的增長，脈絡膜微血管管腔變細、血流密度降低，導致脈絡膜血流量減少，這種低灌注狀態可引起組織的缺血、缺氧，繼而刺激血管內皮生長因子（VEGF）分泌增加。VEGF是一種高度特異性的調控因子，與新生血管的生成和血管通透性的調節密切相關。滲出型AMD是急性中心視力喪失的主要原因，其特征是脈絡膜新生血管（CNV）的形成，其涉及血管從脈絡膜進入視網膜的異常生長過程。
miR-24通過同時調節肌動蛋白細胞骨架通路中的多個成分來抑制CNV的生成，Rho信號下游的多個基因包括p21蛋白激活激酶4、LIM激酶2和哺乳動物透明基因相關蛋白1，均為miR-24的直接作用靶點。miR-24的過表達或其靶基因的敲除都會導致肌動蛋白纖維的形成受阻，繼而抑制新生血管的生成[15]。miR-21通過靶向PTEN基因，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/VEGF信號通路，從而促進視網膜新生血管的生成[16]。miR-150在小鼠巨噬細胞和AMD患者的外周血單個核細胞中都高度上調，由于其獨特的巨噬細胞性作用，通過靶向硬脂酰輔酶A去飽和酶2，以一種不依賴于VEGF的方式促進病理性新生血管的生成[17]。
在CNV模型小鼠中，miR-126明顯下調，CNV可上調VEGF-A、激酶插入區受體和EVH1結構域蛋白1的mRNA和蛋白水平，而miR-126的恢復可改善這些變化，其已被證明是眼血管生成的負性調控因子[18]。p120鳥苷酸激活蛋白（RasGAP）是一種內源性Ras抑制劑，主要表達在對VEGF不敏感的內皮細胞中，并在多個新生血管中下調，miR-132通過負性調控p120RasGAP表達，在促進新生血管生成中發揮重要作用[19]。miR-17家族包括miR-17-5p、miR-20a、miR-20b、miR-106a、miR-106b和miR-93，在視網膜新生血管的早期VEGF-A表達顯著增加，在這個階段所有miR-17家族成員的表達均同時減少；基因報告分析表明，這些miRNA通過與缺氧誘導因子-1α和VEGF-A的3′-UTR結合發揮調控作用[20]。
目前已發現有多種miRNA在血管內皮細胞中高度表達，包括miR-210、miR-221、miR-222、miR-17-92簇和miR-23-27-24簇[21]。有學者通過檢測滲出型AMD患者的血液樣本發現，與對照組相比，滲出型AMD患者血液中miR-486-5p和miR-626表達上調，miR-34-5p、miR-145-5p、miR-885-5p和miR-205-5p的表達均下調[22-23]。Walz等[24]在探討VEGF介導的血管生成對人視網膜微血管內皮細胞影響的實驗中發現，與靜息狀態相比，miR-139-5p和miR-139-3p的表達均顯著升高；miR-29b-3p、miR-192-5p、miR-194-5p和miR-335-5p的表達水平均降低。該結果提示這些miRNA可能在AMD的發病機制中起一定作用，需要進一步的研究來探索這些miRNA作為生物標記物的作用。
3 miRNA調節視網膜炎癥反應
AMD的早期表現之一是形成玻璃膜疣。玻璃膜疣是一種膠樣小體，是RPE異常代謝產物在視網膜上的異常沉積。已知玻璃膜疣含有許多潛在的破壞性成分，包括脂質、脂蛋白、補體、淀粉樣蛋白等因子，繼而在免疫炎癥反應中發揮重要作用。玻璃膜疣對細胞聚集有一定的趨化作用，因此在AMD患者的玻璃膜疣周圍可見大量巨噬細胞聚集。機體補體系統由一組非特異性免疫球蛋白組成，其通過引發一系列炎癥反應清除細胞和組織中的碎片，包括補體因子H（CFH）及衰變加速因子CD46、CD59等補體調節蛋白的改變均在玻璃膜疣的形成和AMD進展中發揮作用。
幾丁質酶3樣蛋白1（CHI3L1）是一種炎癥標記物。Lian等[25]發現，在大鼠視網膜中，CHI3L1通過激活蛋白激酶B/mTOR和細胞外調節蛋白激酶通路，進而導致細胞自噬和RPE功能障礙，miR-24可通過下調CHI3L1保護視網膜免受損害。miR-124可直接靶向趨化因子配體2，減少視網膜炎癥和光感受器細胞的死亡，改善機體視網膜的功能[26]。miR-21-3p通過靶向RPE細胞中的G蛋白信號調節因子4，繼而抑制脂多糖誘導的炎癥和細胞凋亡[27]。miR-27a-5p通過靶向單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1（MCPIP1）的3′-UTR區域，上調MCPIP1的表達，從而抑制在巨噬細胞中脂多糖誘導的炎癥反應[28]。
3種參與核轉錄因子-kB途徑調控的miRNA，miR-125b-5p、miR-146a-5p和miR-155-5p通過與CFH mRNA的3′-UTR特異性靶向結合，繼而下調CFH的表達[29]。淀粉樣β肽（Aβ）是構成玻璃膜疣的主要成分之一，髓樣細胞觸發受體2（TREM2）可通過加強小膠質細胞吞噬功能來參與Aβ的清除，miR-34a通過靶向TREM2 mRNA的3′-UTR區域，下調TREM2的表達[30]。Huang等[31]研究發現，在Aβ誘導的小鼠視網膜變性的實驗中，通過檢測miRNA的表達，其中有38個miRNA上調，23個miRNA下調，這可為后續的研究提供一定的思路。
4 miRNA作為治療AMD的藥物方法
miRNA作為一種可精確靶向的小分子RNA，已有許多實驗提示其可作為一種治療AMD的方案，如miR-30b拮抗物可顯著保護RPE細胞免受H2O2介導的細胞凋亡[10]。miR-126作為一種負性調控因子抑制眼血管的生成[18]。miRNA調節劑主要包括miRNA拮抗劑和miRNA模擬物，主要原理是通過輸送拮抗劑來控制內源性miRNA水平或通過模擬物改變靶基因的表達。miRNA應用于治療主要有以下幾個優點：（1）miRNA的調節序列容易合成；（2）由于單個miRNA可以與多個mRNA的3′-UTR區域結合，繼而單個miRNA可以同時調節單個或多個途徑；（3）miRNA的尺寸很小，同一載體中可含有多個miRNA，以相同的mRNA為目標，進一步進行靶基因的降解或翻譯抑制，并具有相加效應[32]。已有實驗開展了腺相關病毒載體同時表達抗VEGF-A miRNA和分泌型抗血管生成蛋白色素上皮衍生因子雙重作用的療法，結果表明與對照組相比，在接受雙效治療的動物中CNV的減少最為顯著，且CNV的減少都伴隨著VEGF-A的顯著衰減。這提示miRNA治療是未來眼部基因治療的重要工具[33]。