引用本文： 朱曼輝, 涂園園, 王珍珍, 都景霞, 郭洋, 徐交文, 宋鄂. 蛭草茶合劑對糖尿病小鼠視網膜Müller細胞的保護作用及炎癥因子表達的影響. 中華眼底病雜志, 2020, 36(4): 302-307. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20191203-00397 復制
糖尿病視網膜病變（DR）確切機制尚不清楚，但應激性視網膜細胞產生的VEGF、TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子在視網膜神經血管損傷中發揮其關鍵作用[1-2]。糖尿病早期，Müller細胞即被激活并分泌多種細胞因子，從而調節視網膜細胞的炎癥反應[3-4]。Müller細胞源性的VEGF是導致DR炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關鍵因素[5]。目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是治療DR的一線治療手段[6]。臨床研究發現，與單純應用激光光凝治療相比，抗VEGF藥物治療對提高患者視力更有效。但是，抗VEGF藥物并未針對DR發病機制且為有創給藥。因此，尋找保護Müller細胞抑制其生成VEGF等炎癥因子的藥物或許更為行之有效。中藥防治DR一直是眼科研究熱門領域。我國傳統中藥中部分制劑對視網膜Müller細胞具有保護作用，且對DR有一定療效[7]。本研究通過觀察蛭草茶合劑對STZ誘導的早期糖尿病小鼠視網膜Müller細胞的影響，探討該合劑對早期DR的保護作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
STZ、谷氨酰胺合成酶（GS）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、熒光二抗及Western blot二抗（美國Sigma公司）；IL-1β、IL-6、VEGF、TNF-α特異性引物（上海生工生物工程有限公司）；VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；第一鏈cDNA合成（逆轉錄）試劑盒（美國Thermo公司）；PowerUp SYBR Green Master Mix（美國ABI公司）；激光共聚焦顯微鏡（LSM800，德國蔡司公司）；冰凍切片機（德國Thermo Scientific公司）；7500實時熒光定量PCR儀（RT-qPCR，美國ABI公司）；酶標儀（Gene limited，中國香港）。
1.2 藥物配方及制備
水蛭25.0 g、夏枯草50.0 g、碧螺春37.5 g、草決明50.0 g、菊花37.5 g、牛膝37.5 g、白蒺藜37.5 g、密蒙花25.0 g、澤瀉37.5 g、谷精草25.0 g。加入8倍量水浸泡30 min，煎煮3次，30 min/次，合并濾液，濃縮至約500 ml，冷藏12 h，濾過，灌裝。將中藥從500 ml（低濃度）濃縮至250（中濃度）、125（高濃度） ml，所得藥物濃度分別為30、60、120 ml/kg。每只小鼠用藥劑量（ml）=小鼠體重（g）×0.1 ml/10 g。
1.3 小鼠2型糖尿病模型構建及分組
健康雄性C57BL/6J小鼠75只，8周齡，體重約20 g，清潔級；購自蘇州大學實驗動物中心。本研究經醫院動物倫理委員會審核（批準號：SLER2019108）。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、糖尿病組、低濃度蛭草茶合劑治療組（低濃度治療組）、中濃度蛭草茶合劑治療組（中濃度治療組）、高濃度蛭草茶合劑治療組（高濃度治療組），每組均為15只。糖尿病組、不同濃度治療組小鼠給予高糖、高脂飼養8周，每天按60 mg/kg劑量腹腔注射STZ，連續5 d，誘導2型糖尿病動物模型。1周后小鼠尾靜脈血糖＞16.7 mmol/L且出現多飲、多食、多尿癥狀為建模成功[8]。正常對照組小鼠不作任何處理。建模4周后，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠按體重10 ml/kg劑量給予相應濃度蛭草茶合劑灌胃，每一個療程5 d，共3個療程，療程間隔15 d。灌胃后2、4、6、8周觀察各組小鼠血糖及體重變化情況；第8周時檢測小鼠視網膜變化。
1.4 免疫熒光染色檢測各組小鼠視網膜組織中GFAP、GS表達
每組隨機選取5只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。苦味酸固定液固定2 h，分別在質量分數分別為10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水過夜。冰凍切片，厚度10 μm。切片通過封閉-通透-一抗孵育（GS、GFAP，1:500）-熒光二抗孵育（1:1000）-DAPI染核-封片等步驟后，激光共聚焦顯微鏡下觀察視網膜組織中GS、GFAP陽性染色結果。
1.5 Western blot檢測各組小鼠視網膜Müller細胞GFAP、GS蛋白表達
每組隨機選取4只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜并剪碎置于EP管中，加入RIPA蛋白質抽提試劑、蛋白酶抑制劑，充分裂解，通過勻漿、超聲、離心后獲得視網膜組織總蛋白質。BCA法測定視網膜蛋白質濃度，將每個樣品等量的蛋白質通過電泳-轉膜-封閉-GFAP-抗孵育-二抗孵育-顯色后得到目的條帶，使用Image J分析軟件測定每個目的條帶及其內參GAPDH的灰度值。
1.6 RT-qPCR檢測各組小鼠視網膜Müller細胞VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達
每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA。使用VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6特異性引物配制PCR反應體系，應用RT-qPCR進行檢測，通過2?△△CT方法對數據進行相對定量分析。
1.7 ELISA檢測各組小鼠視網膜Müller細胞VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達
每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜，勻漿、離心吸取上清待測。根據試劑盒說明書將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μl。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μl。酶標儀測量樣本在波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，計算每組復孔的平均A值。每個標準品的平均A值減去空白孔的A值作為矯正值。以濃度為橫坐標，A值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線，最后計算獲得小鼠視網膜中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量。
1.8 統計分析
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的定量資料以均數±標準差（
）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
與正常組對照比較，糖尿病組小鼠體重減輕，差異有統計學意義（t=3.778、4.193、4.75、5.481、5.054，P＜0.05）；與糖尿病組小鼠體重比較，低濃度治療組（t=1.402、1.721、1.865、2.146、1.878，P＞0.05）、中濃度治療組（t=1.947、0.337、1.686、1.361、0.762，P＞0.05）、高濃度治療組（t=0.803、0.147、2.539、0.48、2.625，P＞0.05）小鼠體重差異無統計學意義（表1）。給予蛭草茶合劑灌胃1個療程后，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠血糖呈降低趨勢（表2）。
表1
各組小鼠蛭草茶合劑灌胃后不同時間體重比較（g，
）
表2
各組小鼠蛭草茶合劑灌胃后不同時間血糖比較（mmol/L，
）
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，正常對照組小鼠視網膜組織GFAP僅表達于內界膜層；而糖尿病組、不同濃度治療組小鼠GFAP陽性表達貫穿于內外界膜間，且糖尿病組GFAP陽性增多，不同濃度治療組GFAP陽性表達均降低（圖1）。
圖1
各組小鼠視網膜激光共聚焦顯微鏡像。1A~1E分別示正常對照組、糖尿病組、低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組。正常對照組小鼠視網膜GFAP陽性僅表達于內界膜；糖尿病組及不同濃度治療組小鼠視網膜GFAP呈強陽性表達于內外界膜間標尺：50 μm
免疫熒光染色觀察發現，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜組織GS陽性染色顯著降低；與糖尿病組比較，不同濃度治療組小鼠視網膜組織GS陽性表達升高（圖2）。
圖2
各組小鼠視網膜組織熒光顯微鏡像。2A~2E分別示正常對照組、糖尿病組、低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組。糖尿病組小鼠視網膜GS陽性染色較正常對照組顯著降低；不同濃度治療組小鼠視網膜GS陽性表達較糖尿病組升高 標尺：50 μm
Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜Müller細胞GFAP蛋白表達顯著升高（t=38.318，P＜0.001），GS蛋白表達顯著下降（t=29.737，P＜0.001），差異有統計學意義；與糖尿病組比較，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠視網膜Müller細胞GFAP蛋白表達下降（t=13.677、19.387、16.305，P＜0.05、＜0.01），GS蛋白表達升高（t=5.170、19.399、6.705，P＜0.05、＜0.01），差異均有統計學意義（圖3）。
圖3
各組小鼠視網膜Mülle細胞GFAP、GS蛋白表達情況。3A、3B分別示GFAP電泳圖和各組GFAP蛋白表達結果；1C、1D分別示GS電泳圖和各組GS蛋白表達結果。與正常對照組比較，***P＜0.001；與糖尿病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01
RT-qPCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF、TNF-α mRNA表達升高（t=35.290、35.627、30.268、28.612，P＜0.01）；與糖尿病組比較，低濃度組治療組（t=7.692、16.775、18.158、20.796，P＜0.001）、中濃度治療組（t=19.971、36.520、26.609、23.640，P＜0.001）、高濃度治療組（t=17.506、24.338、16.896、21.975，P＜0.001）小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF、TNF-α mRNA表達均降低，差異均有統計學意義（圖4A）。ELISA檢測結果顯示，各組小鼠視網膜Mülle細胞中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達結果與qRT-PCR結果一致（圖4B）。
圖4
各組小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF及TNF-α表達情況。4A示mRNA相對表達量；4B示蛋白相對表達量。與正常對照組比較，**P＜0.01；與糖尿病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01
3 討論
既往針對DR研究主要集中于微血管功能障礙。隨著研究的深入，發現DR除微血管病變，同時還是一種神經退行性病變[9]，且神經細胞結構與功能改變早于微血管系統病變[10]。促炎細胞因子的釋放是DR發展的初始事件。DR發病機制中的重要炎癥介質包括VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6[5, 11]。地塞米松等抗炎藥物在治療糖尿病黃斑水腫中的安全性和有效性提示抗炎對DR的重要價值[12]。Müller細胞是神經視網膜上主要的膠質細胞，被認為是DR中炎癥因子的主要來源[13]，表達并分泌一系列生長因子和細胞因子，從而改變視網膜神經元和毛細血管細胞的功能和存活。DR早期，Müller細胞即被激活，產生大量炎癥因子如VEGF、IL等，參與DR視網膜炎癥反應及血管滲漏[14-15]。本研究結果顯示，糖尿病小鼠視網膜Müller細胞活化相關標志物GFAP表達降低，GS表達升高，糖尿病小鼠視網膜Müller細胞呈現激活狀態；視網膜VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6表達均升高，與既往研究結果一致[5, 11, 13, 15]。
蛭草茶合劑具有養陰明目、清肝瀉濁之功效，其中重要藥物水蛭，被傳統中醫認為是一種破血藥，具有逐瘀、通經脈、利水道功效。有學者發現，水蛭不僅具有抗凝、抗血栓作用，還起到抗炎和抗纖維化作用[16]，且水蛭提取物水蛭素可以明顯降低W256 腫瘤細胞和小鼠移植瘤細胞VEGF的表達[17]。本研究結果顯示，蛭草茶合劑灌胃治療后，不同濃度治療組小鼠視網膜Müller細胞中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6表達均下降，提示其在DR中具有抗炎作用。
GFAP是膠質細胞的標志性蛋白，在正常視網膜中僅表達于視網膜星形膠質細胞，而在Müller細胞中幾乎無表達；病理條件下，GFAP在Müller細胞中呈反應性高表達，且會隨疾病進程發生變化，因此又可作為視網膜損傷標志物。有研究報道，活化的Müller細胞中GFAP高表達的可能機制是轉錄調節因子Fos及C-Jun的表達增多，Fos與C-Jun形成二聚體結合于GFAP增強子上，從而增強GFAP轉錄[18-19]。本研究結果顯示，糖尿病組小鼠視網膜Müller細胞中GFAP表達升高，蛭草茶合劑灌胃治療后，不同濃度組小鼠視網膜Müller細胞中GFAP表達均下降。但導致GFAP變化的具體機制尚不明確，有待進一步探討。
GS是谷氨酸代謝循環中的關鍵酶，在GS的作用下，谷氨酸可轉化為谷氨酰胺。谷氨酸是視網膜中最重要的興奮性神經遞質，但當谷氨酸清除降低或生成增加，將使其濃度升高，對神經元產生興奮性毒性。Müller細胞是視網膜細胞中唯一能合成GS的細胞[20]，可將谷氨酸從細胞外轉運至細胞內，在GS作用下轉化為無毒性的谷氨酰胺，輸送給神經細胞重新利用合成谷氨酸[21]。因此，通過藥物干預視網膜Müller細胞，增強GS的表達，可能是防治DR的一種藥物作用機制。本研究結果顯示，蛭草茶合劑可顯著增加糖尿病小鼠視網膜Müller細胞GS的表達，提示其對視網膜的重要保護作用。但蛭草茶合劑調節Müller細胞的具體機制還不明確，需要進一步探討。
糖尿病視網膜病變（DR）確切機制尚不清楚，但應激性視網膜細胞產生的VEGF、TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子在視網膜神經血管損傷中發揮其關鍵作用[1-2]。糖尿病早期，Müller細胞即被激活并分泌多種細胞因子，從而調節視網膜細胞的炎癥反應[3-4]。Müller細胞源性的VEGF是導致DR炎癥、血管滲漏和病理性血管形成的關鍵因素[5]。目前玻璃體腔注射抗VEGF藥物是治療DR的一線治療手段[6]。臨床研究發現，與單純應用激光光凝治療相比，抗VEGF藥物治療對提高患者視力更有效。但是，抗VEGF藥物并未針對DR發病機制且為有創給藥。因此，尋找保護Müller細胞抑制其生成VEGF等炎癥因子的藥物或許更為行之有效。中藥防治DR一直是眼科研究熱門領域。我國傳統中藥中部分制劑對視網膜Müller細胞具有保護作用，且對DR有一定療效[7]。本研究通過觀察蛭草茶合劑對STZ誘導的早期糖尿病小鼠視網膜Müller細胞的影響，探討該合劑對早期DR的保護作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
STZ、谷氨酰胺合成酶（GS）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、熒光二抗及Western blot二抗（美國Sigma公司）；IL-1β、IL-6、VEGF、TNF-α特異性引物（上海生工生物工程有限公司）；VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；第一鏈cDNA合成（逆轉錄）試劑盒（美國Thermo公司）；PowerUp SYBR Green Master Mix（美國ABI公司）；激光共聚焦顯微鏡（LSM800，德國蔡司公司）；冰凍切片機（德國Thermo Scientific公司）；7500實時熒光定量PCR儀（RT-qPCR，美國ABI公司）；酶標儀（Gene limited，中國香港）。
1.2 藥物配方及制備
水蛭25.0 g、夏枯草50.0 g、碧螺春37.5 g、草決明50.0 g、菊花37.5 g、牛膝37.5 g、白蒺藜37.5 g、密蒙花25.0 g、澤瀉37.5 g、谷精草25.0 g。加入8倍量水浸泡30 min，煎煮3次，30 min/次，合并濾液，濃縮至約500 ml，冷藏12 h，濾過，灌裝。將中藥從500 ml（低濃度）濃縮至250（中濃度）、125（高濃度） ml，所得藥物濃度分別為30、60、120 ml/kg。每只小鼠用藥劑量（ml）=小鼠體重（g）×0.1 ml/10 g。
1.3 小鼠2型糖尿病模型構建及分組
健康雄性C57BL/6J小鼠75只，8周齡，體重約20 g，清潔級；購自蘇州大學實驗動物中心。本研究經醫院動物倫理委員會審核（批準號：SLER2019108）。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、糖尿病組、低濃度蛭草茶合劑治療組（低濃度治療組）、中濃度蛭草茶合劑治療組（中濃度治療組）、高濃度蛭草茶合劑治療組（高濃度治療組），每組均為15只。糖尿病組、不同濃度治療組小鼠給予高糖、高脂飼養8周，每天按60 mg/kg劑量腹腔注射STZ，連續5 d，誘導2型糖尿病動物模型。1周后小鼠尾靜脈血糖＞16.7 mmol/L且出現多飲、多食、多尿癥狀為建模成功[8]。正常對照組小鼠不作任何處理。建模4周后，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠按體重10 ml/kg劑量給予相應濃度蛭草茶合劑灌胃，每一個療程5 d，共3個療程，療程間隔15 d。灌胃后2、4、6、8周觀察各組小鼠血糖及體重變化情況；第8周時檢測小鼠視網膜變化。
1.4 免疫熒光染色檢測各組小鼠視網膜組織中GFAP、GS表達
每組隨機選取5只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。苦味酸固定液固定2 h，分別在質量分數分別為10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水過夜。冰凍切片，厚度10 μm。切片通過封閉-通透-一抗孵育（GS、GFAP，1:500）-熒光二抗孵育（1:1000）-DAPI染核-封片等步驟后，激光共聚焦顯微鏡下觀察視網膜組織中GS、GFAP陽性染色結果。
1.5 Western blot檢測各組小鼠視網膜Müller細胞GFAP、GS蛋白表達
每組隨機選取4只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜并剪碎置于EP管中，加入RIPA蛋白質抽提試劑、蛋白酶抑制劑，充分裂解，通過勻漿、超聲、離心后獲得視網膜組織總蛋白質。BCA法測定視網膜蛋白質濃度，將每個樣品等量的蛋白質通過電泳-轉膜-封閉-GFAP-抗孵育-二抗孵育-顯色后得到目的條帶，使用Image J分析軟件測定每個目的條帶及其內參GAPDH的灰度值。
1.6 RT-qPCR檢測各組小鼠視網膜Müller細胞VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達
每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA。使用VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6特異性引物配制PCR反應體系，應用RT-qPCR進行檢測，通過2?△△CT方法對數據進行相對定量分析。
1.7 ELISA檢測各組小鼠視網膜Müller細胞VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達
每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜，勻漿、離心吸取上清待測。根據試劑盒說明書將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μl。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μl。酶標儀測量樣本在波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，計算每組復孔的平均A值。每個標準品的平均A值減去空白孔的A值作為矯正值。以濃度為橫坐標，A值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線，最后計算獲得小鼠視網膜中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達量。
1.8 統計分析
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈正態分布的定量資料以均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
與正常組對照比較，糖尿病組小鼠體重減輕，差異有統計學意義（t=3.778、4.193、4.75、5.481、5.054，P＜0.05）；與糖尿病組小鼠體重比較，低濃度治療組（t=1.402、1.721、1.865、2.146、1.878，P＞0.05）、中濃度治療組（t=1.947、0.337、1.686、1.361、0.762，P＞0.05）、高濃度治療組（t=0.803、0.147、2.539、0.48、2.625，P＞0.05）小鼠體重差異無統計學意義（表1）。給予蛭草茶合劑灌胃1個療程后，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠血糖呈降低趨勢（表2）。
表1
各組小鼠蛭草茶合劑灌胃后不同時間體重比較（g，）
表2
各組小鼠蛭草茶合劑灌胃后不同時間血糖比較（mmol/L，）
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，正常對照組小鼠視網膜組織GFAP僅表達于內界膜層；而糖尿病組、不同濃度治療組小鼠GFAP陽性表達貫穿于內外界膜間，且糖尿病組GFAP陽性增多，不同濃度治療組GFAP陽性表達均降低（圖1）。
圖1
各組小鼠視網膜激光共聚焦顯微鏡像。1A~1E分別示正常對照組、糖尿病組、低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組。正常對照組小鼠視網膜GFAP陽性僅表達于內界膜；糖尿病組及不同濃度治療組小鼠視網膜GFAP呈強陽性表達于內外界膜間標尺：50 μm
免疫熒光染色觀察發現，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜組織GS陽性染色顯著降低；與糖尿病組比較，不同濃度治療組小鼠視網膜組織GS陽性表達升高（圖2）。
圖2
各組小鼠視網膜組織熒光顯微鏡像。2A~2E分別示正常對照組、糖尿病組、低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組。糖尿病組小鼠視網膜GS陽性染色較正常對照組顯著降低；不同濃度治療組小鼠視網膜GS陽性表達較糖尿病組升高 標尺：50 μm
Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜Müller細胞GFAP蛋白表達顯著升高（t=38.318，P＜0.001），GS蛋白表達顯著下降（t=29.737，P＜0.001），差異有統計學意義；與糖尿病組比較，低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組小鼠視網膜Müller細胞GFAP蛋白表達下降（t=13.677、19.387、16.305，P＜0.05、＜0.01），GS蛋白表達升高（t=5.170、19.399、6.705，P＜0.05、＜0.01），差異均有統計學意義（圖3）。
圖3
各組小鼠視網膜Mülle細胞GFAP、GS蛋白表達情況。3A、3B分別示GFAP電泳圖和各組GFAP蛋白表達結果；1C、1D分別示GS電泳圖和各組GS蛋白表達結果。與正常對照組比較，***P＜0.001；與糖尿病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01
RT-qPCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF、TNF-α mRNA表達升高（t=35.290、35.627、30.268、28.612，P＜0.01）；與糖尿病組比較，低濃度組治療組（t=7.692、16.775、18.158、20.796，P＜0.001）、中濃度治療組（t=19.971、36.520、26.609、23.640，P＜0.001）、高濃度治療組（t=17.506、24.338、16.896、21.975，P＜0.001）小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF、TNF-α mRNA表達均降低，差異均有統計學意義（圖4A）。ELISA檢測結果顯示，各組小鼠視網膜Mülle細胞中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達結果與qRT-PCR結果一致（圖4B）。
圖4
各組小鼠視網膜Mülle細胞中IL-6、IL-1β、VEGF及TNF-α表達情況。4A示mRNA相對表達量；4B示蛋白相對表達量。與正常對照組比較，**P＜0.01；與糖尿病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01
3 討論
既往針對DR研究主要集中于微血管功能障礙。隨著研究的深入，發現DR除微血管病變，同時還是一種神經退行性病變[9]，且神經細胞結構與功能改變早于微血管系統病變[10]。促炎細胞因子的釋放是DR發展的初始事件。DR發病機制中的重要炎癥介質包括VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6[5, 11]。地塞米松等抗炎藥物在治療糖尿病黃斑水腫中的安全性和有效性提示抗炎對DR的重要價值[12]。Müller細胞是神經視網膜上主要的膠質細胞，被認為是DR中炎癥因子的主要來源[13]，表達并分泌一系列生長因子和細胞因子，從而改變視網膜神經元和毛細血管細胞的功能和存活。DR早期，Müller細胞即被激活，產生大量炎癥因子如VEGF、IL等，參與DR視網膜炎癥反應及血管滲漏[14-15]。本研究結果顯示，糖尿病小鼠視網膜Müller細胞活化相關標志物GFAP表達降低，GS表達升高，糖尿病小鼠視網膜Müller細胞呈現激活狀態；視網膜VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6表達均升高，與既往研究結果一致[5, 11, 13, 15]。
蛭草茶合劑具有養陰明目、清肝瀉濁之功效，其中重要藥物水蛭，被傳統中醫認為是一種破血藥，具有逐瘀、通經脈、利水道功效。有學者發現，水蛭不僅具有抗凝、抗血栓作用，還起到抗炎和抗纖維化作用[16]，且水蛭提取物水蛭素可以明顯降低W256 腫瘤細胞和小鼠移植瘤細胞VEGF的表達[17]。本研究結果顯示，蛭草茶合劑灌胃治療后，不同濃度治療組小鼠視網膜Müller細胞中VEGF、TNF-α、IL-1β、IL-6表達均下降，提示其在DR中具有抗炎作用。
GFAP是膠質細胞的標志性蛋白，在正常視網膜中僅表達于視網膜星形膠質細胞，而在Müller細胞中幾乎無表達；病理條件下，GFAP在Müller細胞中呈反應性高表達，且會隨疾病進程發生變化，因此又可作為視網膜損傷標志物。有研究報道，活化的Müller細胞中GFAP高表達的可能機制是轉錄調節因子Fos及C-Jun的表達增多，Fos與C-Jun形成二聚體結合于GFAP增強子上，從而增強GFAP轉錄[18-19]。本研究結果顯示，糖尿病組小鼠視網膜Müller細胞中GFAP表達升高，蛭草茶合劑灌胃治療后，不同濃度組小鼠視網膜Müller細胞中GFAP表達均下降。但導致GFAP變化的具體機制尚不明確，有待進一步探討。
GS是谷氨酸代謝循環中的關鍵酶，在GS的作用下，谷氨酸可轉化為谷氨酰胺。谷氨酸是視網膜中最重要的興奮性神經遞質，但當谷氨酸清除降低或生成增加，將使其濃度升高，對神經元產生興奮性毒性。Müller細胞是視網膜細胞中唯一能合成GS的細胞[20]，可將谷氨酸從細胞外轉運至細胞內，在GS作用下轉化為無毒性的谷氨酰胺，輸送給神經細胞重新利用合成谷氨酸[21]。因此，通過藥物干預視網膜Müller細胞，增強GS的表達，可能是防治DR的一種藥物作用機制。本研究結果顯示，蛭草茶合劑可顯著增加糖尿病小鼠視網膜Müller細胞GS的表達，提示其對視網膜的重要保護作用。但蛭草茶合劑調節Müller細胞的具體機制還不明確，需要進一步探討。
