引用本文： 劉一帆, 沈吟. 低濃度氯喹保護成年小鼠視網膜神經節細胞抵抗N-甲基-D-天冬氨酸的興奮性毒性作用. 中華眼底病雜志, 2020, 36(4): 295-301. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190903-00275 復制
RGC的丟失與高濃度谷氨酸過度激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體所產生的興奮性毒性相關[1]。RGC的損傷可導致不可逆性視覺障礙。氯喹是一種主要用于治療瘧疾的藥物，由于其抗炎特性，對部分自身免疫性疾病等亦有一定作用[2]。研究表明，不同濃度氯喹在體內和體外具有不同甚至相反作用。腦卒中大鼠模型中，低濃度氯喹可促進神經節苷脂（GM1）在細胞中的積累，減輕血腦屏障的損傷[3-4]。GM1是一種主要的腦GM1，具有神經保護特性[5]。然而，長期使用則會產生視網膜毒性[6-7]。有研究發現，長期服用氯喹的患者和小鼠RGC喪失和視網膜神經纖維層（RNFL）顯著變薄[8]。通過對離體大鼠RGC的電生理檢測發現，氯喹的毒性可能通過調節酸敏離子通道ASIC 1a而影響視覺傳導功能發揮其作用[9]。提示氯喹可能激活不同信號通路從而對視網膜內細胞產生不同作用。本研究觀察了不同濃度氯喹對NMDA損傷模型小鼠RGC的影響，初步探索低濃度氯喹對RGC的保護作用及可能調控機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組與建模
雄性C57/BL6小鼠54只，4～6周齡，體重15～22 g，武漢大學人民醫院動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027）。飼養于標準（12 h明/12 h暗循環）清潔級環境；實驗動物操作符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得武漢大學人民醫院實驗動物倫理委員會許可[編號：WDRM動（福）第20190113號]。采用隨機數字表法將小鼠分為氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組，每組均為18只。根據前期預實驗結果，氯喹低濃度組小鼠按體重10 mg/kg劑量腹腔注射2 mg/ml氯喹；氯喹高濃度組小鼠按100 mg/kg劑量腹腔注射20 mg/ml氯喹；PBS對照組小鼠腹腔注射等體積PBS。3組小鼠1次/d腹腔注射相應藥物至動物處死取材。2 d后參照文獻[10]的方法，3組小鼠左眼（模型眼）玻璃體腔注射5 nmol/L NMDA（美國Sigma公司）1 μl建模，對側眼注射等體積PBS。已剔除虹膜出血、晶狀體受損、穿刺及拔針過程中漏液過多以及注射后出現眼部感染的小鼠。
1.2 全視網膜鋪片及RGC計數
建模后7 d，頸椎脫臼法處死小鼠摘除眼球，每組分別選取6只眼球，去除眼前節后，4%多聚甲醛固定30 min，取出視網膜于5%牛血清白蛋白（武漢Goodbio Technology公司）和0.4% Triton X-100 溶液中4 ℃封閉過夜，4 ℃孵育抗Brn3a抗體（山羊，1:200，美國Santa cruz公司）24 h，PBS漂洗后視網膜置于Alexa Fluor 594標記驢抗山羊IgG二抗（1:500，美國Santa Cruz公司）室溫孵育5 h，PBS漂洗后抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡（BX53，日本Olympus公司）下觀察并拍照。以視盤為中心，將視網膜分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，每個象限從距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間、周邊3區（圖1），熒光顯微鏡10×40倍視野下，每個象限的每個分區各隨機選取3個視野，按序進行拍照，應用Image J軟件進行視網膜鋪片RGC計數。每個視野的實際面積為0.097 2 mm2，計算并比較各組小鼠視網膜單位面積RGC數量。
圖1
視網膜鋪片RGC計數模式圖
1.3 HE染色觀察不同濃度氯喹對小鼠視網膜整體結構的影響
建模后7 d，每組選取3只眼球，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋，沿平行于視神經的矢狀軸切片，厚度為5 μm。HE染色，封片后光學顯微鏡下觀察。每只眼球選取1張包含視神經的視網膜切片，應用Image J軟件測量距視神經200 μm兩側的內層視網膜（IRL）厚度和視網膜全層厚度。IRL厚度為神經節細胞層（GCL）和內叢狀層（IPL）。比較各組小鼠IRL/全層視網膜的比值。
1.4 視動反應（OMR）評估各組小鼠視敏度[11 ]
建模后9 d，參照文獻[12]的方法每組選取9只小鼠提前暗適應4 h，應用虛擬光眼視動力儀OptoMotry檢測各組小鼠視敏度。小鼠放置于由4個計算機屏幕圍繞的平臺中心，同時屏幕上顯示不同空間頻率的移動光柵，小鼠看到光柵時頭部會發生運動。通過增加光柵的空間頻率量化視敏度閾值，定義視敏度。
1.5 全視野ERG檢測各組小鼠內層視網膜功能
建模后10 d，應用RetiMINER視覺電生理儀（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）記錄ERG的光負性反應（PhNR）波，刺激器為Ganzfeld全視野刺激器。每組選取9只小鼠提前暗適應過夜，記錄電極為鍍金線圈電極，參考電極和接地電極分別插入兩耳之間皮下和尾部，小鼠在25 cd.s/m2的綠光背景中明適應5 min，刺激光為強度10.0 cd.s/m2的綠光，PhNR波為b波后的一個負向波，其振幅為基線到該波谷的距離。
1.6 視網膜免疫熒光染色檢測各組小鼠視網膜膠質纖維酸性蛋白（GFAP）熒光表達
建模后11 d，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組分別選取3只眼球行視網膜冰凍切片[13]。將視杯視神經矢狀切成14 μm厚的切片，GFAP抗體（兔，1∶1000，丹麥DAKO公司）和Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗（1∶500，美國Santa Cruz公司）孵育，DAPI孵育后封片，激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）觀察GFAP在視網膜組織上的熒光表達情況，應用Image J軟件進行視網膜切片GFAP免疫熒光染色的相對定量。比較各組小鼠視網膜GFAP熒光陽性面積占視網膜總面積的百分比。
1.7 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組小鼠視網膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表達
建模后11 d，每組取6只眼球，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，引物由武漢擎科生物公司合成。GFAP：正向引物5’- CCCTGGCTCGTGTGGATTT-3’，反向引物5’- GACCGATACCACTCCTCTGTC-3’；IL-6：正向引物5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’，反向引物5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’；TNF-α：正向引物5’-GCGGAGTCCGGGCAGGTCTA-3’，反向引物5’-GGGGGCTGGCTCTGTGAGGA-3’；GAPDH：正向引物5’-CCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3’，反向引物5’-GGTCTGGGATGGAAATTGTGAGGG-3’。
1.8 統計學方法
采用Graph Pad Prism 7.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（
）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，氯喹低濃度組小鼠視網膜Brn3a紅色熒光信號較PBS對照組和氯喹高濃度組明顯增多（圖2）。建模后7 d，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠模型眼RGC密度分別為（1 555.0±135.95）、（416.7±29.15）、（550.4±94.08）個/mm2。氯喹低濃度組小鼠模型眼RGC密度明顯高于PBS對照組、氯喹高濃度組，差異有統計學意義（F=54.41，P＜0.01）；氯喹高濃度組小鼠模型眼RGC密度低于PBS對照組，但差異無統計學意義（F=1.18，P＞0.05）（圖3A）。氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠對側眼RGC密度分別為（2 988.7±168.88）、（3 640.3±91.90）、（3 476.22±165.23）個/mm2；三組小鼠對側眼RGC密度比較，差異無統計學意義（F=5.19，P＞0.05）（圖3B）。
圖2
三組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。2A、2B、2C分別示氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組。紅色熒光為Brn3a標記的RGC，氯喹低濃度組小鼠視網膜Brn3a紅色熒光信號較PBS對照組和氯喹高濃度組均明顯增多 Brn3a 標尺：50 μm
圖3
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠模型眼、對側眼RGC密度比較。3A、3B分別示模型眼、對側眼。n=3，**P＜0.01
光學顯微鏡觀察發現，各組小鼠視網膜組織GCL、內核層（INL）和外核層（ONL）仍可分辨；GCL細胞核固縮、排列較紊亂。與PBS對照組比較，氯喹低濃度組小鼠視網膜IPL厚度變厚；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜IPL厚度無明顯增厚（圖4）。氯喹低濃度組小鼠IRL與全層視網膜厚度比值高于氯喹高濃度組、PBS對照組，差異有統計學意義（F=10.36，P＜0.01）；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠IRL與全層視網膜厚度比值比較，差異無統計學意義（F=0.02，P＞0.05）（圖5）。
圖4
三組小鼠視網膜光學顯微鏡像。4A、4B、4C分別示氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組。各組小鼠視網膜組織GCL、INL、ONL仍可分辨；GCL細胞核固縮、排列較紊亂。氯喹低濃度組小鼠視網膜IPL厚度較PBS對照組增厚，氯喹高濃度組IPL厚度與PBS對照組無明顯增厚 HE ×400
圖5
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠IRL與全層視網膜比值比較。n=3，**P＜0.01
建模后11 d，全視野ERG檢查結果顯示，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅分別為（19.6±1.36）、（11.8±0.81）、（12.0±0.92）μV。氯喹低濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅比較，差異有統計學意義（F=17.60，P＜0.01）；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅為比較，差異無統計學意義（F=0.10，P＞0.05）（圖6）。
圖6
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅比較。6A示小鼠典型PhNR波形；6B示各組小鼠PhNR波振幅比較。n=9，**P＜0.01，****P＜0.000 1
OMR檢測結果顯示，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視敏度分別為（0.16±0.04）、（0.01±0.01）、（0.05±0.03）dB。與PBS對照組小鼠視敏度比較，氯喹低濃度組差異有統計學意義（F=9.10，P＜0.05），氯喹高濃度組差異無統計學意義（F=1.80，P＞0.05）（圖7）。
圖7
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視敏度比較。n=9，*P＜0.05
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，PBS對照組、氯喹高濃度組小鼠視網膜GCL和RNFL可見大量GFAP綠色熒光表達；氯喹低濃度組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達明顯少于PBS對照組、氯喹高濃度組（圖8，9）。
圖8
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜激光共聚焦顯微鏡像。8A、8B、8C分別示PBS對照組、氯喹低濃度組、氯喹高濃度組。PBS對照組、高濃度氯喹組小鼠視網膜GCL和RNFL可見大量GFAP綠色熒光表達；氯喹低濃度組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達明顯少于PBS對照組、氯喹高濃度組 標尺：20 μm
圖9
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達比較。n=3，**P＜0.01，*P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，低濃度氯喹組小鼠視網膜GFAP mRNA表達較高濃度氯喹組、PBS對照組顯著下降，差異有統計學意義（F=110.20，P＜0.01）；高濃度氯喹組小鼠視網膜GFAP mRNA表達顯著高于PBS對照組，差異有統計學意義（F=129.29，P＜0.000 1）。氯喹低濃度組小鼠視網膜IL-6、TNF-α mRNA表達較高濃度氯喹組、PBS對照組下降，差異有統計學意義（F=167.60、17.78，P＜0.001、＜0.01）；氯喹高濃度組小鼠視網膜IL-6、TNF-α mRNA表達較PBS對照組顯著升高，差異有統計學意義（F=212.44，P＜0.000 1；F=8.524，P＜0.05）（圖10）。
圖10
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜TNF-α、GFAP、IL-6 mRNA表達比較。10A示TNF-α；10B示GFAP；10C示IL-6。n=6，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1
3 討論
氯喹作為一種抗瘧藥物[2]，目前也被用作抗逆轉錄病毒劑治療艾滋病和放射治療增敏劑治療惡性腫瘤[14]。氯喹類藥物的眼部毒性是其毒性的一個重要方面，氯喹與黑色素細胞的較強親和力可導致細胞不可逆轉損害，然而，目前氯喹如何引起視網膜毒性尚未完全確定。研究表明，氯喹的眼部毒性作用與劑量和持續時間有關，尤其是在長期服用的患者中更多見[15]。早期階段，視網膜病變無癥狀且進展緩慢；晚期階段，氯喹所致視網膜神經感覺層變薄，RGC嚴重喪失[16-17]，最終導致中心視力不可逆喪失。
近年有研究發現低濃度氯喹具有神經保護作用。在體內，低濃度氯喹可促進具有神經保護特性的GM1在腦卒中大鼠的神經細胞中積累[5]，減輕血腦屏障損傷[3-4]；在體外，低濃度氯喹可保護海馬HT22細胞免受谷氨酸的興奮性毒性作用[18]。在藥理學方面，低于1 mol/L濃度的氯喹可使GM1在PC12細胞表面堆積[3]。因此，低濃度氯喹可致GM1上調發揮其神經保護作用。
玻璃體腔注射NMDA可導致RGC死亡，已被應用于誘導多種動物視網膜的興奮性毒性[19-21]。本研究結果顯示，低濃度氯喹（10 mg/kg）可以在組織形態學、視覺電生理功能和行為學方面保護RGC，減少其因NMDA的興奮性毒性作用導致的死亡；高濃度氯喹（100 mg/kg）對RGC無保護作用，反而可能會加重RGC的損傷。
有研究表明，膠質活化和炎性反應在青光眼病理機制中起重要作用[22]，GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，在視網膜中主要標記Müller細胞。Müller細胞的活化是視網膜內細胞損傷和死亡的最敏感和非特異性指標，在視網膜疾病的炎癥反應中起重要作用[23-26]，可促進促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α的產生。氯喹由于其抗炎特性被廣泛運用于類風濕炎癥的治療。有文獻報道，氯喹可通過抑制炎癥保護角膜上皮細胞[27]。本研究結果顯示，在NMDA損傷后，經低濃度氯喹治療的小鼠視網膜GFAP的熒光表達及mRNA含量較PBS對照組（未處理）明顯減少，與低濃度氯喹組RGC密度更高一致；而氯喹高濃度組則不同，提示膠質細胞活化可能促進視網膜的修復。結果表明低濃度氯喹可能通過抑制膠質活化和炎癥反應，而在NMDA損傷中發揮對RGC的神經保護作用。
本研究采用RGC的特異標記抗體Brn3a進行視網膜鋪片免疫熒光染色，以評估RGC的存活數量[28]。結果顯示，低濃度氯喹能增加NMDA損傷后RGC的存活。為確定存活的RGC是否對光有反應，我們同時測試了小鼠ERG PhNR波以評估RGC的生物電活動。青光眼患者和部分嚙齒動物的青光眼模型中，由于RGC的損傷可導致PhNR波振幅降低。因此，PhNR波振幅被認為是RGC的對光生物電活動，同時也代表視網膜內層的無長突細胞和膠質細胞的電活動[29-31]。本研究結果顯示，NMDA損傷后，氯喹低濃度組小鼠PhNR波振幅提高到正常小鼠的80%以上，表明低濃度氯喹對RGC的保護不僅體現在形態上，還能保存RGC的電生理功能。
OMR由于其不需要傳統視覺行為測試的增強訓練，已廣泛應用于視網膜退行性疾病小鼠的視覺功能測試[32]。本研究結果表明，氯喹低濃度組小鼠視敏度明顯優于PBS對照組，進一步提示低濃度氯喹對RGC的神經保護作用。
本研究證實低濃度氯喹（10 mg/kg）對NMDA損傷所致RGC丟失的保護作用，其作用機制可能與抑制膠質細胞活化與炎癥反應有關；高濃度氯喹（100 mg/kg）對RGC有潛在毒性作用，故適當劑量的氯喹可能是治療視網膜興奮性毒性的有效方法。在今后進一步研究中，擬進一步在分子和蛋白水平定量低濃度氯喹對NMDA所致損傷炎癥反應的抑制程度并探索其中具體的分子機制與信號通路。
RGC的丟失與高濃度谷氨酸過度激活N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體所產生的興奮性毒性相關[1]。RGC的損傷可導致不可逆性視覺障礙。氯喹是一種主要用于治療瘧疾的藥物，由于其抗炎特性，對部分自身免疫性疾病等亦有一定作用[2]。研究表明，不同濃度氯喹在體內和體外具有不同甚至相反作用。腦卒中大鼠模型中，低濃度氯喹可促進神經節苷脂（GM1）在細胞中的積累，減輕血腦屏障的損傷[3-4]。GM1是一種主要的腦GM1，具有神經保護特性[5]。然而，長期使用則會產生視網膜毒性[6-7]。有研究發現，長期服用氯喹的患者和小鼠RGC喪失和視網膜神經纖維層（RNFL）顯著變薄[8]。通過對離體大鼠RGC的電生理檢測發現，氯喹的毒性可能通過調節酸敏離子通道ASIC 1a而影響視覺傳導功能發揮其作用[9]。提示氯喹可能激活不同信號通路從而對視網膜內細胞產生不同作用。本研究觀察了不同濃度氯喹對NMDA損傷模型小鼠RGC的影響，初步探索低濃度氯喹對RGC的保護作用及可能調控機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗動物分組與建模
雄性C57/BL6小鼠54只，4～6周齡，體重15～22 g，武漢大學人民醫院動物中心提供（許可證號：SYXK鄂2015-0027）。飼養于標準（12 h明/12 h暗循環）清潔級環境；實驗動物操作符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得武漢大學人民醫院實驗動物倫理委員會許可[編號：WDRM動（福）第20190113號]。采用隨機數字表法將小鼠分為氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組，每組均為18只。根據前期預實驗結果，氯喹低濃度組小鼠按體重10 mg/kg劑量腹腔注射2 mg/ml氯喹；氯喹高濃度組小鼠按100 mg/kg劑量腹腔注射20 mg/ml氯喹；PBS對照組小鼠腹腔注射等體積PBS。3組小鼠1次/d腹腔注射相應藥物至動物處死取材。2 d后參照文獻[10]的方法，3組小鼠左眼（模型眼）玻璃體腔注射5 nmol/L NMDA（美國Sigma公司）1 μl建模，對側眼注射等體積PBS。已剔除虹膜出血、晶狀體受損、穿刺及拔針過程中漏液過多以及注射后出現眼部感染的小鼠。
1.2 全視網膜鋪片及RGC計數
建模后7 d，頸椎脫臼法處死小鼠摘除眼球，每組分別選取6只眼球，去除眼前節后，4%多聚甲醛固定30 min，取出視網膜于5%牛血清白蛋白（武漢Goodbio Technology公司）和0.4% Triton X-100 溶液中4 ℃封閉過夜，4 ℃孵育抗Brn3a抗體（山羊，1:200，美國Santa cruz公司）24 h，PBS漂洗后視網膜置于Alexa Fluor 594標記驢抗山羊IgG二抗（1:500，美國Santa Cruz公司）室溫孵育5 h，PBS漂洗后抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡（BX53，日本Olympus公司）下觀察并拍照。以視盤為中心，將視網膜分為顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限，每個象限從距視盤1/6、1/2、5/6半徑處劃分為中央、中間、周邊3區（圖1），熒光顯微鏡10×40倍視野下，每個象限的每個分區各隨機選取3個視野，按序進行拍照，應用Image J軟件進行視網膜鋪片RGC計數。每個視野的實際面積為0.097 2 mm2，計算并比較各組小鼠視網膜單位面積RGC數量。
圖1
視網膜鋪片RGC計數模式圖
1.3 HE染色觀察不同濃度氯喹對小鼠視網膜整體結構的影響
建模后7 d，每組選取3只眼球，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定24 h。石蠟包埋，沿平行于視神經的矢狀軸切片，厚度為5 μm。HE染色，封片后光學顯微鏡下觀察。每只眼球選取1張包含視神經的視網膜切片，應用Image J軟件測量距視神經200 μm兩側的內層視網膜（IRL）厚度和視網膜全層厚度。IRL厚度為神經節細胞層（GCL）和內叢狀層（IPL）。比較各組小鼠IRL/全層視網膜的比值。
1.4 視動反應（OMR）評估各組小鼠視敏度[11 ]
建模后9 d，參照文獻[12]的方法每組選取9只小鼠提前暗適應4 h，應用虛擬光眼視動力儀OptoMotry檢測各組小鼠視敏度。小鼠放置于由4個計算機屏幕圍繞的平臺中心，同時屏幕上顯示不同空間頻率的移動光柵，小鼠看到光柵時頭部會發生運動。通過增加光柵的空間頻率量化視敏度閾值，定義視敏度。
1.5 全視野ERG檢測各組小鼠內層視網膜功能
建模后10 d，應用RetiMINER視覺電生理儀（重慶艾爾曦醫療設備有限公司）記錄ERG的光負性反應（PhNR）波，刺激器為Ganzfeld全視野刺激器。每組選取9只小鼠提前暗適應過夜，記錄電極為鍍金線圈電極，參考電極和接地電極分別插入兩耳之間皮下和尾部，小鼠在25 cd.s/m2的綠光背景中明適應5 min，刺激光為強度10.0 cd.s/m2的綠光，PhNR波為b波后的一個負向波，其振幅為基線到該波谷的距離。
1.6 視網膜免疫熒光染色檢測各組小鼠視網膜膠質纖維酸性蛋白（GFAP）熒光表達
建模后11 d，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組分別選取3只眼球行視網膜冰凍切片[13]。將視杯視神經矢狀切成14 μm厚的切片，GFAP抗體（兔，1∶1000，丹麥DAKO公司）和Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗（1∶500，美國Santa Cruz公司）孵育，DAPI孵育后封片，激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）觀察GFAP在視網膜組織上的熒光表達情況，應用Image J軟件進行視網膜切片GFAP免疫熒光染色的相對定量。比較各組小鼠視網膜GFAP熒光陽性面積占視網膜總面積的百分比。
1.7 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組小鼠視網膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表達
建模后11 d，每組取6只眼球，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，引物由武漢擎科生物公司合成。GFAP：正向引物5’- CCCTGGCTCGTGTGGATTT-3’，反向引物5’- GACCGATACCACTCCTCTGTC-3’；IL-6：正向引物5’-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3’，反向引物5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’；TNF-α：正向引物5’-GCGGAGTCCGGGCAGGTCTA-3’，反向引物5’-GGGGGCTGGCTCTGTGAGGA-3’；GAPDH：正向引物5’-CCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3’，反向引物5’-GGTCTGGGATGGAAATTGTGAGGG-3’。
1.8 統計學方法
采用Graph Pad Prism 7.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，氯喹低濃度組小鼠視網膜Brn3a紅色熒光信號較PBS對照組和氯喹高濃度組明顯增多（圖2）。建模后7 d，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠模型眼RGC密度分別為（1 555.0±135.95）、（416.7±29.15）、（550.4±94.08）個/mm2。氯喹低濃度組小鼠模型眼RGC密度明顯高于PBS對照組、氯喹高濃度組，差異有統計學意義（F=54.41，P＜0.01）；氯喹高濃度組小鼠模型眼RGC密度低于PBS對照組，但差異無統計學意義（F=1.18，P＞0.05）（圖3A）。氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠對側眼RGC密度分別為（2 988.7±168.88）、（3 640.3±91.90）、（3 476.22±165.23）個/mm2；三組小鼠對側眼RGC密度比較，差異無統計學意義（F=5.19，P＞0.05）（圖3B）。
圖2
三組小鼠視網膜熒光顯微鏡像。2A、2B、2C分別示氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組。紅色熒光為Brn3a標記的RGC，氯喹低濃度組小鼠視網膜Brn3a紅色熒光信號較PBS對照組和氯喹高濃度組均明顯增多 Brn3a 標尺：50 μm
圖3
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠模型眼、對側眼RGC密度比較。3A、3B分別示模型眼、對側眼。n=3，**P＜0.01
光學顯微鏡觀察發現，各組小鼠視網膜組織GCL、內核層（INL）和外核層（ONL）仍可分辨；GCL細胞核固縮、排列較紊亂。與PBS對照組比較，氯喹低濃度組小鼠視網膜IPL厚度變厚；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜IPL厚度無明顯增厚（圖4）。氯喹低濃度組小鼠IRL與全層視網膜厚度比值高于氯喹高濃度組、PBS對照組，差異有統計學意義（F=10.36，P＜0.01）；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠IRL與全層視網膜厚度比值比較，差異無統計學意義（F=0.02，P＞0.05）（圖5）。
圖4
三組小鼠視網膜光學顯微鏡像。4A、4B、4C分別示氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組。各組小鼠視網膜組織GCL、INL、ONL仍可分辨；GCL細胞核固縮、排列較紊亂。氯喹低濃度組小鼠視網膜IPL厚度較PBS對照組增厚，氯喹高濃度組IPL厚度與PBS對照組無明顯增厚 HE ×400
圖5
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠IRL與全層視網膜比值比較。n=3，**P＜0.01
建模后11 d，全視野ERG檢查結果顯示，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅分別為（19.6±1.36）、（11.8±0.81）、（12.0±0.92）μV。氯喹低濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅比較，差異有統計學意義（F=17.60，P＜0.01）；氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅為比較，差異無統計學意義（F=0.10，P＞0.05）（圖6）。
圖6
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠PhNR波振幅比較。6A示小鼠典型PhNR波形；6B示各組小鼠PhNR波振幅比較。n=9，**P＜0.01，****P＜0.000 1
OMR檢測結果顯示，氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視敏度分別為（0.16±0.04）、（0.01±0.01）、（0.05±0.03）dB。與PBS對照組小鼠視敏度比較，氯喹低濃度組差異有統計學意義（F=9.10，P＜0.05），氯喹高濃度組差異無統計學意義（F=1.80，P＞0.05）（圖7）。
圖7
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視敏度比較。n=9，*P＜0.05
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，PBS對照組、氯喹高濃度組小鼠視網膜GCL和RNFL可見大量GFAP綠色熒光表達；氯喹低濃度組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達明顯少于PBS對照組、氯喹高濃度組（圖8，9）。
圖8
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜激光共聚焦顯微鏡像。8A、8B、8C分別示PBS對照組、氯喹低濃度組、氯喹高濃度組。PBS對照組、高濃度氯喹組小鼠視網膜GCL和RNFL可見大量GFAP綠色熒光表達；氯喹低濃度組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達明顯少于PBS對照組、氯喹高濃度組 標尺：20 μm
圖9
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜GFAP綠色熒光表達比較。n=3，**P＜0.01，*P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，低濃度氯喹組小鼠視網膜GFAP mRNA表達較高濃度氯喹組、PBS對照組顯著下降，差異有統計學意義（F=110.20，P＜0.01）；高濃度氯喹組小鼠視網膜GFAP mRNA表達顯著高于PBS對照組，差異有統計學意義（F=129.29，P＜0.000 1）。氯喹低濃度組小鼠視網膜IL-6、TNF-α mRNA表達較高濃度氯喹組、PBS對照組下降，差異有統計學意義（F=167.60、17.78，P＜0.001、＜0.01）；氯喹高濃度組小鼠視網膜IL-6、TNF-α mRNA表達較PBS對照組顯著升高，差異有統計學意義（F=212.44，P＜0.000 1；F=8.524，P＜0.05）（圖10）。
圖10
氯喹低濃度組、氯喹高濃度組、PBS對照組小鼠視網膜TNF-α、GFAP、IL-6 mRNA表達比較。10A示TNF-α；10B示GFAP；10C示IL-6。n=6，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1
3 討論
氯喹作為一種抗瘧藥物[2]，目前也被用作抗逆轉錄病毒劑治療艾滋病和放射治療增敏劑治療惡性腫瘤[14]。氯喹類藥物的眼部毒性是其毒性的一個重要方面，氯喹與黑色素細胞的較強親和力可導致細胞不可逆轉損害，然而，目前氯喹如何引起視網膜毒性尚未完全確定。研究表明，氯喹的眼部毒性作用與劑量和持續時間有關，尤其是在長期服用的患者中更多見[15]。早期階段，視網膜病變無癥狀且進展緩慢；晚期階段，氯喹所致視網膜神經感覺層變薄，RGC嚴重喪失[16-17]，最終導致中心視力不可逆喪失。
近年有研究發現低濃度氯喹具有神經保護作用。在體內，低濃度氯喹可促進具有神經保護特性的GM1在腦卒中大鼠的神經細胞中積累[5]，減輕血腦屏障損傷[3-4]；在體外，低濃度氯喹可保護海馬HT22細胞免受谷氨酸的興奮性毒性作用[18]。在藥理學方面，低于1 mol/L濃度的氯喹可使GM1在PC12細胞表面堆積[3]。因此，低濃度氯喹可致GM1上調發揮其神經保護作用。
玻璃體腔注射NMDA可導致RGC死亡，已被應用于誘導多種動物視網膜的興奮性毒性[19-21]。本研究結果顯示，低濃度氯喹（10 mg/kg）可以在組織形態學、視覺電生理功能和行為學方面保護RGC，減少其因NMDA的興奮性毒性作用導致的死亡；高濃度氯喹（100 mg/kg）對RGC無保護作用，反而可能會加重RGC的損傷。
有研究表明，膠質活化和炎性反應在青光眼病理機制中起重要作用[22]，GFAP是星形膠質細胞活化的標志物，在視網膜中主要標記Müller細胞。Müller細胞的活化是視網膜內細胞損傷和死亡的最敏感和非特異性指標，在視網膜疾病的炎癥反應中起重要作用[23-26]，可促進促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α的產生。氯喹由于其抗炎特性被廣泛運用于類風濕炎癥的治療。有文獻報道，氯喹可通過抑制炎癥保護角膜上皮細胞[27]。本研究結果顯示，在NMDA損傷后，經低濃度氯喹治療的小鼠視網膜GFAP的熒光表達及mRNA含量較PBS對照組（未處理）明顯減少，與低濃度氯喹組RGC密度更高一致；而氯喹高濃度組則不同，提示膠質細胞活化可能促進視網膜的修復。結果表明低濃度氯喹可能通過抑制膠質活化和炎癥反應，而在NMDA損傷中發揮對RGC的神經保護作用。
本研究采用RGC的特異標記抗體Brn3a進行視網膜鋪片免疫熒光染色，以評估RGC的存活數量[28]。結果顯示，低濃度氯喹能增加NMDA損傷后RGC的存活。為確定存活的RGC是否對光有反應，我們同時測試了小鼠ERG PhNR波以評估RGC的生物電活動。青光眼患者和部分嚙齒動物的青光眼模型中，由于RGC的損傷可導致PhNR波振幅降低。因此，PhNR波振幅被認為是RGC的對光生物電活動，同時也代表視網膜內層的無長突細胞和膠質細胞的電活動[29-31]。本研究結果顯示，NMDA損傷后，氯喹低濃度組小鼠PhNR波振幅提高到正常小鼠的80%以上，表明低濃度氯喹對RGC的保護不僅體現在形態上，還能保存RGC的電生理功能。
OMR由于其不需要傳統視覺行為測試的增強訓練，已廣泛應用于視網膜退行性疾病小鼠的視覺功能測試[32]。本研究結果表明，氯喹低濃度組小鼠視敏度明顯優于PBS對照組，進一步提示低濃度氯喹對RGC的神經保護作用。
本研究證實低濃度氯喹（10 mg/kg）對NMDA損傷所致RGC丟失的保護作用，其作用機制可能與抑制膠質細胞活化與炎癥反應有關；高濃度氯喹（100 mg/kg）對RGC有潛在毒性作用，故適當劑量的氯喹可能是治療視網膜興奮性毒性的有效方法。在今后進一步研究中，擬進一步在分子和蛋白水平定量低濃度氯喹對NMDA所致損傷炎癥反應的抑制程度并探索其中具體的分子機制與信號通路。
