引用本文： 周樹民, 孔繁強, 陳松. 基質金屬蛋白-9抑制劑阻斷視網膜色素上皮細胞表面CD73脫落防治實驗性自身免疫性葡萄膜炎的初步研究. 中華眼底病雜志, 2020, 36(4): 289-294. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20180502-00141 復制
三磷酸腺苷（ATP）及其代謝產物不僅是重要的能量代謝物質也具有顯著免疫調控作用[1-2]。當缺氧或局部炎癥發生時，ATP被大量釋放至胞外加重局部炎癥反應[3-5]。ATP在細胞外并不穩定，可被逐級酶解為腺苷。與ATP作用截然相反，腺苷具有顯著的免疫抑制功能[6-8]。位于細胞膜表面的5'-核苷酸酶CD73控制單磷酸腺苷（AMP）至腺苷的分解過程，是腺苷產生的限速酶。RPE細胞是眼底組織中唯一表達CD73的細胞，當炎癥發生時RPE細胞表面CD73含量急劇下降甚至轉為陰性，腺苷所發揮的免疫抑制功能顯著下降，從而促進炎癥的發生[9]。研究發現，RPE細胞表面CD73含量減少是由于MMP-9在Lys547-Phe548位點水解CD73，使得該分子自RPE細胞膜表面脫落所致[10]。CD73通過調節不同免疫細胞功能參與實驗性自身免疫葡萄膜炎（EAU）的關系研究尚少。本研究旨在驗證MMP-9抑制劑阻斷CD73自RPE細胞脫落，為葡萄膜炎的治療提供初步理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
選擇性MMP-9抑制劑CTK8G1150（美國eBioscience公司）；脂多糖（LPS）及TNF-α（美國Invitrogen 公司）；CD4+ T細胞分離試劑盒及抗小鼠CD3抗體（美國Stemcell公司），兔抗小鼠CD73多克隆抗體（美國 Santa Cruz公司）；氚標記胸腺嘧啶核苷（[3H]-TdR）（北京原子能研究所）。
1.2 小鼠RPE細胞分離和培養
雌性野生型C57BL/6、CD73基因敲除（CD73-/-）小鼠各4只。4周齡，體重10 g，無特定病原體（SPF）級；由天津實驗動物中心提供。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學動物倫理委員會許可（許可號：TMUAC00281）。參照文獻[11-12]的方法分離RPE細胞，計數后接種于培養瓶中，以含10%胎牛血清（FBS）及雙抗RPMI 1640培養基進行培養，37 ℃、5%CO2分壓。待細胞達到80%融合時以0.2%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、傳代、凍存。取第3代細胞進行后續實驗。
1.3 [3H]-TdR 摻入法檢測RPE細胞對CD4+ T細胞增生的作用
傳代后的RPE細胞接種于96孔細胞培養板，每種細胞分別接種36副孔。待80%細胞融合后，給予50 ng/ml LPS、200 ng/ml TNF-α干預，激活RPE功能并誘發其表面CD73脫落。依據是否同時加入MMP-9抑制劑CTK8G1150（終濃度5.0 μmol/L）將每種細胞等分為C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組，CD73-/-MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組。48 h后充分清洗細胞，每組中18副孔細胞培養基中分別加入溶酶、1 μmol/L AMP、1 μmol/L AMP及3 μmol/L CD73抑制劑5'-α,β-亞甲基-二磷酸腺苷（APCP）（AMP+ APCP），不同刺激方式均為6副孔。每孔中均加入分離自B6小鼠的CD4+ T細胞，密度為5×105個/ml。每組6副孔中，3孔細胞加入抗CD3抗體至0.2 μg/ml（增生組），用于刺激CD4+ T細胞的增生；3孔細胞不加入抗CD3抗體（本底組），用于增生反應本底的計算。16 h后每孔中加入1 uci [3H]-TdR。12 h后終止培養，使用Filtermate收集器收集細胞至含有GF/C濾膜的Unifilter 板。液體閃爍計數器測定放射性[3H]的摻入，以增生組減去本底組后放射強度表征該組別RPE細胞刺激CD4+ T細胞增生能力。
1.4 過繼免疫誘發EAU及MMP-9抑制劑干預
雌性野生型B6小鼠及CD73-/-小鼠，鼠齡20～24周，體重20 g，SPF級；由天津實驗動物中心提供。隨機選取B6小鼠32只，以過繼免疫方式誘導EAU，每只小鼠IRBP 1-20劑量為150 μg。將IRBP1-20與等容量弗氏完全佐劑充分混勻成乳劑，于小鼠背部皮下及尾根部進行多點注射，注射前4 h腹腔注射百日咳毒素100 ng。14 d后過量麻醉處死，收集脾臟及外周淋巴結組織，制成單細胞懸液。按1×107個/ml細胞密度接種至6孔培養板，加入IRBP1-20至終濃度為10 μg/ml。2 d后收集懸浮細胞，Ficoll密度梯度離心去除死細胞及紅細胞；計數后作為供體細胞。隨機選取B6小鼠及CD73-/-小鼠各8只，經腹腔注射5×106個供體細胞作為受體小鼠。不同受體小鼠均隨機分為MMP-9抑制劑干預組及未干預對照組，每組均為4只；過繼免疫后4、7、10 d視網膜下腔分別注射CTK8G1150或溶媒。自第8天開始，每2天行間接檢眼鏡檢查，進行EAU評分[13]。隨機選取B6小鼠4只作為正常對照組，不做任何處理。過繼免疫誘發EAU后14 d，每組隨機選取2只小鼠過量麻醉處死，摘除眼球。10%中性福爾馬林中固定；石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察眼底組織結構及有無淋巴細胞浸潤。
1.5 MMP-9抑制劑對體內RPE細胞CD73含量的影響
過繼免疫后14 d，每組隨機選取2只小鼠過量麻醉處死，摘除眼球，分離RPE細胞。半數RPE細胞以Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，實時定量PCR（RT-PCR）檢測RPE細胞中CD73 mRNA表達。以GAPDH為內參照，結果以2-△CT表示。另半數RPE細胞進行細胞膜蛋白提取，取200 μg膜蛋白行SDS-PAGE、轉膜，Western blot法測定細胞中CD73蛋白表達。所用初級抗體為兔抗小鼠CD73多克隆抗體，次級抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，鈉鉀ATP酶作為膜蛋白內參照。
1.6 統計學分析
采用SPSS16.0軟件行統計學處理。所有數據以均數±標準差（
±s）表示。組間比較采用單因素方差分析；組內兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
[3H]-TdR 摻入法檢測結果顯示，刺激方式為AMP時，C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組CD4+ T細胞增生能力較未干預對照組顯著下降，差異有統計學意義（F=13.28，P＜0.01）；溶媒、AMP+APCP時，兩組CD4+ T細胞增生能力比較，差異無統計學意義（F=7.78、6.58，P＞0.05）。C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組內CD4+ T細胞增生能力比較，AMP與溶媒、AMP+APCP差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1A）。CD73-/-MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組不同刺激方式CD4+ T細胞增生能力比較，差異均無統計學意義（F=5.24、6.12、7.04，P＞0.05）；CD73-/- MMP-9抑制劑干預組內CD4+ T細胞增生能力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖1B）。
圖1
C57BL/6、CD73-/- MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組不同干預方式RPE對CD4+ T細胞增生能力比較。1A示C57BL/6 RPE對CD4+ T細胞增生影響，*P＜0.05；1B示CD73-/- RPE對CD4+ T細胞增生影響
B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組EAU發病時間及病情評分均顯著低于未干預對照組（圖2A）；CD73-/-小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組發病時間、病情評分均無差異（圖2B）。
圖2
B6、CD73-/-受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組EAU發病時間及評分比較。2A、2B分別示B6、CD73-/-小鼠
過繼免疫后14 d，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組EAU評分較未干預對照組顯著降低，差異有統計學意義（F=13.87，P＜0.01）（圖3）。間接檢眼鏡檢查結果顯示，未干預對照組小鼠視網膜可見散在、多發的出血斑；MMP-9抑制劑干預組小鼠視網膜僅可見少量點狀滲出。光學顯微鏡觀察結果顯示，未干預對照組小鼠眼底組織結構破壞嚴重，可見明顯出血及細胞浸潤；MMP-9抑制劑干預組小鼠眼底僅可見輕微組織結構改變，無明顯出血及細胞浸潤（圖4）。
圖3
B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組過繼免疫后14 d EAU評分比較
圖4
B6受體小鼠病理組織像。4A、4B示未干預對照組，眼底組織結構破壞嚴重，可見明顯出血及細胞浸潤；4C、4D示MMP-9抑制劑干預組，眼底組織結構改變輕微，無明顯出血及細胞浸潤 HE 4A、4C ×4；4B、4D ×100
RT-PCR檢測結果顯示，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組以及正常對照組小鼠RPE細胞中CD73 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（F=6.54、7.02，P＞0.05）（圖5A）。Western blot檢測結果顯示，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、正常對照組小鼠RPE細胞中可見大量CD73蛋白表達，未干預對照組RPE細胞中CD73蛋白顯著降低（圖5B），差異有統計學意義（F=15.24、14.22，P＜0.01）（圖5C）。
圖5
B6小鼠正常對照組、未干預對照組、MMP-9抑制劑干預組RPE細胞中CD73 mRNA、蛋白表達比較。5A示不同組間CD73 mRNA表達結果；5B示電泳圖，不同組間CD73蛋白表達；5C示不同組間CD73蛋白表達結果。*P＜0.05
3 討論
除對眼底組織的支持、營養、保護等作用外，RPE細胞對局部免疫反應的調節作用近年來備受關注。生理條件下RPE細胞主要發揮免疫抑制作用，促使眼底組織處于免疫豁免狀態[14-15]。當某些病理因素存在時，RPE的免疫抑制功能明顯減弱，甚至表現出明顯的對免疫反應及炎癥的促進作用[16-17]。其中，炎癥發生時RPE細胞表面CD73含量的顯著下降也是誘發RPE免疫抑制功能減弱的重要因素。本研究嘗試以MMP-9抑制劑阻斷RPE細胞表面CD73的脫落，強化RPE的免疫抑制功能以治療EAU。結果顯示，MMP-9抑制劑CTK8G1150所干預的野生型RPE在AMP存在時對CD4細胞的增生刺激作用明顯減弱，并可被CD73抑制劑所拮抗。我們據此推論，CTK8G1150阻斷炎癥因子所誘發的RPE細胞表面CD73的脫落，CD73將AMP代謝為腺苷發揮對CD4細胞增生的抑制作用[18]。另外，本研究結果進一步證實CTK8G1150是通過調節CD73的含量變化以影響RPE細胞的功能，其原因是其在CD73-/-小鼠 RPE細胞中未表現出類似作用。
在上述結果基礎上，本研究觀察了給予CTK8G1150是否可阻斷體內RPE細胞表面CD73的脫落，并由此對EAU發揮保護作用。由于MMP-9自身對炎癥反應具有顯著調節作用，可直接影響T淋巴細胞的激活及遷移[19-20]。為盡量避免CTK8G1150的直接免疫調節作用，檢測其是否可通過影響RPE細胞表面CD73含量間接參與免疫調節，本研究以過繼免疫方式誘導EAU，避免MMP-9對外周T細胞激活的影響；采用視網膜下腔注射的方式體內給予CTK8G1150，減少其非眼底組織的作用；設立CD73-/-小鼠為EAU受體實驗，以確定CTK8G1150的作用依賴于CD73的存在。結果顯示，在EAU發生時RPE細胞表面CD73的含量急劇降低，CTK8G1150可在體內有效阻斷CD73的丟失。同時，各組小鼠RPE細胞中CD73 mRNA的表達無明顯差異。與我們此前報道的CD73在RPE細胞中含量的變化由酶解脫落所控制的結論相一致[9]。本研究結果充分證明MMP-9抑制劑在野生型B6受體小鼠中對過繼免疫誘發EAU的保護作用，CTK8G1150的作用依賴于眼底組織中CD73分子的存在。
本研究以過繼免疫EAU模型證實以MMP-9抑制劑阻斷RPE細胞中CD73的脫落可保護EAU，為免疫性葡萄膜炎的治療提供初步理論依據。但值得注意的是，雖然MMP-9在理論上可通過阻斷RPE細胞中CD73的脫落而對EAU具有保護作用，但其價值更多在于理論層面。由于MMP-9在體內有諸多生理作用，其抑制劑的體內應用具有很大不確定性。
三磷酸腺苷（ATP）及其代謝產物不僅是重要的能量代謝物質也具有顯著免疫調控作用[1-2]。當缺氧或局部炎癥發生時，ATP被大量釋放至胞外加重局部炎癥反應[3-5]。ATP在細胞外并不穩定，可被逐級酶解為腺苷。與ATP作用截然相反，腺苷具有顯著的免疫抑制功能[6-8]。位于細胞膜表面的5'-核苷酸酶CD73控制單磷酸腺苷（AMP）至腺苷的分解過程，是腺苷產生的限速酶。RPE細胞是眼底組織中唯一表達CD73的細胞，當炎癥發生時RPE細胞表面CD73含量急劇下降甚至轉為陰性，腺苷所發揮的免疫抑制功能顯著下降，從而促進炎癥的發生[9]。研究發現，RPE細胞表面CD73含量減少是由于MMP-9在Lys547-Phe548位點水解CD73，使得該分子自RPE細胞膜表面脫落所致[10]。CD73通過調節不同免疫細胞功能參與實驗性自身免疫葡萄膜炎（EAU）的關系研究尚少。本研究旨在驗證MMP-9抑制劑阻斷CD73自RPE細胞脫落，為葡萄膜炎的治療提供初步理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
選擇性MMP-9抑制劑CTK8G1150（美國eBioscience公司）；脂多糖（LPS）及TNF-α（美國Invitrogen 公司）；CD4+ T細胞分離試劑盒及抗小鼠CD3抗體（美國Stemcell公司），兔抗小鼠CD73多克隆抗體（美國 Santa Cruz公司）；氚標記胸腺嘧啶核苷（[3H]-TdR）（北京原子能研究所）。
1.2 小鼠RPE細胞分離和培養
雌性野生型C57BL/6、CD73基因敲除（CD73-/-）小鼠各4只。4周齡，體重10 g，無特定病原體（SPF）級；由天津實驗動物中心提供。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規定，并獲得天津醫科大學動物倫理委員會許可（許可號：TMUAC00281）。參照文獻[11-12]的方法分離RPE細胞，計數后接種于培養瓶中，以含10%胎牛血清（FBS）及雙抗RPMI 1640培養基進行培養，37 ℃、5%CO2分壓。待細胞達到80%融合時以0.2%的胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、傳代、凍存。取第3代細胞進行后續實驗。
1.3 [3H]-TdR 摻入法檢測RPE細胞對CD4+ T細胞增生的作用
傳代后的RPE細胞接種于96孔細胞培養板，每種細胞分別接種36副孔。待80%細胞融合后，給予50 ng/ml LPS、200 ng/ml TNF-α干預，激活RPE功能并誘發其表面CD73脫落。依據是否同時加入MMP-9抑制劑CTK8G1150（終濃度5.0 μmol/L）將每種細胞等分為C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組，CD73-/-MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組。48 h后充分清洗細胞，每組中18副孔細胞培養基中分別加入溶酶、1 μmol/L AMP、1 μmol/L AMP及3 μmol/L CD73抑制劑5'-α,β-亞甲基-二磷酸腺苷（APCP）（AMP+ APCP），不同刺激方式均為6副孔。每孔中均加入分離自B6小鼠的CD4+ T細胞，密度為5×105個/ml。每組6副孔中，3孔細胞加入抗CD3抗體至0.2 μg/ml（增生組），用于刺激CD4+ T細胞的增生；3孔細胞不加入抗CD3抗體（本底組），用于增生反應本底的計算。16 h后每孔中加入1 uci [3H]-TdR。12 h后終止培養，使用Filtermate收集器收集細胞至含有GF/C濾膜的Unifilter 板。液體閃爍計數器測定放射性[3H]的摻入，以增生組減去本底組后放射強度表征該組別RPE細胞刺激CD4+ T細胞增生能力。
1.4 過繼免疫誘發EAU及MMP-9抑制劑干預
雌性野生型B6小鼠及CD73-/-小鼠，鼠齡20～24周，體重20 g，SPF級；由天津實驗動物中心提供。隨機選取B6小鼠32只，以過繼免疫方式誘導EAU，每只小鼠IRBP 1-20劑量為150 μg。將IRBP1-20與等容量弗氏完全佐劑充分混勻成乳劑，于小鼠背部皮下及尾根部進行多點注射，注射前4 h腹腔注射百日咳毒素100 ng。14 d后過量麻醉處死，收集脾臟及外周淋巴結組織，制成單細胞懸液。按1×107個/ml細胞密度接種至6孔培養板，加入IRBP1-20至終濃度為10 μg/ml。2 d后收集懸浮細胞，Ficoll密度梯度離心去除死細胞及紅細胞；計數后作為供體細胞。隨機選取B6小鼠及CD73-/-小鼠各8只，經腹腔注射5×106個供體細胞作為受體小鼠。不同受體小鼠均隨機分為MMP-9抑制劑干預組及未干預對照組，每組均為4只；過繼免疫后4、7、10 d視網膜下腔分別注射CTK8G1150或溶媒。自第8天開始，每2天行間接檢眼鏡檢查，進行EAU評分[13]。隨機選取B6小鼠4只作為正常對照組，不做任何處理。過繼免疫誘發EAU后14 d，每組隨機選取2只小鼠過量麻醉處死，摘除眼球。10%中性福爾馬林中固定；石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察眼底組織結構及有無淋巴細胞浸潤。
1.5 MMP-9抑制劑對體內RPE細胞CD73含量的影響
過繼免疫后14 d，每組隨機選取2只小鼠過量麻醉處死，摘除眼球，分離RPE細胞。半數RPE細胞以Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，實時定量PCR（RT-PCR）檢測RPE細胞中CD73 mRNA表達。以GAPDH為內參照，結果以2-△CT表示。另半數RPE細胞進行細胞膜蛋白提取，取200 μg膜蛋白行SDS-PAGE、轉膜，Western blot法測定細胞中CD73蛋白表達。所用初級抗體為兔抗小鼠CD73多克隆抗體，次級抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，鈉鉀ATP酶作為膜蛋白內參照。
1.6 統計學分析
采用SPSS16.0軟件行統計學處理。所有數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析；組內兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
[3H]-TdR 摻入法檢測結果顯示，刺激方式為AMP時，C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組CD4+ T細胞增生能力較未干預對照組顯著下降，差異有統計學意義（F=13.28，P＜0.01）；溶媒、AMP+APCP時，兩組CD4+ T細胞增生能力比較，差異無統計學意義（F=7.78、6.58，P＞0.05）。C57BL/6 MMP-9抑制劑干預組內CD4+ T細胞增生能力比較，AMP與溶媒、AMP+APCP差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1A）。CD73-/-MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組不同刺激方式CD4+ T細胞增生能力比較，差異均無統計學意義（F=5.24、6.12、7.04，P＞0.05）；CD73-/- MMP-9抑制劑干預組內CD4+ T細胞增生能力比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖1B）。
圖1
C57BL/6、CD73-/- MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組不同干預方式RPE對CD4+ T細胞增生能力比較。1A示C57BL/6 RPE對CD4+ T細胞增生影響，*P＜0.05；1B示CD73-/- RPE對CD4+ T細胞增生影響
B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組EAU發病時間及病情評分均顯著低于未干預對照組（圖2A）；CD73-/-小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組發病時間、病情評分均無差異（圖2B）。
圖2
B6、CD73-/-受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組EAU發病時間及評分比較。2A、2B分別示B6、CD73-/-小鼠
過繼免疫后14 d，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組EAU評分較未干預對照組顯著降低，差異有統計學意義（F=13.87，P＜0.01）（圖3）。間接檢眼鏡檢查結果顯示，未干預對照組小鼠視網膜可見散在、多發的出血斑；MMP-9抑制劑干預組小鼠視網膜僅可見少量點狀滲出。光學顯微鏡觀察結果顯示，未干預對照組小鼠眼底組織結構破壞嚴重，可見明顯出血及細胞浸潤；MMP-9抑制劑干預組小鼠眼底僅可見輕微組織結構改變，無明顯出血及細胞浸潤（圖4）。
圖3
B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組過繼免疫后14 d EAU評分比較
圖4
B6受體小鼠病理組織像。4A、4B示未干預對照組，眼底組織結構破壞嚴重，可見明顯出血及細胞浸潤；4C、4D示MMP-9抑制劑干預組，眼底組織結構改變輕微，無明顯出血及細胞浸潤 HE 4A、4C ×4；4B、4D ×100
RT-PCR檢測結果顯示，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、未干預對照組以及正常對照組小鼠RPE細胞中CD73 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（F=6.54、7.02，P＞0.05）（圖5A）。Western blot檢測結果顯示，B6受體小鼠MMP-9抑制劑干預組、正常對照組小鼠RPE細胞中可見大量CD73蛋白表達，未干預對照組RPE細胞中CD73蛋白顯著降低（圖5B），差異有統計學意義（F=15.24、14.22，P＜0.01）（圖5C）。
圖5
B6小鼠正常對照組、未干預對照組、MMP-9抑制劑干預組RPE細胞中CD73 mRNA、蛋白表達比較。5A示不同組間CD73 mRNA表達結果；5B示電泳圖，不同組間CD73蛋白表達；5C示不同組間CD73蛋白表達結果。*P＜0.05
3 討論
除對眼底組織的支持、營養、保護等作用外，RPE細胞對局部免疫反應的調節作用近年來備受關注。生理條件下RPE細胞主要發揮免疫抑制作用，促使眼底組織處于免疫豁免狀態[14-15]。當某些病理因素存在時，RPE的免疫抑制功能明顯減弱，甚至表現出明顯的對免疫反應及炎癥的促進作用[16-17]。其中，炎癥發生時RPE細胞表面CD73含量的顯著下降也是誘發RPE免疫抑制功能減弱的重要因素。本研究嘗試以MMP-9抑制劑阻斷RPE細胞表面CD73的脫落，強化RPE的免疫抑制功能以治療EAU。結果顯示，MMP-9抑制劑CTK8G1150所干預的野生型RPE在AMP存在時對CD4細胞的增生刺激作用明顯減弱，并可被CD73抑制劑所拮抗。我們據此推論，CTK8G1150阻斷炎癥因子所誘發的RPE細胞表面CD73的脫落，CD73將AMP代謝為腺苷發揮對CD4細胞增生的抑制作用[18]。另外，本研究結果進一步證實CTK8G1150是通過調節CD73的含量變化以影響RPE細胞的功能，其原因是其在CD73-/-小鼠 RPE細胞中未表現出類似作用。
在上述結果基礎上，本研究觀察了給予CTK8G1150是否可阻斷體內RPE細胞表面CD73的脫落，并由此對EAU發揮保護作用。由于MMP-9自身對炎癥反應具有顯著調節作用，可直接影響T淋巴細胞的激活及遷移[19-20]。為盡量避免CTK8G1150的直接免疫調節作用，檢測其是否可通過影響RPE細胞表面CD73含量間接參與免疫調節，本研究以過繼免疫方式誘導EAU，避免MMP-9對外周T細胞激活的影響；采用視網膜下腔注射的方式體內給予CTK8G1150，減少其非眼底組織的作用；設立CD73-/-小鼠為EAU受體實驗，以確定CTK8G1150的作用依賴于CD73的存在。結果顯示，在EAU發生時RPE細胞表面CD73的含量急劇降低，CTK8G1150可在體內有效阻斷CD73的丟失。同時，各組小鼠RPE細胞中CD73 mRNA的表達無明顯差異。與我們此前報道的CD73在RPE細胞中含量的變化由酶解脫落所控制的結論相一致[9]。本研究結果充分證明MMP-9抑制劑在野生型B6受體小鼠中對過繼免疫誘發EAU的保護作用，CTK8G1150的作用依賴于眼底組織中CD73分子的存在。
本研究以過繼免疫EAU模型證實以MMP-9抑制劑阻斷RPE細胞中CD73的脫落可保護EAU，為免疫性葡萄膜炎的治療提供初步理論依據。但值得注意的是，雖然MMP-9在理論上可通過阻斷RPE細胞中CD73的脫落而對EAU具有保護作用，但其價值更多在于理論層面。由于MMP-9在體內有諸多生理作用，其抑制劑的體內應用具有很大不確定性。
