引用本文： 唐賀, 彭海鷹, 史平玲, 周鐘強, 魏圓夢, 李苗, 梁迎娟, 聶曉東, 黃愛國. RPGRIP1基因新突變致Leber先天性黑矇一家系. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 196-199. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20191008-00315 復制
Leber先天性黑矇（LCA）是一種少見的導致嬰幼兒先天性盲的嚴重遺傳性視網膜疾病，主要為常染色體隱性遺傳，偶為顯性遺傳[1]。多數患者出生時或出生不久即已失明，不能注視和追光；部分患者伴有眼球震顫、畏光及指壓征。不同患者眼底表現有所不同，部分患者眼底無明顯病變，但部分患者表現為視盤萎縮、視網膜血管變細、RPE和脈絡膜毛細血管層萎縮、視網膜脈絡膜萎縮、視網膜色素沉著、黃斑部色素沉著及黃斑缺損樣萎縮[1]。全視野ERG（ff-ERG）表現為a、b波平坦甚至消失[1]。目前確定的與LCA相關基因有26個，這些基因大多與光感受器外節發育、軸漿運輸、光感受器外節膜盤運輸等相關，而且同一基因中的不同突變還會造成不同的表型[2]。但是這些基因僅能夠解釋70%～80% LCA患者的發病原因[3]。本研究采用眼科基因診斷芯片并結合Sanger測序技術在一個中國漢族LCA家族中發現RPGRIP1基因新突變，現將其檢測結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為嚴格遵守赫爾辛基宣言，經河南省立眼科醫院倫理委員會批準[批文號：HNEECKY-2019（15號）]并取得受試者及未成年受試者監護人書面知情同意的回顧性研究。
2018年10月在河南省立眼科醫院就診的LCA一家系1例患者（先證者）和3名家系成員（圖1）納入研究。詳細詢問先證者病史并行物體注視性質、追隨試驗、裂隙燈顯微鏡、散瞳驗光、眼底照相、ff-ERG和1.5T MRI頭顱平掃檢查；家族成員行BCVA、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、驗光、眼底照相及ff-ERG檢查。
圖1
LCA患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先證者
采集先證者及其他3位受試者的外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存。采用磁珠法血液基因組提取試劑盒（康為試劑生物技術有限公司）按照標準操作流程提取全基因組DNA。使用NavoVue微型光度計（美國GE公司）檢測基因組DNA提取質量，符合要求的基因組DNA分裝后保存于–20 ℃待用。
采用北京中因科技有限公司自主開發設計的捕獲芯片以及美國安捷倫公司生產的SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb, 96, RO捕獲試劑盒，構建捕獲片段文庫。通過Illumina HiSeq高通量測序平臺測序，二代panel的平均測序深度為500×，數據量為1 G。對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。Sanger測序中，應用Primer 5.0引物設計軟件設計引物，由北京睿博興科生物技術有限公司合成。以基因組DNA為模板，PCR擴增目標片段。PCR擴增產物由北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。所有基因序列參考美國國立生物技術信息中心（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因組數據庫網站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
測序儀下機原始數據使用bcl2fastq將.bcl文件轉換成.fastq文件，并使用BWA、Samtools和Picard軟件將reads比對到人類參考基因組GRCh37/hg19，生成的.bam文件采用GATK系列軟件進行局部重新比對，重復序列去除并進行變異檢出。使用Annovar對.vcf變異文件進行變異注釋。致病變異位點篩選原則：（1）篩選ExAC數據庫、千人基因組計劃數據庫、gnomAD數據庫和北京中因科技有限公司Inhouse數據庫中未見正常人攜帶或攜帶頻率小于5%的變異。（2）使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster等多種蛋白功能預測軟件進行基因變異導致蛋白功能預測。（3）參考OMIM、HGMD、ClinVar等多種數據庫對變異位點進行致病性評估，對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）標準和指南[4]，對所有變異位點進行致病等級評估。
2 結果
先證者，女，年齡6個月，出生阿普加評分（Apgar）10分。自幼雙眼不追物但畏光，雙眼不能固視，游走性注視，呈粗而緩慢的鐘擺性眼球震顫，無指壓征。雙眼眼前節、玻璃體及視網膜未見明顯異常（圖2）。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統功能嚴重下降（圖3）。MRI檢查，白質髓鞘發育落后于同齡兒。患者父母及兄長均無LCA的典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳模式。
圖2
先證者雙眼彩色眼底像。2A示右眼；2B示左眼。雙眼視網膜均未見異常
圖3
先證者雙眼ff-ERG檢測像。3A示暗適應0.01 ERG；3B示暗適應3.0 ERG；3C示暗適應10.0 ERG；3D示暗適應3.0震蕩電位；3E示明適應3.0 ERG；3F示明適應3.0閃爍光ERG。雙眼均未檢測到明顯波形
先證者最終篩查出RPGRIP1基因存在2個突變，分別為c.1635dupA和c.3565C＞T。RPGRIP1基因共有24個外顯子，c.1635dupA突變位于第13號外顯子，是插入突變，在基因第1635位重復出現了一個堿基A，該突變遺傳自父親。c.3565C＞T突變位于第22號外顯子，是置換突變，基因第3565位的堿基C突變為堿基T，該突變遺傳自母親。針對該家系其他成員的RPGRIP1基因檢測發現，先證者父親為c.1635dupA雜合突變，先證者母親和兄長為c.3565C＞T雜合突變（圖4）。
圖4
LCA家系成員RPGRIP1基因測序峰圖。Ⅱ2：先證者；Ⅰ1：先證者父親；Ⅰ2：先證者母親；Ⅱ1：先證者兄長。M1為反向測序結果，顯示先證者及其父親都攜帶c.1635dupA突變；M2為正向測序結果，顯示先證者及其母親、兄長均攜帶c.3565C＞T突變
經過與數據庫的對比發現，c.1635dupA此前未見報道，為新發現突變；c.3565C＞T; p.Arg1189*是一個已知的致病突變，其在ExAC中的頻率為0.000 008 28，在gnomAD中的頻率為0.000 020 3，但是在這兩個數據庫和千人基因組計劃數據庫的東亞人群中頻率均為0。
先證者RPGRIP1基因攜帶的2個突變均造成了蛋白翻譯的提前終止，無法產生結構功能正常的蛋白產物。根據ACMG指南評估，c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2為可能致病的；c.3565C＞T; p.Arg1189*為致病的無義突變。
3 討論
根據RetNet數據庫（https://sph.uth.edu/RETNET/home.htm），目前確認與LCA相關的基因有26個，包括RPE65、LRAT、GUCY2D、CEP290、RPGRIP1等[5-8]。RPGRIP1基因位于14號常染色體，LCA發病人群中約有4%～6%與RPGRIP1基因突變相關[9]。RPGRIP1基因編碼一種與GTPase調節因子序列同源的蛋白質，存在于視錐、視桿細胞內外節中，與視錐、視桿細胞營養不良的發病有著密切關系[10]。本研究對一個LCA家系進行了研究，發現了RPGRIP1基因中一個東亞人群中未見報道的致病突變c.3565C＞T和一個新的可能致病突變c.1635dupA。
能夠引起遺傳性眼底病的RPGRIP1基因致病突變已經發現5個，都是隱性遺傳致病突變，其中4個致病突變均是由于堿基缺失或置換導致蛋白翻譯提前終止，包含本研究中檢測到的c.3565C＞T; p.Arg1189*[5]。另外1個致病突變是堿基置換突變，造成第746個氨基酸由中性的甘氨酸變成了堿性的精氨酸，可能造成了蛋白質功能域的重大變化[11]。RPGRIP1蛋白在視蛋白轉運、光感受器的正常生理活動中起著重要作用[12-13]。它與RPGR、SPATA7和NPHP4等蛋白相互作用，與遺傳性視網膜病變有著密切關系[14]。RPGRIP1基因的c.3565C＞T; p.Arg1189*突變為已知的致病突變，說明當該蛋白翻譯終止于第1189個氨基酸時，蛋白質已經無法完成正常功能。而本家系c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2突變導致蛋白質翻譯終止于第549個氨基酸，蛋白質產物較前者更短。既往有學者在視錐、視桿細胞營養不良的家族中也發現了RPGRIP1蛋白的第547個氨基酸發生了突變，但是其功能尚未明確[10]。綜合生物信息學分析結果，我們認為c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2這一突變極有可能也是一個致病突變，并將進一步對其進行蛋白質功能學的研究。此外，該突變在千人基因組計劃、ExAC和gnomAD等數據庫中均沒有記錄，說明其在人群中的頻率極低，甚至可能是東亞或漢族人群中所特有的一個致病突變。
本研究對一個LCA家系進行了研究，確定了該家系RPGRIP1的復合雜合突變。這不僅為將來可能進行的基因治療提供了治療靶點[15]，還為該家系未來優生優育提供了參考。該家系中發現的兩個致病突變，不僅擴充了我國RPGRIP1基因的突變譜，或許還說明我國具有獨特的致病基因遺傳多樣性，未來需要針對我國的遺傳性疾病進行更深入的群體遺傳學研究。
Leber先天性黑矇（LCA）是一種少見的導致嬰幼兒先天性盲的嚴重遺傳性視網膜疾病，主要為常染色體隱性遺傳，偶為顯性遺傳[1]。多數患者出生時或出生不久即已失明，不能注視和追光；部分患者伴有眼球震顫、畏光及指壓征。不同患者眼底表現有所不同，部分患者眼底無明顯病變，但部分患者表現為視盤萎縮、視網膜血管變細、RPE和脈絡膜毛細血管層萎縮、視網膜脈絡膜萎縮、視網膜色素沉著、黃斑部色素沉著及黃斑缺損樣萎縮[1]。全視野ERG（ff-ERG）表現為a、b波平坦甚至消失[1]。目前確定的與LCA相關基因有26個，這些基因大多與光感受器外節發育、軸漿運輸、光感受器外節膜盤運輸等相關，而且同一基因中的不同突變還會造成不同的表型[2]。但是這些基因僅能夠解釋70%～80% LCA患者的發病原因[3]。本研究采用眼科基因診斷芯片并結合Sanger測序技術在一個中國漢族LCA家族中發現RPGRIP1基因新突變，現將其檢測結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為嚴格遵守赫爾辛基宣言，經河南省立眼科醫院倫理委員會批準[批文號：HNEECKY-2019（15號）]并取得受試者及未成年受試者監護人書面知情同意的回顧性研究。
2018年10月在河南省立眼科醫院就診的LCA一家系1例患者（先證者）和3名家系成員（圖1）納入研究。詳細詢問先證者病史并行物體注視性質、追隨試驗、裂隙燈顯微鏡、散瞳驗光、眼底照相、ff-ERG和1.5T MRI頭顱平掃檢查；家族成員行BCVA、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、驗光、眼底照相及ff-ERG檢查。
圖1
LCA患者家系圖。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先證者
采集先證者及其他3位受試者的外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存。采用磁珠法血液基因組提取試劑盒（康為試劑生物技術有限公司）按照標準操作流程提取全基因組DNA。使用NavoVue微型光度計（美國GE公司）檢測基因組DNA提取質量，符合要求的基因組DNA分裝后保存于–20 ℃待用。
采用北京中因科技有限公司自主開發設計的捕獲芯片以及美國安捷倫公司生產的SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb, 96, RO捕獲試劑盒，構建捕獲片段文庫。通過Illumina HiSeq高通量測序平臺測序，二代panel的平均測序深度為500×，數據量為1 G。對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。Sanger測序中，應用Primer 5.0引物設計軟件設計引物，由北京睿博興科生物技術有限公司合成。以基因組DNA為模板，PCR擴增目標片段。PCR擴增產物由北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。所有基因序列參考美國國立生物技術信息中心（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因組數據庫網站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
測序儀下機原始數據使用bcl2fastq將.bcl文件轉換成.fastq文件，并使用BWA、Samtools和Picard軟件將reads比對到人類參考基因組GRCh37/hg19，生成的.bam文件采用GATK系列軟件進行局部重新比對，重復序列去除并進行變異檢出。使用Annovar對.vcf變異文件進行變異注釋。致病變異位點篩選原則：（1）篩選ExAC數據庫、千人基因組計劃數據庫、gnomAD數據庫和北京中因科技有限公司Inhouse數據庫中未見正常人攜帶或攜帶頻率小于5%的變異。（2）使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster等多種蛋白功能預測軟件進行基因變異導致蛋白功能預測。（3）參考OMIM、HGMD、ClinVar等多種數據庫對變異位點進行致病性評估，對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）標準和指南[4]，對所有變異位點進行致病等級評估。
2 結果
先證者，女，年齡6個月，出生阿普加評分（Apgar）10分。自幼雙眼不追物但畏光，雙眼不能固視，游走性注視，呈粗而緩慢的鐘擺性眼球震顫，無指壓征。雙眼眼前節、玻璃體及視網膜未見明顯異常（圖2）。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統功能嚴重下降（圖3）。MRI檢查，白質髓鞘發育落后于同齡兒。患者父母及兄長均無LCA的典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳模式。
圖2
先證者雙眼彩色眼底像。2A示右眼；2B示左眼。雙眼視網膜均未見異常
圖3
先證者雙眼ff-ERG檢測像。3A示暗適應0.01 ERG；3B示暗適應3.0 ERG；3C示暗適應10.0 ERG；3D示暗適應3.0震蕩電位；3E示明適應3.0 ERG；3F示明適應3.0閃爍光ERG。雙眼均未檢測到明顯波形
先證者最終篩查出RPGRIP1基因存在2個突變，分別為c.1635dupA和c.3565C＞T。RPGRIP1基因共有24個外顯子，c.1635dupA突變位于第13號外顯子，是插入突變，在基因第1635位重復出現了一個堿基A，該突變遺傳自父親。c.3565C＞T突變位于第22號外顯子，是置換突變，基因第3565位的堿基C突變為堿基T，該突變遺傳自母親。針對該家系其他成員的RPGRIP1基因檢測發現，先證者父親為c.1635dupA雜合突變，先證者母親和兄長為c.3565C＞T雜合突變（圖4）。
圖4
LCA家系成員RPGRIP1基因測序峰圖。Ⅱ2：先證者；Ⅰ1：先證者父親；Ⅰ2：先證者母親；Ⅱ1：先證者兄長。M1為反向測序結果，顯示先證者及其父親都攜帶c.1635dupA突變；M2為正向測序結果，顯示先證者及其母親、兄長均攜帶c.3565C＞T突變
經過與數據庫的對比發現，c.1635dupA此前未見報道，為新發現突變；c.3565C＞T; p.Arg1189*是一個已知的致病突變，其在ExAC中的頻率為0.000 008 28，在gnomAD中的頻率為0.000 020 3，但是在這兩個數據庫和千人基因組計劃數據庫的東亞人群中頻率均為0。
先證者RPGRIP1基因攜帶的2個突變均造成了蛋白翻譯的提前終止，無法產生結構功能正常的蛋白產物。根據ACMG指南評估，c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2為可能致病的；c.3565C＞T; p.Arg1189*為致病的無義突變。
3 討論
根據RetNet數據庫（https://sph.uth.edu/RETNET/home.htm），目前確認與LCA相關的基因有26個，包括RPE65、LRAT、GUCY2D、CEP290、RPGRIP1等[5-8]。RPGRIP1基因位于14號常染色體，LCA發病人群中約有4%～6%與RPGRIP1基因突變相關[9]。RPGRIP1基因編碼一種與GTPase調節因子序列同源的蛋白質，存在于視錐、視桿細胞內外節中，與視錐、視桿細胞營養不良的發病有著密切關系[10]。本研究對一個LCA家系進行了研究，發現了RPGRIP1基因中一個東亞人群中未見報道的致病突變c.3565C＞T和一個新的可能致病突變c.1635dupA。
能夠引起遺傳性眼底病的RPGRIP1基因致病突變已經發現5個，都是隱性遺傳致病突變，其中4個致病突變均是由于堿基缺失或置換導致蛋白翻譯提前終止，包含本研究中檢測到的c.3565C＞T; p.Arg1189*[5]。另外1個致病突變是堿基置換突變，造成第746個氨基酸由中性的甘氨酸變成了堿性的精氨酸，可能造成了蛋白質功能域的重大變化[11]。RPGRIP1蛋白在視蛋白轉運、光感受器的正常生理活動中起著重要作用[12-13]。它與RPGR、SPATA7和NPHP4等蛋白相互作用，與遺傳性視網膜病變有著密切關系[14]。RPGRIP1基因的c.3565C＞T; p.Arg1189*突變為已知的致病突變，說明當該蛋白翻譯終止于第1189個氨基酸時，蛋白質已經無法完成正常功能。而本家系c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2突變導致蛋白質翻譯終止于第549個氨基酸，蛋白質產物較前者更短。既往有學者在視錐、視桿細胞營養不良的家族中也發現了RPGRIP1蛋白的第547個氨基酸發生了突變，但是其功能尚未明確[10]。綜合生物信息學分析結果，我們認為c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2這一突變極有可能也是一個致病突變，并將進一步對其進行蛋白質功能學的研究。此外，該突變在千人基因組計劃、ExAC和gnomAD等數據庫中均沒有記錄，說明其在人群中的頻率極低，甚至可能是東亞或漢族人群中所特有的一個致病突變。
本研究對一個LCA家系進行了研究，確定了該家系RPGRIP1的復合雜合突變。這不僅為將來可能進行的基因治療提供了治療靶點[15]，還為該家系未來優生優育提供了參考。該家系中發現的兩個致病突變，不僅擴充了我國RPGRIP1基因的突變譜，或許還說明我國具有獨特的致病基因遺傳多樣性，未來需要針對我國的遺傳性疾病進行更深入的群體遺傳學研究。
