腺相關病毒載體（AAV）是目前最重要的病毒工具，已在基因治療領域得到廣泛應用；因其具有體積小、無包膜、無致病性等特點，故而是治療遺傳性視網膜疾病的主要手段之一。目前針對原癌基因酪氨酸激酶基因治療視網膜色素變性、ND4基因治療Leber遺傳性視神經病變以及Rab伴隨蛋白-1基因治療無脈絡膜癥的臨床試驗均發現約一半的患者視力改善。針對AAV基因治療Leber先天性黑矇、X連鎖視網膜劈裂癥、全色盲以及老年性黃斑變性的臨床試驗也正在開展。而關于Stargardt病、Usher 綜合征、真性小眼球的AAV基因治療尚在動物實驗或理論階段。目前AAV基因治療主要用于隱性遺傳性視網膜疾病，對于顯性遺傳性視網膜疾病需采用成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9技術等來干預。對于遺傳性視網膜疾病的治療，這將是一個重要且復雜的系統性工程，需投入更多人力物力共同參與和研究，期待在不久的將來能有大的突破。
引用本文： 沈科炯, 沈吟. 遺傳性視網膜疾病腺相關病毒載體基因治療新進展. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 242-248. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190705-00214 復制
遺傳性視網膜疾病是一組臨床表現多樣且危害嚴重的致盲性眼病，近年來已經發現271個致病基因突變。各國學者致力于研究遺傳性視網膜疾病的治療，逐漸重視應用病毒工具載體進行基因治療的可能性。自從有學者應用腺相關病毒載體（AAV）基因治療Leber先天性黑矇（LCA）2型患者獲得初步成功以后，大量研究者開始探索使用AAV基因治療視網膜色素變性（RP）、無脈絡膜癥（CHM）、Leber遺傳性視神經病變（LHON）、Stargardt病（STGD）、Usher 綜合征（USH）、X連鎖視網膜劈裂癥（XLRS）、全色盲（ACHM）和老年性黃斑變性（AMD）等其他遺傳性視網膜疾病上的可能性[1]。現就遺傳性視網膜疾病AAV基因治療的新進展作一綜述。
1 AAV概述
AAV是有4.7 kb基因組的單鏈DNA小病毒，是目前臨床應用中最具前景的病毒基因轉移載體之一，非常適合遺傳性眼病的基因治療[2-3]。靈長類動物可分離出12種不同血清型的AAV，其中AAV1～9的衣殼蛋白識別的受體主要分布于視網膜，均能感染視網膜組織并表達相應的蛋白[1, 4-6]（表1）。AAV作為基因轉運載體，具有以下特點[7]：（1）安全性。AAV不會誘發人類疾病，不能在人體內獨立復制，在人體的臨床試驗中顯示出非常安全的特性。（2）低免疫原性。AAV不會誘導產生強烈的T細胞反應，在動物實驗和臨床試驗中的免疫原性小，故安全性高。（3）不整合到宿主。AAV基因組以游離基因組的形式存在，不與宿主基因整合，可用于穩定期的終末細胞。（4）廣泛性。AAV可穩定感染不同組織中的分裂期或非分裂細胞，可在腦、肌、肝、肺、血管內皮、造血細胞等多種組織中長期穩定地表達轉基因。（5）穩定性。AAV可以在較大的pH和溫度范圍內保持相對穩定。
表1
不同細胞親和的血清型（部分）
AAV的基因組主要包含REP和CAP兩個基因，兩側有反向末端重復序列[2]。將REP和CAP替換為目的基因，形成重組AAV（rAAV），可在細胞內廣泛表達，并治療基因缺陷病。
2 AAV基因治療遺傳性視網膜疾病的應用進展
2.1 RP
RP是一組具有高度遺傳異質性的遺傳性視網膜變性，主要損壞視網膜光感受器細胞和RPE層。臨床表現為夜盲，周邊視野進行性縮小，最終累及中心視力而致視力完全喪失。迄今為止，通過連鎖分析和候選基因篩查的方法，已經確定96個基因與RP有關（https://sph.uth.edu/Retnet），如RPE65、視紫紅質（RHO）、原癌基因酪氨酸激酶（MERTK）、USH2A、三磷酸鳥苷酶調節因子（RPGR）、磷酸二酯酶6 B（PDE6B）等。
動物實驗研究發現，屑細胞極性復合體組分（CRB）1基因突變可導致嚴重的常染色體隱性遺傳RP[15]。CRB1的cDNA（4.2 kb）較大，用AAV攜帶傳遞困難，但CRB2的cDNA較小且功能與CRB1相似。Alves和Wijnholds[15]嘗試應用AAV2/9或AAV2/ShH10Y445F攜帶CRB2基因治療CRB2 敲除小鼠，結果證實CRB2基因有表達，基因治療有效。編碼雙桿環核苷酸門控（CNG）通道亞基的基因突變導致約4%的常染色體隱性RP。Michalakis等[16]對CNGB-/-的RP模型小鼠注射AAV2/1-Rho-CNGB1a-SV40，也成功阻斷了CNGB-/-模型小鼠最后發展為RP表型。
臨床試驗研究發現，MERTK編碼一種酪氨酸激酶，這種激酶是RPE細胞吞噬光感受器細胞外節所必需的，與一種罕見的常染色體隱性RP有關。2016年沙特阿拉伯臨床科學家Fowzan Alkuraya資助的臨床試驗（NCT01482195，http://www.clinicaltrials.gov.）研究AAV2-RPE特異性啟動子卵黃樣黃斑變性2（VMD2）-hMERTK的治療效果，6例患者接受了這種AAV2單眼的黃斑下注射[17]（表2）。其中3例患者視力得到了改善，但在2年隨訪期間，其中2例患者的視力逐漸降至治療前水平。RPGR基因突變與70%的X連鎖RP和大約20%的RP相關。RPGR在纖毛中編碼連接光感受器細胞內外節的轉運蛋白，在纖毛轉運光信號的過程中起著重要作用。2017年開始，許多針對RPGR基因突變的臨床試驗開始推進，如AAV8-RPGR（NCT03116113）、AAV-RPGR（NCT03252847）、rAAV2tYF-G蛋白偶聯受體激酶（GRK1）-RPGR （NCT03316560）等。在白種人群常染色體顯性RP中，RHO基因突變的發生率為25%。迄今，已發現150個RHO基因突變，用AAV基因治療方法治療有一定難度[18]。RP其他相關致病基因的AAV治療臨床試驗也在進行中，如研究AAV2/5-hPDE6B（NCT03328130）、AAV2-hRPE65v2（NCT03602820、NCT03597399）的臨床試驗等[1]。
表2
AAV基因治療遺傳性視網膜疾病的臨床試驗表
2.2 LHON
LHON是一種遺傳性線粒體視神經病變，由RGC死亡引起的進行性視神經萎縮，伴有相關的中央視野缺損、色覺減退和對比敏感度降低[18]。大多數LHON患者與編碼線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞單位的3個線粒體基因突變有關，即ND4（G11778A，第11 778位的鳥嘌呤核苷酸被替換為腺嘌呤核苷酸）、ND1（G3460A）和ND6（T14484C），而其中ND4突變約占一半[3]。2012年，Yu等[3]改造了AAV病毒粒子的衣殼，添加了線粒體靶向序列，使AAV定向到線粒體，從而可在線粒體中表達ND4基因。細胞實驗和小鼠實驗都可觀察到LHON G11778A突變細胞彌補了線粒體缺陷。Feuer等[19]報道玻璃體內注射scAAV2-P1ND4v2治療5例LHON患者的初步結果，其中2例患者視力得到了改善，但原因不明（NCT02161380）。Wan等[20]報道玻璃體內注射AAV2-ND4治療9例LHON患者的結果（NCT01267422），發現在9個月的隨訪期內，6例患者的視力得到改善且伴有視野的擴大。GenSight Biologics公司推進的ND4基因突變相關的臨床試驗也在進行中（NCT02652767、NCT02652780、NCT03293524、NCT03406104、NCT03672968）。
2.3 STGD
STGD是人類中最常見的常染色體隱性早發性黃斑變性，主要由三磷酸腺苷（ATP）結合盒亞族成員（ABCA）4基因突變，異常編碼光感受器細胞特異的ATP結合轉運蛋白引起。該ATP結合轉運蛋白表達于視桿細胞外節盤膜中，承擔視網膜內信息的跨膜傳遞和轉換。在缺乏該ATP結合轉運蛋白功能的情況下，視黃醛轉化成雙視黃醇，在視盤脫落和吞噬過程中沉積于RPE，最終引發RPE細胞死亡，并導致繼發性光感受器細胞變性。臨床主要表現為中心視力進行性下降。ABCA4基因編碼序列為 6822 bp，因其cDNA體量較大，超過了AAV的攜帶能力，學者們正在研究利用慢病毒等其他病毒工具來治療ABCA4缺陷引起的STGD[21]。Trapani[22]嘗試用兩種AAV各攜帶一半的ABCA4基因注射到小鼠和豬的ABCA-/-模型動物，證實在細胞內ABCA4基因可有效整合并表達，從而控制動物模型的STGD表型，為臨床試驗提供了理論基礎。
2.4 USH
USH是一組以RP及不同程度的聽力障礙為主要特征的常染色體隱性遺傳性疾病，具有高度的遺傳異質性，目前已發現16個相關致病基因。其中研究最多的基因之一是編碼肌球蛋白的MYO7A基因，該基因突變的臨床表型特點是RP和進行性聽力喪失，可能伴有前庭功能障礙。由于MYO7A的cDNA體量很大，已不適合用AAV攜帶，目前學者們正在研究除AAV外的其他病毒工具對USH進行基因治療的可行性[18]。USH Ⅲ型由1型肝素鉀（CLRN1）基因突變引起。CLRN1基因可編碼232個氨基酸的CLRN1。Dinculescu等[23]探索了CLRN1在視網膜內的表達定位，進而為探索USHⅢ型的發病機制和AAV治療USHⅢ型的原理提供了依據。
2.5 CHM
CHM是一種X連鎖隱性遺傳的視網膜變性疾病。其特征是在10～20歲之間發病，早期出現夜盲和周邊視力逐漸喪失，隨著年齡增長，中心視力逐漸下降。早期眼底赤道部可出現點片狀的脈絡膜萎縮及對應區域色素脫失，病變從周邊逐漸向后極部發展，脈絡膜毛細血管層和RPE層萎縮范圍也逐漸擴大，可見暴露的脈絡膜大血管[9, 18]。CHM是由編碼Rab伴隨蛋白（REP）1的CHM（1.9 kb）基因突變引起。目前，已發現超過110種不同的CHM基因突變導致的CHM。在眼外組織中，REP2彌補了REP1的缺失，因此疾病僅限于視網膜。Duong等[9]嘗試用AAV7m8攜帶CβA啟動子控制的hCHM基因處理有CHM基因缺陷的iPSC-RPE細胞，成功控制了iPSC-RPE細胞的基因缺陷。Spark Therapeutics公司正在推進應用AAV2-hCHM的臨床試驗（NCT02341807）。2014年牛津大學帶領的團隊報道了針對CHM的臨床試驗（NCT01461213），他們將rAAV2-REP1注射到6例患者的單眼玻璃體腔，隨訪觀察2年，在6個月時，治療眼的平均視力有所提高，但6例患者個體間差異較大，年齡最高、病理分期最晚的2例患者視力改善最為顯著[24]。該結果提示晚期CHM經過基因治療也能保住一定的視力。其他應用rAAV2-REP1的臨床試驗（NCT02077361、NCT02671539、NCT02407678、NCT02553135、NCT03507686、NCT03584165、NCT03496012）正在進行，目前尚未發表試驗結果。
2.6 LCA
LCA是一種嚴重致盲性遺傳性視網膜疾病，出生時或出生后1年內雙眼的錐桿細胞功能完全喪失，導致嬰幼兒先天性盲。已發現20多種與LCA相關的致病基因，包括RPE65、鳥苷酸環化酶2D、遺傳性錐體桿體同源框、RPGR相互作用蛋白1、CRB1和芳基烴受體相互作用蛋白1等。RPE65在RPE表達的相對分子質量65×103蛋白的功能類視黃酸異構水解酶，對RHO循環至關重要[18]。2008年，有3個獨立的小組報告了初步臨床基因治療的成功，證明能表達RPE65的AAV在視網膜下注射的安全性，從而改善了失明LCA患者的視力[1]。目前，為了更進一步的治療LCA，研究者們開展了多個針對RPE65的臨床試驗（NCT01208389、NCT00516477、NCT02781480、NCT02946879、NCT00749957、NCT00643747、NCT03602820、NCT00481546、NCT03597399、NCT00999609），其中Spark Therapeutics已經進行Ⅲ期臨床試驗（NCT00999609），同樣證明了用AAV2-hRPE65v2干預可提高眼對光的敏感度[25]。
2.7 XLRS
XLRS是由視網膜劈裂蛋白1（RS1）基因突變引起的遺傳性眼底病[26]。當RS1基因發生突變時，RSl蛋白的分泌和黏附功能發生障礙，導致視網膜發生劈裂[18]。XLRS的臨床特征是內層視網膜劈裂導致的黃斑區微囊樣車輪狀改變和黃斑中心凹劈裂，年輕男性的視覺功能障礙程度不一樣。玻璃體腔注射AAV8型載體（AAV8-scRS/IRBPhRS，NCT02317887）或突變的AAV2型載體（rAAV2tYF-CB-hRS1，NCT02416622）來基因治療XLRS的臨床試驗正在進行中。
2.8 ACHM
ACHM是一種罕見的常染色體隱性遺傳視錐細胞營養不良性疾病。患者通常從幼年起就表現為眼球震顫、視力低下以及嚴重畏光、色覺完全喪失或嚴重障礙。目前已確認6個基因與ACHM相關，包括激活轉錄因子6、環核苷酸門控通道（CNG）亞單位α3（A3）、CNG亞單位β3（B3）、G蛋白亞基轉導蛋白2、磷酸二酯酶6C和磷酸二酯酶6H。CNGA3和CNGB3基因分別編碼核苷酸門控通道的兩個亞基，大約50%的人攜帶CNGB3基因突變，25%的人攜帶CNGA3基因突變[18]。因此，研究者們正在嘗試AAV攜帶CNGA/CNGB基因的臨床試驗（NCT02610582、NCT03001310、NCT03758404、NCT03278873、NCT02935517、NCT02599922）。
2.9 AMD
AMD是復雜的多基因遺傳性眼病。目前已確定VEGF是新生血管性AMD患者中新生血管形成的主要介質。目前已有多種抗VEGF藥物治療方法取得了很重要的進展。而AAV基因治療效果可能會更持久，也不需要反復注射[1]。AAV攜帶目標基因單鏈抗體可變區基因片段、血管生成素1、抗VEGFA miRNAs和色素上皮衍生因子的基因，都能有效治療模型小鼠的脈絡膜血管增生，且未發現因注射抗VEGF抗體引起的免疫反應[10, 27-29]。
Heier等[30]和Rakoczy等[31-32]報道了視網膜下注射rAAV-sFLT01表達VEGF拮抗劑sFLT01用于治療 AMD的臨床試驗結果（NCT01024998、NCT01494805）。Adverum Biotechnologies，Inc.資助的臨床試驗（NCT03748784）中將AAV7m8-阿柏西普注射到黃斑變性患眼的玻璃體腔，以期持續表達阿柏西普來治療AMD。玻璃體腔注射表達VEGF抗體的rAAV RGX-314（NCT03066258）以及表達人補體因子的rAAV GT005（NCT03846193）治療AMD的臨床試驗正在進行。
2.10 真性小眼球
真性小眼球是胎兒發育過程中，眼球在胚胎裂閉合以后就停止進一步發育，故眼球體積較小，但無其他先天畸形。真性小眼球的臨床特征為小角膜、眼球前后徑小于18 mm、高度遠視（≥8D），其前房淺、房角窄、鞏膜厚、黃斑發育不良常合并閉角型青光眼。第一個被發現的與小眼球及閉角型青光眼相關的基因位點位于人的11號染色體 NNO1基因。在“江蘇眼病研究”中表明，膜卷曲相關蛋白（MFRP）的rs3814762單核苷酸多態性與原發性房角關閉相關[33]。2016年Collery等[34]對MFRP基因缺失斑馬魚的研究發現該基因突變與眼軸向長度減少并與遠視相關。Velez等[35]通過AAV2/8（Y733F）將MFRP導入Mfrprd6/Mfrprd6小鼠RPE，小鼠可恢復視網膜功能和正常眼球大小。這表明AAV基因治療可能有助于改善遠視及相關屈光不正。Li等[36]利用AAV感染MFRP突變的iPSC-RPE細胞和Mfrprd6/Mfrprd6小鼠，同樣能改善模型小鼠的表型。但由于動物模型理論結果不足，且難以確定基因治療的時間點，臨床上尚未正式開展臨床試驗。
3 展望
我們回顧了目前在研的所有遺傳性視網膜疾病的基因治療，其信息主要來自于http://www.clinicaltrials.gov.網站，更多的臨床試驗在更新和進展中。AAV治療遺傳性視網膜疾病是主要的治療手段之一，我們希望能夠對其機理、毒性反應、有效性和安全性進行完整的回顧。也期待在這個領域能有更多更快的進展，造福遺傳性視網膜疾病患者。
AAV基因治療遺傳性視網膜疾病具有美好前景，但目前仍有一些問題有待進一步研究。首先，AAV與細胞表面受體（AAVR）的結合方式尚未完全清楚，具體機制需要進一步研究[37-39]。機制的理解有助于探索更有效的衣殼改造方案，從而提高AAV的基因轉移效率，減少抗原性，提高細胞感染親和性，使AAV定向轉導特定的細胞，更有針對性的基因治療[39]。其次，用AAV進行動物實驗或臨床試驗時，病毒安全性仍需要重視。Xiong等[40]證明了視網膜下注射AAV時，AAV攜帶巨細胞病毒即早期啟動子、人泛素C啟動子、雞β肌動蛋白啟動子、RPE特異啟動子Best1時會引起小鼠的毒性反應，毒性反應強度與劑量呈正相關。而AAV攜帶人類紅視蛋白、RHO和RHO激酶以及鼠錐抑制蛋白等光感受器細胞特異性啟動子，則無毒性反應。AAV是否引起毒性反應與啟動子相關，與其攜帶的基因無關，同時與衣殼血清型、感染細胞也幾乎沒有相關性。
目前AAV基因治療主要用于隱性遺傳性視網膜疾病，對于顯性遺傳性視網膜疾病，需用成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9技術等來干預。對于遺傳性眼病的治療，這將是一個重要且復雜的系統性工程，需投入更多人力物力共同參與和研究，期待在不久的將來能有大的突破。
遺傳性視網膜疾病是一組臨床表現多樣且危害嚴重的致盲性眼病，近年來已經發現271個致病基因突變。各國學者致力于研究遺傳性視網膜疾病的治療，逐漸重視應用病毒工具載體進行基因治療的可能性。自從有學者應用腺相關病毒載體（AAV）基因治療Leber先天性黑矇（LCA）2型患者獲得初步成功以后，大量研究者開始探索使用AAV基因治療視網膜色素變性（RP）、無脈絡膜癥（CHM）、Leber遺傳性視神經病變（LHON）、Stargardt病（STGD）、Usher 綜合征（USH）、X連鎖視網膜劈裂癥（XLRS）、全色盲（ACHM）和老年性黃斑變性（AMD）等其他遺傳性視網膜疾病上的可能性[1]。現就遺傳性視網膜疾病AAV基因治療的新進展作一綜述。
1 AAV概述
AAV是有4.7 kb基因組的單鏈DNA小病毒，是目前臨床應用中最具前景的病毒基因轉移載體之一，非常適合遺傳性眼病的基因治療[2-3]。靈長類動物可分離出12種不同血清型的AAV，其中AAV1～9的衣殼蛋白識別的受體主要分布于視網膜，均能感染視網膜組織并表達相應的蛋白[1, 4-6]（表1）。AAV作為基因轉運載體，具有以下特點[7]：（1）安全性。AAV不會誘發人類疾病，不能在人體內獨立復制，在人體的臨床試驗中顯示出非常安全的特性。（2）低免疫原性。AAV不會誘導產生強烈的T細胞反應，在動物實驗和臨床試驗中的免疫原性小，故安全性高。（3）不整合到宿主。AAV基因組以游離基因組的形式存在，不與宿主基因整合，可用于穩定期的終末細胞。（4）廣泛性。AAV可穩定感染不同組織中的分裂期或非分裂細胞，可在腦、肌、肝、肺、血管內皮、造血細胞等多種組織中長期穩定地表達轉基因。（5）穩定性。AAV可以在較大的pH和溫度范圍內保持相對穩定。
表1
不同細胞親和的血清型（部分）
AAV的基因組主要包含REP和CAP兩個基因，兩側有反向末端重復序列[2]。將REP和CAP替換為目的基因，形成重組AAV（rAAV），可在細胞內廣泛表達，并治療基因缺陷病。
2 AAV基因治療遺傳性視網膜疾病的應用進展
2.1 RP
RP是一組具有高度遺傳異質性的遺傳性視網膜變性，主要損壞視網膜光感受器細胞和RPE層。臨床表現為夜盲，周邊視野進行性縮小，最終累及中心視力而致視力完全喪失。迄今為止，通過連鎖分析和候選基因篩查的方法，已經確定96個基因與RP有關（https://sph.uth.edu/Retnet），如RPE65、視紫紅質（RHO）、原癌基因酪氨酸激酶（MERTK）、USH2A、三磷酸鳥苷酶調節因子（RPGR）、磷酸二酯酶6 B（PDE6B）等。
動物實驗研究發現，屑細胞極性復合體組分（CRB）1基因突變可導致嚴重的常染色體隱性遺傳RP[15]。CRB1的cDNA（4.2 kb）較大，用AAV攜帶傳遞困難，但CRB2的cDNA較小且功能與CRB1相似。Alves和Wijnholds[15]嘗試應用AAV2/9或AAV2/ShH10Y445F攜帶CRB2基因治療CRB2 敲除小鼠，結果證實CRB2基因有表達，基因治療有效。編碼雙桿環核苷酸門控（CNG）通道亞基的基因突變導致約4%的常染色體隱性RP。Michalakis等[16]對CNGB-/-的RP模型小鼠注射AAV2/1-Rho-CNGB1a-SV40，也成功阻斷了CNGB-/-模型小鼠最后發展為RP表型。
臨床試驗研究發現，MERTK編碼一種酪氨酸激酶，這種激酶是RPE細胞吞噬光感受器細胞外節所必需的，與一種罕見的常染色體隱性RP有關。2016年沙特阿拉伯臨床科學家Fowzan Alkuraya資助的臨床試驗（NCT01482195，http://www.clinicaltrials.gov.）研究AAV2-RPE特異性啟動子卵黃樣黃斑變性2（VMD2）-hMERTK的治療效果，6例患者接受了這種AAV2單眼的黃斑下注射[17]（表2）。其中3例患者視力得到了改善，但在2年隨訪期間，其中2例患者的視力逐漸降至治療前水平。RPGR基因突變與70%的X連鎖RP和大約20%的RP相關。RPGR在纖毛中編碼連接光感受器細胞內外節的轉運蛋白，在纖毛轉運光信號的過程中起著重要作用。2017年開始，許多針對RPGR基因突變的臨床試驗開始推進，如AAV8-RPGR（NCT03116113）、AAV-RPGR（NCT03252847）、rAAV2tYF-G蛋白偶聯受體激酶（GRK1）-RPGR （NCT03316560）等。在白種人群常染色體顯性RP中，RHO基因突變的發生率為25%。迄今，已發現150個RHO基因突變，用AAV基因治療方法治療有一定難度[18]。RP其他相關致病基因的AAV治療臨床試驗也在進行中，如研究AAV2/5-hPDE6B（NCT03328130）、AAV2-hRPE65v2（NCT03602820、NCT03597399）的臨床試驗等[1]。
表2
AAV基因治療遺傳性視網膜疾病的臨床試驗表
2.2 LHON
LHON是一種遺傳性線粒體視神經病變，由RGC死亡引起的進行性視神經萎縮，伴有相關的中央視野缺損、色覺減退和對比敏感度降低[18]。大多數LHON患者與編碼線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ亞單位的3個線粒體基因突變有關，即ND4（G11778A，第11 778位的鳥嘌呤核苷酸被替換為腺嘌呤核苷酸）、ND1（G3460A）和ND6（T14484C），而其中ND4突變約占一半[3]。2012年，Yu等[3]改造了AAV病毒粒子的衣殼，添加了線粒體靶向序列，使AAV定向到線粒體，從而可在線粒體中表達ND4基因。細胞實驗和小鼠實驗都可觀察到LHON G11778A突變細胞彌補了線粒體缺陷。Feuer等[19]報道玻璃體內注射scAAV2-P1ND4v2治療5例LHON患者的初步結果，其中2例患者視力得到了改善，但原因不明（NCT02161380）。Wan等[20]報道玻璃體內注射AAV2-ND4治療9例LHON患者的結果（NCT01267422），發現在9個月的隨訪期內，6例患者的視力得到改善且伴有視野的擴大。GenSight Biologics公司推進的ND4基因突變相關的臨床試驗也在進行中（NCT02652767、NCT02652780、NCT03293524、NCT03406104、NCT03672968）。
2.3 STGD
STGD是人類中最常見的常染色體隱性早發性黃斑變性，主要由三磷酸腺苷（ATP）結合盒亞族成員（ABCA）4基因突變，異常編碼光感受器細胞特異的ATP結合轉運蛋白引起。該ATP結合轉運蛋白表達于視桿細胞外節盤膜中，承擔視網膜內信息的跨膜傳遞和轉換。在缺乏該ATP結合轉運蛋白功能的情況下，視黃醛轉化成雙視黃醇，在視盤脫落和吞噬過程中沉積于RPE，最終引發RPE細胞死亡，并導致繼發性光感受器細胞變性。臨床主要表現為中心視力進行性下降。ABCA4基因編碼序列為 6822 bp，因其cDNA體量較大，超過了AAV的攜帶能力，學者們正在研究利用慢病毒等其他病毒工具來治療ABCA4缺陷引起的STGD[21]。Trapani[22]嘗試用兩種AAV各攜帶一半的ABCA4基因注射到小鼠和豬的ABCA-/-模型動物，證實在細胞內ABCA4基因可有效整合并表達，從而控制動物模型的STGD表型，為臨床試驗提供了理論基礎。
2.4 USH
USH是一組以RP及不同程度的聽力障礙為主要特征的常染色體隱性遺傳性疾病，具有高度的遺傳異質性，目前已發現16個相關致病基因。其中研究最多的基因之一是編碼肌球蛋白的MYO7A基因，該基因突變的臨床表型特點是RP和進行性聽力喪失，可能伴有前庭功能障礙。由于MYO7A的cDNA體量很大，已不適合用AAV攜帶，目前學者們正在研究除AAV外的其他病毒工具對USH進行基因治療的可行性[18]。USH Ⅲ型由1型肝素鉀（CLRN1）基因突變引起。CLRN1基因可編碼232個氨基酸的CLRN1。Dinculescu等[23]探索了CLRN1在視網膜內的表達定位，進而為探索USHⅢ型的發病機制和AAV治療USHⅢ型的原理提供了依據。
2.5 CHM
CHM是一種X連鎖隱性遺傳的視網膜變性疾病。其特征是在10～20歲之間發病，早期出現夜盲和周邊視力逐漸喪失，隨著年齡增長，中心視力逐漸下降。早期眼底赤道部可出現點片狀的脈絡膜萎縮及對應區域色素脫失，病變從周邊逐漸向后極部發展，脈絡膜毛細血管層和RPE層萎縮范圍也逐漸擴大，可見暴露的脈絡膜大血管[9, 18]。CHM是由編碼Rab伴隨蛋白（REP）1的CHM（1.9 kb）基因突變引起。目前，已發現超過110種不同的CHM基因突變導致的CHM。在眼外組織中，REP2彌補了REP1的缺失，因此疾病僅限于視網膜。Duong等[9]嘗試用AAV7m8攜帶CβA啟動子控制的hCHM基因處理有CHM基因缺陷的iPSC-RPE細胞，成功控制了iPSC-RPE細胞的基因缺陷。Spark Therapeutics公司正在推進應用AAV2-hCHM的臨床試驗（NCT02341807）。2014年牛津大學帶領的團隊報道了針對CHM的臨床試驗（NCT01461213），他們將rAAV2-REP1注射到6例患者的單眼玻璃體腔，隨訪觀察2年，在6個月時，治療眼的平均視力有所提高，但6例患者個體間差異較大，年齡最高、病理分期最晚的2例患者視力改善最為顯著[24]。該結果提示晚期CHM經過基因治療也能保住一定的視力。其他應用rAAV2-REP1的臨床試驗（NCT02077361、NCT02671539、NCT02407678、NCT02553135、NCT03507686、NCT03584165、NCT03496012）正在進行，目前尚未發表試驗結果。
2.6 LCA
LCA是一種嚴重致盲性遺傳性視網膜疾病，出生時或出生后1年內雙眼的錐桿細胞功能完全喪失，導致嬰幼兒先天性盲。已發現20多種與LCA相關的致病基因，包括RPE65、鳥苷酸環化酶2D、遺傳性錐體桿體同源框、RPGR相互作用蛋白1、CRB1和芳基烴受體相互作用蛋白1等。RPE65在RPE表達的相對分子質量65×103蛋白的功能類視黃酸異構水解酶，對RHO循環至關重要[18]。2008年，有3個獨立的小組報告了初步臨床基因治療的成功，證明能表達RPE65的AAV在視網膜下注射的安全性，從而改善了失明LCA患者的視力[1]。目前，為了更進一步的治療LCA，研究者們開展了多個針對RPE65的臨床試驗（NCT01208389、NCT00516477、NCT02781480、NCT02946879、NCT00749957、NCT00643747、NCT03602820、NCT00481546、NCT03597399、NCT00999609），其中Spark Therapeutics已經進行Ⅲ期臨床試驗（NCT00999609），同樣證明了用AAV2-hRPE65v2干預可提高眼對光的敏感度[25]。
2.7 XLRS
XLRS是由視網膜劈裂蛋白1（RS1）基因突變引起的遺傳性眼底病[26]。當RS1基因發生突變時，RSl蛋白的分泌和黏附功能發生障礙，導致視網膜發生劈裂[18]。XLRS的臨床特征是內層視網膜劈裂導致的黃斑區微囊樣車輪狀改變和黃斑中心凹劈裂，年輕男性的視覺功能障礙程度不一樣。玻璃體腔注射AAV8型載體（AAV8-scRS/IRBPhRS，NCT02317887）或突變的AAV2型載體（rAAV2tYF-CB-hRS1，NCT02416622）來基因治療XLRS的臨床試驗正在進行中。
2.8 ACHM
ACHM是一種罕見的常染色體隱性遺傳視錐細胞營養不良性疾病。患者通常從幼年起就表現為眼球震顫、視力低下以及嚴重畏光、色覺完全喪失或嚴重障礙。目前已確認6個基因與ACHM相關，包括激活轉錄因子6、環核苷酸門控通道（CNG）亞單位α3（A3）、CNG亞單位β3（B3）、G蛋白亞基轉導蛋白2、磷酸二酯酶6C和磷酸二酯酶6H。CNGA3和CNGB3基因分別編碼核苷酸門控通道的兩個亞基，大約50%的人攜帶CNGB3基因突變，25%的人攜帶CNGA3基因突變[18]。因此，研究者們正在嘗試AAV攜帶CNGA/CNGB基因的臨床試驗（NCT02610582、NCT03001310、NCT03758404、NCT03278873、NCT02935517、NCT02599922）。
2.9 AMD
AMD是復雜的多基因遺傳性眼病。目前已確定VEGF是新生血管性AMD患者中新生血管形成的主要介質。目前已有多種抗VEGF藥物治療方法取得了很重要的進展。而AAV基因治療效果可能會更持久，也不需要反復注射[1]。AAV攜帶目標基因單鏈抗體可變區基因片段、血管生成素1、抗VEGFA miRNAs和色素上皮衍生因子的基因，都能有效治療模型小鼠的脈絡膜血管增生，且未發現因注射抗VEGF抗體引起的免疫反應[10, 27-29]。
Heier等[30]和Rakoczy等[31-32]報道了視網膜下注射rAAV-sFLT01表達VEGF拮抗劑sFLT01用于治療 AMD的臨床試驗結果（NCT01024998、NCT01494805）。Adverum Biotechnologies，Inc.資助的臨床試驗（NCT03748784）中將AAV7m8-阿柏西普注射到黃斑變性患眼的玻璃體腔，以期持續表達阿柏西普來治療AMD。玻璃體腔注射表達VEGF抗體的rAAV RGX-314（NCT03066258）以及表達人補體因子的rAAV GT005（NCT03846193）治療AMD的臨床試驗正在進行。
2.10 真性小眼球
真性小眼球是胎兒發育過程中，眼球在胚胎裂閉合以后就停止進一步發育，故眼球體積較小，但無其他先天畸形。真性小眼球的臨床特征為小角膜、眼球前后徑小于18 mm、高度遠視（≥8D），其前房淺、房角窄、鞏膜厚、黃斑發育不良常合并閉角型青光眼。第一個被發現的與小眼球及閉角型青光眼相關的基因位點位于人的11號染色體 NNO1基因。在“江蘇眼病研究”中表明，膜卷曲相關蛋白（MFRP）的rs3814762單核苷酸多態性與原發性房角關閉相關[33]。2016年Collery等[34]對MFRP基因缺失斑馬魚的研究發現該基因突變與眼軸向長度減少并與遠視相關。Velez等[35]通過AAV2/8（Y733F）將MFRP導入Mfrprd6/Mfrprd6小鼠RPE，小鼠可恢復視網膜功能和正常眼球大小。這表明AAV基因治療可能有助于改善遠視及相關屈光不正。Li等[36]利用AAV感染MFRP突變的iPSC-RPE細胞和Mfrprd6/Mfrprd6小鼠，同樣能改善模型小鼠的表型。但由于動物模型理論結果不足，且難以確定基因治療的時間點，臨床上尚未正式開展臨床試驗。
3 展望
我們回顧了目前在研的所有遺傳性視網膜疾病的基因治療，其信息主要來自于http://www.clinicaltrials.gov.網站，更多的臨床試驗在更新和進展中。AAV治療遺傳性視網膜疾病是主要的治療手段之一，我們希望能夠對其機理、毒性反應、有效性和安全性進行完整的回顧。也期待在這個領域能有更多更快的進展，造福遺傳性視網膜疾病患者。
AAV基因治療遺傳性視網膜疾病具有美好前景，但目前仍有一些問題有待進一步研究。首先，AAV與細胞表面受體（AAVR）的結合方式尚未完全清楚，具體機制需要進一步研究[37-39]。機制的理解有助于探索更有效的衣殼改造方案，從而提高AAV的基因轉移效率，減少抗原性，提高細胞感染親和性，使AAV定向轉導特定的細胞，更有針對性的基因治療[39]。其次，用AAV進行動物實驗或臨床試驗時，病毒安全性仍需要重視。Xiong等[40]證明了視網膜下注射AAV時，AAV攜帶巨細胞病毒即早期啟動子、人泛素C啟動子、雞β肌動蛋白啟動子、RPE特異啟動子Best1時會引起小鼠的毒性反應，毒性反應強度與劑量呈正相關。而AAV攜帶人類紅視蛋白、RHO和RHO激酶以及鼠錐抑制蛋白等光感受器細胞特異性啟動子，則無毒性反應。AAV是否引起毒性反應與啟動子相關，與其攜帶的基因無關，同時與衣殼血清型、感染細胞也幾乎沒有相關性。
目前AAV基因治療主要用于隱性遺傳性視網膜疾病，對于顯性遺傳性視網膜疾病，需用成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9技術等來干預。對于遺傳性眼病的治療，這將是一個重要且復雜的系統性工程，需投入更多人力物力共同參與和研究，期待在不久的將來能有大的突破。
