Usher綜合征（USH）是一種以先天性感音神經性聾和視覺功能進行性喪失為特征的遺傳性疾病，具有高度的遺傳異質性及臨床異質性，目前尚無有效的預防和治愈方法。目前已知USH有14個致病基因，USH2A突變是其最常見的原因。隨著對USH2A基因研究的深入，USH2A致病機制、動物模型建立、臨床診斷以及基于基因治療、細胞移植和RNA剪接的治療等方面研究皆取得了巨大進展。如，USH2A的突變導致參與外周纖毛區運輸功能的USH復合體蛋白產生缺陷；基于此致病機制的小鼠及斑馬魚動物模型被建立，但存在其各自局限性；通過成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9系統對患者來源誘導多功能干細胞進行糾正后，將其誘導為視器官以進行臨床的功能糾正性移植和基于反義寡核苷酸的RNA剪接治療在此病的治療中屬于前景性研究。
引用本文： 孟祥, 郭彤, 楊麗萍. Usher綜合征與USH2A基因的研究進展. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 236-241. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190123-00028 復制
Usher綜合征（USH）又稱遺傳性耳聾-視網膜色素變性（RP）綜合征，是一種以先天性感音神經性聾和視覺功能進行性喪失為特征的遺傳性疾病，伴或不伴有前庭功能障礙。其遺傳方式為常染色體隱性遺傳[1]。USH分為3種類型。Ⅰ型（USH1）為先天性雙側重度感音神經性耳聾（SNHL），前庭反應消失，青少年時期出現RP；Ⅱ型（USH2）為中重度SNHL，前庭反應正常，RP發生較晚；Ⅲ型（USH3）為進行性SNHL，前庭反應不確定，RP發生時間不確定。其中USH1最為嚴重，USH2最為常見[2]。研究表明，50%以上的USH患者和7%～23%的非綜合征性RP患者攜帶USH2A基因突變[3-6]。現就USH2A基因在USH中的最新研究進展作一綜述。
1 分子水平
USH2A基因位于人類染色體1q41，全長790 kb，由72個外顯子組成，編碼USH2A蛋白。USH2A蛋白包括異構體A和B。異構體A發現較早，相對分子質量171.5×103，由21個編碼外顯子翻譯、4641個核苷酸編碼以及異構體B的N端1546個氨基酸片段組成，包括1個層粘連蛋白樣結構域（LamGL）、1個層粘連蛋白N-末端結構域（LamNT）、10個層粘連蛋白表皮生長因子樣結構域（EGF-Lam）和2組Ⅲ型纖維連接蛋白結構域（FN3）重復序列，最常見于RPE細胞、光感受器細胞以及耳蝸、卵巢、輸卵管、睪丸和腸等組織的基底膜結構域中，被認為是一種分泌性細胞外蛋白[7]。異構體B相對分子質量580.0×103，由15 609個核苷酸編碼、5202個氨基酸組成，是一個包含很大胞外區域的跨膜蛋白。除了異構體A所包含的結構，異構體B還包括2個LamGL區域、28個FN3區域、1個跨膜序列以及1個胞內區，此胞內區c端有一個PDZ結合區域。異構體B主要分布于視網膜，在心臟及腎臟中也有表達，是視網膜中發揮主要作用的USH2A蛋白異構體[8]。有研究對USH2A基因外顯子進行突變篩查，結果顯示該基因上的突變占USH2患者的55%～90%[5, 9]。
在光感受器細胞內節頂部有一個包繞連接纖毛的領狀結構，被稱為外周纖毛區，其膜部參與囊泡運輸[10]。所有已知的USH1、USH2蛋白被發現存在于此區域[11]。USH2A蛋白也不例外，被固定在內節胞膜上，胞外結構域突出在外周纖毛區的基質中[12]。在外周纖毛區與連接纖毛膜之間有主要由USH2蛋白復合體組成的纖維狀連接，為外周纖毛區和連接纖毛提供結構支持，并可能參與光感受器細胞的發育，連接纖毛內節到外節囊泡物質的運輸以及外節膜盤的構成和更新[13-14]。USH2蛋白復合體主要由USH2A蛋白胞外區域即USH2A 蛋白異構體B（USH2A編碼）、ADGRV1蛋白胞外區域即ADGRV1b（USH2C編碼）與whirlin蛋白（USH2D編碼）3種USH2蛋白通過whirlin蛋白的 PDZ結構域與USH2A蛋白和ADGRV1蛋白的c端PDZ結合基序相互作用組成[15]。任何一種USH2蛋白的缺失功能效果等同于3種蛋白的缺失，導致USH2[13]。Dona等[16]提出，USH2A蛋白具有穩定另外兩種蛋白的功能，其缺陷會使USH2復合體whirlin蛋白和ADGRV1蛋白在光感受器膜上的定位降低。隨著PDZD7蛋白被發現作為修飾基因存在于USH2患者中，最近研究發現 PDZD7蛋白同樣參與此蛋白復合物的構成，并傾向于與ADGRV1蛋白結合[17]；USH1蛋白SANS也可提供此功能復合物與微管運輸之間的分子連接[10, 18]。除了外周纖毛區，一些研究者推論USH蛋白還存在于光感受器細胞突觸上[19]。但目前沒有光感受器細胞突觸功能缺陷小鼠動物模型的成功建立，也缺乏確鑿的證據證明USH2A蛋白存在于突觸區域[12]。
最近有研究發現，存在一種由USH1蛋白SANS與USH2蛋白USH2A、whirlin組成的復合物即三元USH1/USH2復合物（ternary USH1/USH2 complex），可能參與外節高爾基體來源，經內節向纖毛的動力蛋白復合物運輸[20]。USH蛋白之間可形成超分子USH蛋白復合物，但其作用機制仍不太清楚。可能還有更多的“功能性”蛋白質也被整合到這一USH復合物中，在共同的細胞機制中發揮作用。如，USH2A蛋白可通過中心小體上的中心體蛋白異構體B與導致Leber先天性黑矇的纖毛蛋白lebercilin連接，也可與膠原蛋白Ⅳ和纖連蛋白相互作用，這些都有可能參與此復合物的構成[21]。
2 基因型與臨床表型
目前已知USH有14個致病基因，其中USH2A、ADGRV1（USH2C）、WHRN（USH2D）和PDZD7共4個基因參與了USH2的發病。PDZD7被認為是whirlin蛋白（USH2D編碼）和harmonin蛋白（USH1C編碼）的同源體，PDZD7突變可作為修飾基因加劇USH2A基因突變患者的視網膜變性，也可與ADGRV1一起導致雙基因遺傳USH的發生[22-23]。
目前發現有超過600個突變分布在USH2A基因上，包括無義突變、移碼突變、剪接相關、錯義突變及內含子區變異等（http://www.lovd.nl/USH2A）。其最常見的2個突變位點為C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），均位于13號外顯子。其中，c.2299delG突變是最常見的，占15%～45%[24]，尤其常見于歐洲和美國；c.2276G＞T則是導致非綜合征性RP中最常見的突變位點。但有研究發現，盡管是同一個基因上同一位點的突變，在某些患者中會導致USH，而在其他患者中則表現為非綜合征性RP[5, 25]。有研究者認為，雙等位基因截短缺陷最常導致USH的發生，而至少1個USH2A亞效等位基因的存在通常會導致非綜合征RP的發生[26]。臨床視力進展方面，USH2A患者的主觀性視覺功能測驗往往更差，非綜合征性RP患者視網膜則殘存視錐細胞的功能[27]。與之相反，也有研究發現，USH2A患者和非綜合征性RP患者在視網膜疾病進展中并無明顯差異[28]。這兩種截然相反的結果可能是由于不同研究在對疾病的進展統計、跟蹤時間以及興趣基因型的差異造成的，此方面調查研究需要在統一標準下進行更大規模追蹤比較。
USH2的特點為先天性中度SNHL，聽力呈下降趨勢，但進展緩慢。前庭功能正常，因為有部分聽力，患者有語言鍛煉學習的機會，語言發育正常，運動功能正常。該型患者大多在青春期前后（20～30歲）出現視力下降，視野縮小等RP的臨床癥狀，可殘存部分視力及視野。當懷疑USH時，應進行聽力、前庭功能、視力、視野、ERG等檢查。正如前文所述，USH2A主要與纖毛功能有關。除USH之外，纖毛功能異常亦可導致Bardet-biedl綜合征、Joubert綜合征、Senior-Loken綜合征和某些形式的非綜合征性RP[29]。有幾種綜合征可能表現出與USH相似的臨床征象，應注意鑒別診斷。若伴有胰島素抵抗、2型糖尿病、高甘油三酯血癥、肝功能不全/腎功能衰竭等內分泌異常，則提示Alstr?m綜合征。若伴有肥胖、智力遲鈍或認知障礙以及多指和生殖系統異常等癥狀，可能是Bardet-Biedl綜合征的臨床表現。若觀察到X連鎖遺傳的家族史，或發現肌張力障礙或共濟失調，則應懷疑莫爾-特納布賈格綜合征[2]。致病基因診斷有助于上述疾病的臨床診斷。
3 實驗動物模型
大多數USH基因敲除小鼠模型已被建立，但出現可觀察到的視網膜變性的小鼠模型只有USH2A基因敲除小鼠[12]。Liu等[12]構建的USH2A基因敲除小鼠是唯一令人信服的USH疾病小鼠模型，其模型小鼠在20個月時，超過一半的光感受器細胞丟失，ERG a、b波振幅減弱。但也有學者認為，其構建的目的性USH2A敲除小鼠模型并不成功，因為此疾病模型發病年齡晚，僅表現為輕度視網膜變性。并且，該模型在被其他實驗室使用時，出生后623 d才出現比較明顯的視網膜形態變化[30]。這無法排除小鼠自身衰老因素影響，不具有說服力。另一種自發的突變小鼠模型昆明小鼠表現為自發性USH2A型，這個模型顯示了一種快速的、早期的視網膜變性[31]。但因為其包含了已知在遺傳性視網膜變性中存在的USH2A和PDE6B這2個基因突變，因此該模型也不具有典型代表性。更多更合適的USH動物模型需要被探索，或許人源化小鼠是可以考慮的一個方向。
USH小鼠疾病模型和患者疾病表型差異的原因尚不清楚，但推測其可能與人類和小鼠USH2A基因的突變位置、遺傳背景、蛋白質補償機制、壽命差異、非遺傳因素影響以及診斷措施的敏感性等有關[32]。另外，在人類光感受器細胞中發現的USH1和USH2蛋白的花萼狀突起和纖周膜在小鼠等嚙齒類動物中發育不良也可能是原因之一[33]。不過，該結構在甲骨魚等其他動物中發展得很好[34]。實驗室斑馬魚、日本鱈魚等甲骨魚類因其完整的基因組序列草稿（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka）、后代多、光感受器細胞死亡發病早、蛋白質序列相似性高等特點成為研究USH的良好模型[35-36]。Dona等[16]利用成簇規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（Cas9）基因敲除技術，將斑馬魚生殖細胞中USH2A基因表達的蛋白質截短（USH2Armc1：c.2337_2342delinsAC，p.Cys780GlnfsTer32和USH2Ab1245：c.15520_15523delinsTG，p.Ala5174Ter），得到了第一個表現早期發生視網膜功能障礙的USH動物模型。值得注意的是，斑馬魚睫狀體邊緣區的類干細胞的存在，使其有能力再生包括光感受器細胞在內的主要視網膜細胞[37]。而人類則不具有此特點，因此斑馬魚的疾病模型在應用于USH時，這是值得注意的很大差異。
4 治療
USH視網膜變性的治療策略包括針對特定基因異常的基因治療、細胞移植療法、減緩光感受器細胞變性或凋亡的治療如生長因子或鈣阻滯劑的應用、維生素補充和內源性視錐細胞存活因子等[38]。基因治療、細胞移植療法和基于反義寡核苷酸（AON）的RNA剪接治療被認為是非常有前景的治療措施。
基因治療為遺傳性視網膜變性最具前途的治療方法，主要包括基因替代治療和基因編輯治療。（1）基因替代治療，通常用病毒載體傳遞目的基因，到達靶細胞后經過轉錄，翻譯產生蛋白產物。旨在補償由于基因突變導致的內源性蛋白功能的缺失[39]。由于USH2A基因太大，因此不適于整個基因的替代治療。（2）基因編輯治療，即在DNA水平上糾正基因突變的編輯策略。國際范圍內，2017年12月20日美國食品和藥物管理局（FDA）批準了RPE65基因替代治療藥物（商品名Luxturna）用于治療RPE65基因突變導致的Leber先天性黑矇2型。2018年12月1日，CRISPR/Cas9基因編輯治療CEP290基因突變導致的Leber先天性黑矇10型的臨床試驗獲得美國FDA批準，遺傳性視網膜變性的基因治療具有很好的發展前景。針對USH2A基因片段長度較大，載體容量仍是一個需要考慮的重要問題。腺相關病毒載體（AAV）是一種小型的、非致病性的單鏈DNA病毒，介導光感受器細胞、RPE細胞和RGC的有效、持續轉染，廣泛應用于遺傳性視網膜變性的基因治療。第一代AAV2載體表達相對較慢，容量較小（4.7 kb）[40]；替代血清型及自我互補載體、雙AAV載體等的出現，為基因治療提供了范圍廣泛、表達速度更快、趨向性更強、載體容量更大的選擇[41]。但也有研究指出，有些載體傳遞目的基因的效果可能要差一些[42-43]。目前已有多項臨床評估證實重組AAV載體治療視網膜疾病具有很好的安全性和有效性[44-45]。這可能是未來載體選擇的一個參考依據和發展方向。
有研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯方法針對攜帶c.2299delG純合子突變的USH患者的成纖維細胞進行編輯，體外實現突變的成功修復[46]。最新已有研究團隊針對USH2A基因最常見兩個突變C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），利用CRISPR/spCas9系統設計sgRNA，通過HDR同源重組的方法，將患者來源細胞誘導的誘導多功能干細胞（iPSC）突變位點成功糾正，這將為后續臨床治療提供了很好的研究基礎[47]。考慮到細胞移植治療中，替換細胞攜帶致病突變與否、組織排斥等問題，可以移植前在患者來源的iPSCs上使用CRISPR/Cas9編輯系統進行基因定點修復，將修復過的iPSCs分化為RPE細胞或光感受器細胞后再移植到視網膜[48-50]。也有研究已成功構建移植了由iPSCs衍生的光感受器祖細胞的動物模型，移植后能與宿主雙極細胞形成功能性突觸，組織學和功能學上可部分恢復視覺功能[51]。但其價格成本、時間成本以及人類移植視覺功能有效性等方面，是臨床試驗之前需要被解決的問題。此外，利用CRISPR/Cas9技術修復突變后，RP動物模型的視覺功能可以恢復，這說明在體動物實驗也是可靠的[52]。因此，CRISPR/Cas9技術在USH2A疾病治療中是非常有前景的。
最近發現的深部內含子突變說明了USH中mRNA剪接突變這一致病機制的重要性[53-54]。USH2A基因的深部內含子突變（c.7595-2144A＞G）導致一個假外顯子（PE40）插入到成熟的USH2A轉錄本中，會產生一個非功能性的截短USH2A蛋白。有研究者利用AON在攜帶c.7595-2144A＞G突變的患者來源的成纖維細胞中，通過用AON與PE40剪接位點結合，抑制mRNA前體上PE40的剪切，進而實現基因的精準修復。AON不會改變內源性轉錄水平，設計相對容易，生產成本低，因此基于AON的剪接校正可能是一種很有前途的方法。然而值得注意的是，基于AON的治療需要注射裸露AON或使用重組病毒、設計的納米粒子、細胞穿透肽、胞外體或脂質體等穩定載體進入玻璃體去干擾剪接[55]。小鼠玻璃體內損傷實驗表明，有效作用時間大約1個月左右[56]。利用AAV包裹一個連接修飾的U7小核RNA AON序列可以實現相對持久的剪接校正效果[57-59]。但是，由于內界膜擴散屏障和中和抗體的存在極大影響AAV感染光感受器細胞的效率[60]。因此，可以考慮從AAV方面解決問題。一些基于AON的RNA剪接治療目前正處于或超過1、2或3期臨床試驗，以評估其治療潛力和生物安全性[61-63]。這顯示了治療此遺傳疾病的廣闊前景。
5 問題和展望
國內對USH的研究報道較少，可能與該病國內多為隱性遺傳的小家系、醫生沒有充分認識此病、臨床上許多患者被漏診或誤診為RP或重度SNHL均有關系。目前對USH的表型及基因型對應關系、自然病程等研究不多見，而這對于將來的臨床療效評價等是必要的。在優生優育方面，在致病基因診斷的基礎上，通過宣傳教育和遺傳咨詢，配合有效的產前診斷和人工流產可有效避免USH患兒的出生，提高人口素質。另外需要注意的是，與視覺表型和聽力缺陷有關的突變負擔的基因閾值可能存在。因此，非綜合征性RP和USH2A患者的功能性結果、患者的聽覺表型和等位基因等級等因素都應該考慮在內[27]。
無論是基因治療、細胞移植療法或是基于反義寡核苷酸的RNA剪接治療，皆存在其優點和局限性，若想應用到臨床研究，完備的細胞水平及動物實驗必不可少。確定各種治療的有效性和安全性是治療研究不得不考慮的重要問題。
Usher綜合征（USH）又稱遺傳性耳聾-視網膜色素變性（RP）綜合征，是一種以先天性感音神經性聾和視覺功能進行性喪失為特征的遺傳性疾病，伴或不伴有前庭功能障礙。其遺傳方式為常染色體隱性遺傳[1]。USH分為3種類型。Ⅰ型（USH1）為先天性雙側重度感音神經性耳聾（SNHL），前庭反應消失，青少年時期出現RP；Ⅱ型（USH2）為中重度SNHL，前庭反應正常，RP發生較晚；Ⅲ型（USH3）為進行性SNHL，前庭反應不確定，RP發生時間不確定。其中USH1最為嚴重，USH2最為常見[2]。研究表明，50%以上的USH患者和7%～23%的非綜合征性RP患者攜帶USH2A基因突變[3-6]。現就USH2A基因在USH中的最新研究進展作一綜述。
1 分子水平
USH2A基因位于人類染色體1q41，全長790 kb，由72個外顯子組成，編碼USH2A蛋白。USH2A蛋白包括異構體A和B。異構體A發現較早，相對分子質量171.5×103，由21個編碼外顯子翻譯、4641個核苷酸編碼以及異構體B的N端1546個氨基酸片段組成，包括1個層粘連蛋白樣結構域（LamGL）、1個層粘連蛋白N-末端結構域（LamNT）、10個層粘連蛋白表皮生長因子樣結構域（EGF-Lam）和2組Ⅲ型纖維連接蛋白結構域（FN3）重復序列，最常見于RPE細胞、光感受器細胞以及耳蝸、卵巢、輸卵管、睪丸和腸等組織的基底膜結構域中，被認為是一種分泌性細胞外蛋白[7]。異構體B相對分子質量580.0×103，由15 609個核苷酸編碼、5202個氨基酸組成，是一個包含很大胞外區域的跨膜蛋白。除了異構體A所包含的結構，異構體B還包括2個LamGL區域、28個FN3區域、1個跨膜序列以及1個胞內區，此胞內區c端有一個PDZ結合區域。異構體B主要分布于視網膜，在心臟及腎臟中也有表達，是視網膜中發揮主要作用的USH2A蛋白異構體[8]。有研究對USH2A基因外顯子進行突變篩查，結果顯示該基因上的突變占USH2患者的55%～90%[5, 9]。
在光感受器細胞內節頂部有一個包繞連接纖毛的領狀結構，被稱為外周纖毛區，其膜部參與囊泡運輸[10]。所有已知的USH1、USH2蛋白被發現存在于此區域[11]。USH2A蛋白也不例外，被固定在內節胞膜上，胞外結構域突出在外周纖毛區的基質中[12]。在外周纖毛區與連接纖毛膜之間有主要由USH2蛋白復合體組成的纖維狀連接，為外周纖毛區和連接纖毛提供結構支持，并可能參與光感受器細胞的發育，連接纖毛內節到外節囊泡物質的運輸以及外節膜盤的構成和更新[13-14]。USH2蛋白復合體主要由USH2A蛋白胞外區域即USH2A 蛋白異構體B（USH2A編碼）、ADGRV1蛋白胞外區域即ADGRV1b（USH2C編碼）與whirlin蛋白（USH2D編碼）3種USH2蛋白通過whirlin蛋白的 PDZ結構域與USH2A蛋白和ADGRV1蛋白的c端PDZ結合基序相互作用組成[15]。任何一種USH2蛋白的缺失功能效果等同于3種蛋白的缺失，導致USH2[13]。Dona等[16]提出，USH2A蛋白具有穩定另外兩種蛋白的功能，其缺陷會使USH2復合體whirlin蛋白和ADGRV1蛋白在光感受器膜上的定位降低。隨著PDZD7蛋白被發現作為修飾基因存在于USH2患者中，最近研究發現 PDZD7蛋白同樣參與此蛋白復合物的構成，并傾向于與ADGRV1蛋白結合[17]；USH1蛋白SANS也可提供此功能復合物與微管運輸之間的分子連接[10, 18]。除了外周纖毛區，一些研究者推論USH蛋白還存在于光感受器細胞突觸上[19]。但目前沒有光感受器細胞突觸功能缺陷小鼠動物模型的成功建立，也缺乏確鑿的證據證明USH2A蛋白存在于突觸區域[12]。
最近有研究發現，存在一種由USH1蛋白SANS與USH2蛋白USH2A、whirlin組成的復合物即三元USH1/USH2復合物（ternary USH1/USH2 complex），可能參與外節高爾基體來源，經內節向纖毛的動力蛋白復合物運輸[20]。USH蛋白之間可形成超分子USH蛋白復合物，但其作用機制仍不太清楚。可能還有更多的“功能性”蛋白質也被整合到這一USH復合物中，在共同的細胞機制中發揮作用。如，USH2A蛋白可通過中心小體上的中心體蛋白異構體B與導致Leber先天性黑矇的纖毛蛋白lebercilin連接，也可與膠原蛋白Ⅳ和纖連蛋白相互作用，這些都有可能參與此復合物的構成[21]。
2 基因型與臨床表型
目前已知USH有14個致病基因，其中USH2A、ADGRV1（USH2C）、WHRN（USH2D）和PDZD7共4個基因參與了USH2的發病。PDZD7被認為是whirlin蛋白（USH2D編碼）和harmonin蛋白（USH1C編碼）的同源體，PDZD7突變可作為修飾基因加劇USH2A基因突變患者的視網膜變性，也可與ADGRV1一起導致雙基因遺傳USH的發生[22-23]。
目前發現有超過600個突變分布在USH2A基因上，包括無義突變、移碼突變、剪接相關、錯義突變及內含子區變異等（http://www.lovd.nl/USH2A）。其最常見的2個突變位點為C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），均位于13號外顯子。其中，c.2299delG突變是最常見的，占15%～45%[24]，尤其常見于歐洲和美國；c.2276G＞T則是導致非綜合征性RP中最常見的突變位點。但有研究發現，盡管是同一個基因上同一位點的突變，在某些患者中會導致USH，而在其他患者中則表現為非綜合征性RP[5, 25]。有研究者認為，雙等位基因截短缺陷最常導致USH的發生，而至少1個USH2A亞效等位基因的存在通常會導致非綜合征RP的發生[26]。臨床視力進展方面，USH2A患者的主觀性視覺功能測驗往往更差，非綜合征性RP患者視網膜則殘存視錐細胞的功能[27]。與之相反，也有研究發現，USH2A患者和非綜合征性RP患者在視網膜疾病進展中并無明顯差異[28]。這兩種截然相反的結果可能是由于不同研究在對疾病的進展統計、跟蹤時間以及興趣基因型的差異造成的，此方面調查研究需要在統一標準下進行更大規模追蹤比較。
USH2的特點為先天性中度SNHL，聽力呈下降趨勢，但進展緩慢。前庭功能正常，因為有部分聽力，患者有語言鍛煉學習的機會，語言發育正常，運動功能正常。該型患者大多在青春期前后（20～30歲）出現視力下降，視野縮小等RP的臨床癥狀，可殘存部分視力及視野。當懷疑USH時，應進行聽力、前庭功能、視力、視野、ERG等檢查。正如前文所述，USH2A主要與纖毛功能有關。除USH之外，纖毛功能異常亦可導致Bardet-biedl綜合征、Joubert綜合征、Senior-Loken綜合征和某些形式的非綜合征性RP[29]。有幾種綜合征可能表現出與USH相似的臨床征象，應注意鑒別診斷。若伴有胰島素抵抗、2型糖尿病、高甘油三酯血癥、肝功能不全/腎功能衰竭等內分泌異常，則提示Alstr?m綜合征。若伴有肥胖、智力遲鈍或認知障礙以及多指和生殖系統異常等癥狀，可能是Bardet-Biedl綜合征的臨床表現。若觀察到X連鎖遺傳的家族史，或發現肌張力障礙或共濟失調，則應懷疑莫爾-特納布賈格綜合征[2]。致病基因診斷有助于上述疾病的臨床診斷。
3 實驗動物模型
大多數USH基因敲除小鼠模型已被建立，但出現可觀察到的視網膜變性的小鼠模型只有USH2A基因敲除小鼠[12]。Liu等[12]構建的USH2A基因敲除小鼠是唯一令人信服的USH疾病小鼠模型，其模型小鼠在20個月時，超過一半的光感受器細胞丟失，ERG a、b波振幅減弱。但也有學者認為，其構建的目的性USH2A敲除小鼠模型并不成功，因為此疾病模型發病年齡晚，僅表現為輕度視網膜變性。并且，該模型在被其他實驗室使用時，出生后623 d才出現比較明顯的視網膜形態變化[30]。這無法排除小鼠自身衰老因素影響，不具有說服力。另一種自發的突變小鼠模型昆明小鼠表現為自發性USH2A型，這個模型顯示了一種快速的、早期的視網膜變性[31]。但因為其包含了已知在遺傳性視網膜變性中存在的USH2A和PDE6B這2個基因突變，因此該模型也不具有典型代表性。更多更合適的USH動物模型需要被探索，或許人源化小鼠是可以考慮的一個方向。
USH小鼠疾病模型和患者疾病表型差異的原因尚不清楚，但推測其可能與人類和小鼠USH2A基因的突變位置、遺傳背景、蛋白質補償機制、壽命差異、非遺傳因素影響以及診斷措施的敏感性等有關[32]。另外，在人類光感受器細胞中發現的USH1和USH2蛋白的花萼狀突起和纖周膜在小鼠等嚙齒類動物中發育不良也可能是原因之一[33]。不過，該結構在甲骨魚等其他動物中發展得很好[34]。實驗室斑馬魚、日本鱈魚等甲骨魚類因其完整的基因組序列草稿（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka）、后代多、光感受器細胞死亡發病早、蛋白質序列相似性高等特點成為研究USH的良好模型[35-36]。Dona等[16]利用成簇規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（Cas9）基因敲除技術，將斑馬魚生殖細胞中USH2A基因表達的蛋白質截短（USH2Armc1：c.2337_2342delinsAC，p.Cys780GlnfsTer32和USH2Ab1245：c.15520_15523delinsTG，p.Ala5174Ter），得到了第一個表現早期發生視網膜功能障礙的USH動物模型。值得注意的是，斑馬魚睫狀體邊緣區的類干細胞的存在，使其有能力再生包括光感受器細胞在內的主要視網膜細胞[37]。而人類則不具有此特點，因此斑馬魚的疾病模型在應用于USH時，這是值得注意的很大差異。
4 治療
USH視網膜變性的治療策略包括針對特定基因異常的基因治療、細胞移植療法、減緩光感受器細胞變性或凋亡的治療如生長因子或鈣阻滯劑的應用、維生素補充和內源性視錐細胞存活因子等[38]。基因治療、細胞移植療法和基于反義寡核苷酸（AON）的RNA剪接治療被認為是非常有前景的治療措施。
基因治療為遺傳性視網膜變性最具前途的治療方法，主要包括基因替代治療和基因編輯治療。（1）基因替代治療，通常用病毒載體傳遞目的基因，到達靶細胞后經過轉錄，翻譯產生蛋白產物。旨在補償由于基因突變導致的內源性蛋白功能的缺失[39]。由于USH2A基因太大，因此不適于整個基因的替代治療。（2）基因編輯治療，即在DNA水平上糾正基因突變的編輯策略。國際范圍內，2017年12月20日美國食品和藥物管理局（FDA）批準了RPE65基因替代治療藥物（商品名Luxturna）用于治療RPE65基因突變導致的Leber先天性黑矇2型。2018年12月1日，CRISPR/Cas9基因編輯治療CEP290基因突變導致的Leber先天性黑矇10型的臨床試驗獲得美國FDA批準，遺傳性視網膜變性的基因治療具有很好的發展前景。針對USH2A基因片段長度較大，載體容量仍是一個需要考慮的重要問題。腺相關病毒載體（AAV）是一種小型的、非致病性的單鏈DNA病毒，介導光感受器細胞、RPE細胞和RGC的有效、持續轉染，廣泛應用于遺傳性視網膜變性的基因治療。第一代AAV2載體表達相對較慢，容量較小（4.7 kb）[40]；替代血清型及自我互補載體、雙AAV載體等的出現，為基因治療提供了范圍廣泛、表達速度更快、趨向性更強、載體容量更大的選擇[41]。但也有研究指出，有些載體傳遞目的基因的效果可能要差一些[42-43]。目前已有多項臨床評估證實重組AAV載體治療視網膜疾病具有很好的安全性和有效性[44-45]。這可能是未來載體選擇的一個參考依據和發展方向。
有研究團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯方法針對攜帶c.2299delG純合子突變的USH患者的成纖維細胞進行編輯，體外實現突變的成功修復[46]。最新已有研究團隊針對USH2A基因最常見兩個突變C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），利用CRISPR/spCas9系統設計sgRNA，通過HDR同源重組的方法，將患者來源細胞誘導的誘導多功能干細胞（iPSC）突變位點成功糾正，這將為后續臨床治療提供了很好的研究基礎[47]。考慮到細胞移植治療中，替換細胞攜帶致病突變與否、組織排斥等問題，可以移植前在患者來源的iPSCs上使用CRISPR/Cas9編輯系統進行基因定點修復，將修復過的iPSCs分化為RPE細胞或光感受器細胞后再移植到視網膜[48-50]。也有研究已成功構建移植了由iPSCs衍生的光感受器祖細胞的動物模型，移植后能與宿主雙極細胞形成功能性突觸，組織學和功能學上可部分恢復視覺功能[51]。但其價格成本、時間成本以及人類移植視覺功能有效性等方面，是臨床試驗之前需要被解決的問題。此外，利用CRISPR/Cas9技術修復突變后，RP動物模型的視覺功能可以恢復，這說明在體動物實驗也是可靠的[52]。因此，CRISPR/Cas9技術在USH2A疾病治療中是非常有前景的。
最近發現的深部內含子突變說明了USH中mRNA剪接突變這一致病機制的重要性[53-54]。USH2A基因的深部內含子突變（c.7595-2144A＞G）導致一個假外顯子（PE40）插入到成熟的USH2A轉錄本中，會產生一個非功能性的截短USH2A蛋白。有研究者利用AON在攜帶c.7595-2144A＞G突變的患者來源的成纖維細胞中，通過用AON與PE40剪接位點結合，抑制mRNA前體上PE40的剪切，進而實現基因的精準修復。AON不會改變內源性轉錄水平，設計相對容易，生產成本低，因此基于AON的剪接校正可能是一種很有前途的方法。然而值得注意的是，基于AON的治療需要注射裸露AON或使用重組病毒、設計的納米粒子、細胞穿透肽、胞外體或脂質體等穩定載體進入玻璃體去干擾剪接[55]。小鼠玻璃體內損傷實驗表明，有效作用時間大約1個月左右[56]。利用AAV包裹一個連接修飾的U7小核RNA AON序列可以實現相對持久的剪接校正效果[57-59]。但是，由于內界膜擴散屏障和中和抗體的存在極大影響AAV感染光感受器細胞的效率[60]。因此，可以考慮從AAV方面解決問題。一些基于AON的RNA剪接治療目前正處于或超過1、2或3期臨床試驗，以評估其治療潛力和生物安全性[61-63]。這顯示了治療此遺傳疾病的廣闊前景。
5 問題和展望
國內對USH的研究報道較少，可能與該病國內多為隱性遺傳的小家系、醫生沒有充分認識此病、臨床上許多患者被漏診或誤診為RP或重度SNHL均有關系。目前對USH的表型及基因型對應關系、自然病程等研究不多見，而這對于將來的臨床療效評價等是必要的。在優生優育方面，在致病基因診斷的基礎上，通過宣傳教育和遺傳咨詢，配合有效的產前診斷和人工流產可有效避免USH患兒的出生，提高人口素質。另外需要注意的是，與視覺表型和聽力缺陷有關的突變負擔的基因閾值可能存在。因此，非綜合征性RP和USH2A患者的功能性結果、患者的聽覺表型和等位基因等級等因素都應該考慮在內[27]。
無論是基因治療、細胞移植療法或是基于反義寡核苷酸的RNA剪接治療，皆存在其優點和局限性，若想應用到臨床研究，完備的細胞水平及動物實驗必不可少。確定各種治療的有效性和安全性是治療研究不得不考慮的重要問題。