引用本文： 宋昊剛, 王樂, 趙君. SOX11在視網膜母細胞瘤中的表達及意義. 中華眼底病雜志, 2020, 36(6): 430-434. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190509-00175 復制
視網膜母細胞瘤（RB）是一種來源于光感受器前體細胞的惡性腫瘤，常見于3歲以下兒童；其具有家族遺傳傾向，可單眼、雙眼先后或同時罹患，是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，對兒童的視力和生命有著重大威脅。SOX11是性別決定基因-睪丸決定因子SRY基因家族中的一員，在正常視網膜神經細胞中表達，參與調控的細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路在胚胎發育、眼神經形成和Rb蛋白的表達中起重要作用[1]。為探究SOX11在RB發生發展中的確切作用，本研究利用R2數據分析平臺分析了GEO數據庫中76例RB患者病理組織的測序資料，觀察其在不同亞型RB中的表達、關聯基因和信號通路，以期為RB的早期診斷及進一步治療提供新的線索。現將結果報道如下。
1 對象和方法
在美國國家生物技術信息中心的GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載包含76例RB患者癌組織全mRNA表達譜的公共數據集gse59983。參照文獻[2]的方法，根據15個標記基因表達情況將其分為3組。細胞周期標記基因：E2F1、E2F2、E2F3、PCNA、CCNE1（組1）；視椎光感受器標記基因：PDE6C、PDE6H、GNAT2、OPN1SW、AAR3（組2）；視桿光感受器標記基因：RHO、CNGB1、ROM1、PDE6G、CNGA1（組3）。組1包含26例患者，該組細胞周期標記基因表達最高，視椎及視桿光感受器標記基因表達相對較低。組2包含4例患者，該組視桿及視椎光感受器標記基因表達高，而細胞周期標記基因表達低。組3包含46例患者，該組視椎光感受器標記基因及細胞周期標記基因表達高，而視桿光感受器標記基因表達低。
患者癌組織取自荷蘭的國家RB轉診中心，即阿姆斯特丹自由大學醫學中心。患者手術前未接受放射治療、化學藥物治療等其他治療。手術后腫瘤樣本冰凍于液氮中并轉入－80 ℃冰箱保存。病理診斷由一名經驗豐富的RB病理學專家確定，并由一位眼科醫生或兒科腫瘤專家驗證。腫瘤位置由眼科醫生根據眼底檢查或眼底照片確定。冰凍組織標本RNA經Trizol試劑提取并通過勻漿器研磨均勻，RNA濃度用ND-1000分光光度計測定，RNA的質量和完整性通過Agilent2100生物分析儀評估。
分析gse59983公共數據集，觀察SOX11在RB中的表達，找到SOX11相關基因。根據基因相關性，繪制聚類熱圖。再對與SOX11表達相關的基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析和基因注釋（GO）通路富集分析。關聯基因分析、聚類熱圖、KEGG及GO基因富集分析均在R2生物信息平臺（http://r2.amc.nl）上進行。三組患者癌組織中SOX11的表達比較采用兩兩之間的秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SOX11在RB中的表達
組1患者癌組織中SOX11表達明顯高于組2、組3，差異均有統計學意義（P＜0.05）；組3患者癌組織中SOX11表達明顯高于組2，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。
圖1
3組患者癌組織中SOX11表達比較
2.2 與SOX11相關的基因
利用R2分析平臺對gse59983公共數據集中76例RB患者癌組織mRNA數據進行統計分析，共檢測出與SOX11表達顯著相關的基因4524個。其中，正相關基因2139個，負相關基因2385個。在細胞周期標記基因中，E2F1、E2F2、PCNA、CCNE1與SOX11表達呈顯著正相關（P＜0.001），E2F3與SOX11表達無顯著相關（P＜0.001）。在視椎光感受器標記基因中，GNAT2與SOX11表達呈顯著負相關（P＜0.001），PDE6C、PDE6H、OPN1SW、AAR3與SOX11表達無顯著相關（P＞0.05）。在視桿光感受器標記基因中，CNGB1、ROM1、PDE6G與SOX11表達呈顯著負相關（P＜0.001），RHO、CNGA1與SOX11表達無顯著相關（P＞0.05）（表1）。篩選SOX11及與其關聯性最強的16個基因繪制聚類熱圖，SOX11與SOX11顯著關聯基因的聚類形式和原始形式大致相同（圖2）。篩選出與SOX11表達顯著關聯且作用于細胞周期的基因繪制聚類熱圖，聚類形式與原始形式進一步契合。
表1
前14位與SOX11表達正負相關基因
圖2
SOX11及16個相關基因聚類熱圖。綠色為組2，紅色為組1，藍色為組3
2.3 與SOX11相關通路分析
KEGG分析結果顯示，與SOX11相關的4524個基因中，有1577個基因涉及21個信號通路，主要包括細胞周期、DNA復制、剪接體、堿基切除修復、嘌呤核苷酸代謝、光感傳導、P53信號通路等（表2）。GO分析結果顯示，SOX11及其關聯表達基因主要涉及有絲分裂細胞周期、細胞凋亡、光感受器細胞發育、光感受器細胞保護通路等（表3）。
表2
與SOX11相關基因的KEGG分析結果
表3
與SOX11相關基因的GO分析結果
2.4 與細胞周期相關信號通路圖
根據與SOX11顯著相關且作用于細胞周期基因繪制KEGG信號通路圖（圖3）。在G1期，Rb與組蛋白去乙酰化酶（HDAC）結合，同時CDK2抑制轉錄因子E2F1及E2F2磷酸化，使E2F1、E2F2與Rb解體，停滯的G1期被激活，細胞無限增生的障礙得以解除。
圖3
KEGG信號通路圖
3 討論
隨著基因測序技術的進展，已有研究發現RB具有相似的表達譜，所表達的基因參與諸多分化進程[3]。但是，RB也存在異質性。有研究通過基因表達譜確認了RB的兩種亞型分別起源于祖細胞及視錐光感受器前體細胞[4]。這為其診斷和治療帶來了新的挑戰。通過基因檢測來實現早期診斷和靶向治療正逐漸成為研究熱點。
Rb1基因是最早發現的抑癌基因，定位于染色體13q14.2上，在RB的發生發展中起重要作用。目前發現諸多與Rb1相關的信號通路，與細胞周期調控及細胞凋亡密切相關，包括Cdkn2a/Rb1腫瘤抑制通路、P53信號凋亡通路、ERK信號通路等。其中Cdkn2a/Rb1通路中，CDK2激活使Rb蛋白與E2F因子解離，細胞無限增生能力激活，是腫瘤細胞形成的關鍵。ERK信號通路調控Rb蛋白活性及RHO家族的表達。RHO基因的表達對于視桿光感受器的發育至關重要[5]。
SOX11基因是位于染色體2p25的編碼轉錄因子，主要參與胚胎發育、細胞凋亡和神經形成。SOX11是診斷套細胞淋巴瘤（MCL）的標記物之一。已有研究表明，SOX11的低表達往往提示MCL預后不良[6]。在許多實體腫瘤中也提示SOX11存在異常表達。Teng等[7]發現，血清SOX11甲基化水平與甲胎蛋白結合可以提高診斷乙肝型肝癌的敏感性。SOX11在肝癌中通過Wnt/β-catenin通路調節細胞周期和凋亡[8]。Zhang等[9]發現，SOX11在鼻咽癌中屬于抑癌基因，提高SOX11的表達可以抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。Xu等[10]發現，SOX11在胃癌細胞株和胃癌組織中都有所下調，胃癌組織中SOX11啟動子甲基化陽性率（55.1%）顯著高于非癌組織（7.9%）。SOX11主要參與調節兩條信號通路，植入前胚胎及ERK信號通路。ERK信號通路調控Rb蛋白活性及光感受器發育[11]。在RB、乳腺癌、口腔癌等惡性腫瘤中均發現ERK信號通路的過度激活，其直接下調Rb蛋白活性，使其與E2F因子解離，細胞分裂增生失去限制。SOX11在RB中的作用機制及表達情況值得深入探討。
R2分析平臺是由荷蘭阿姆斯特丹學術醫學中心開發，提供給生物學家進行基因組分析的平臺；其包含TCGA、GEO等可公開訪問數據庫的數據，并提供一組工具，便于生物學家用生物信息學方法對公共數據庫進行分析。本研究利用R2數據分析平臺分析了GEO數據庫中76例RB患者病理組織的測序數據，觀察其在不同亞型RB中的表達、關聯基因和信號通路。結果顯示，SOX11在三組中存在差異表達。在組1中，SOX11表達程度最高。為了進一步驗證SOX11在不同亞型Rb組織中的表達是否存在差異，我們選取了前16位與SOX11表達顯著相關的基因，合并SOX11，繪制聚類熱圖。組2（綠色）相關基因表達最低，歸為一組。組1（紅色）被分為兩部分，組1中15例樣本與組3（藍色）中1例樣本相關基因表達最高，歸為一組。組3及部分組2中SOX11及相關基因表達適中。繪制SOX11及SOX11表達相關基因的聚類熱圖時，隨著基因數量增多，聚類熱圖分組越接近原始分組。有趣的是，無論如何調整選取基因的數量，組2中的4例樣本，總會被歸為一組。這提示SOX11的表達情況或許可以反應不同類型或不同時期的RB，組1與組3代表兩種類型或兩個階段的RB組織，組2或許混入了正常的視網膜組織。
與SOX11表達呈顯著正相關的基因中，E2F1隨著與Rb蛋白解離，其功能得到激活，使停滯在G1期的細胞繼續分裂。CENPF編碼的蛋白可以在有絲分裂中使染色體分離。CENPF同時可以調節Rb蛋白活性來影響細胞的分裂和增生。其余如BIRC5、KPNA2和CKS1B等所編碼的蛋白質均作用于細胞周期，促進細胞增生。GO分析結果顯示，SOX11及其相關基因涉及通路主要調控有絲分裂細胞周期、細胞凋亡以及光感受器的發育和保護。以上研究說明，SOX11及其表達正相關的基因在細胞周期中可能起協同作用，如果抑制SOX11及其表達正相關基因的表達，或許可以降低細胞分裂的活性，延緩腫瘤的進展或是抑制腫瘤的生長。但以上皆基于對轉錄組數據的分析，在真實世界中還需在細胞系中進行進一步驗證，可以指導我們深入研究。
利用生物信息的方法，分析現有公共數據庫，來提出或是解決問題，正逐漸成為主流的思維方式。RB雖是最常見的兒童眼科惡性腫瘤，但是發病率仍相對較低。因腫瘤的異質性，個體研究往往不足以窺其全貌。相較于成人常見腫瘤，眼科腫瘤數量少、發病早。因此，更有必要建立完善的數據庫，更全面了解腫瘤的發生發展機制，實現早診早治。但是，公共數據庫中的數據多為轉錄組數據，并不能體現細胞水平的真實情況。想要得到進一步的驗證，還需進行細胞水平或蛋白質水平的實驗。但這為下一步實驗奠定了基礎，可以將其視為預實驗，提供一個可靠的研究方向。本研究中，SOX11在不同亞型RB中的表達存在差異，與之相關的基因及涉及通路也符合猜想。針對RB，SOX11或許可以成為特定的診斷標記物或是治療靶點，為進一步了解RB提供參考。
視網膜母細胞瘤（RB）是一種來源于光感受器前體細胞的惡性腫瘤，常見于3歲以下兒童；其具有家族遺傳傾向，可單眼、雙眼先后或同時罹患，是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，對兒童的視力和生命有著重大威脅。SOX11是性別決定基因-睪丸決定因子SRY基因家族中的一員，在正常視網膜神經細胞中表達，參與調控的細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路在胚胎發育、眼神經形成和Rb蛋白的表達中起重要作用[1]。為探究SOX11在RB發生發展中的確切作用，本研究利用R2數據分析平臺分析了GEO數據庫中76例RB患者病理組織的測序資料，觀察其在不同亞型RB中的表達、關聯基因和信號通路，以期為RB的早期診斷及進一步治療提供新的線索。現將結果報道如下。
1 對象和方法
在美國國家生物技術信息中心的GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載包含76例RB患者癌組織全mRNA表達譜的公共數據集gse59983。參照文獻[2]的方法，根據15個標記基因表達情況將其分為3組。細胞周期標記基因：E2F1、E2F2、E2F3、PCNA、CCNE1（組1）；視椎光感受器標記基因：PDE6C、PDE6H、GNAT2、OPN1SW、AAR3（組2）；視桿光感受器標記基因：RHO、CNGB1、ROM1、PDE6G、CNGA1（組3）。組1包含26例患者，該組細胞周期標記基因表達最高，視椎及視桿光感受器標記基因表達相對較低。組2包含4例患者，該組視桿及視椎光感受器標記基因表達高，而細胞周期標記基因表達低。組3包含46例患者，該組視椎光感受器標記基因及細胞周期標記基因表達高，而視桿光感受器標記基因表達低。
患者癌組織取自荷蘭的國家RB轉診中心，即阿姆斯特丹自由大學醫學中心。患者手術前未接受放射治療、化學藥物治療等其他治療。手術后腫瘤樣本冰凍于液氮中并轉入－80 ℃冰箱保存。病理診斷由一名經驗豐富的RB病理學專家確定，并由一位眼科醫生或兒科腫瘤專家驗證。腫瘤位置由眼科醫生根據眼底檢查或眼底照片確定。冰凍組織標本RNA經Trizol試劑提取并通過勻漿器研磨均勻，RNA濃度用ND-1000分光光度計測定，RNA的質量和完整性通過Agilent2100生物分析儀評估。
分析gse59983公共數據集，觀察SOX11在RB中的表達，找到SOX11相關基因。根據基因相關性，繪制聚類熱圖。再對與SOX11表達相關的基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析和基因注釋（GO）通路富集分析。關聯基因分析、聚類熱圖、KEGG及GO基因富集分析均在R2生物信息平臺（http://r2.amc.nl）上進行。三組患者癌組織中SOX11的表達比較采用兩兩之間的秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SOX11在RB中的表達
組1患者癌組織中SOX11表達明顯高于組2、組3，差異均有統計學意義（P＜0.05）；組3患者癌組織中SOX11表達明顯高于組2，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。
圖1
3組患者癌組織中SOX11表達比較
2.2 與SOX11相關的基因
利用R2分析平臺對gse59983公共數據集中76例RB患者癌組織mRNA數據進行統計分析，共檢測出與SOX11表達顯著相關的基因4524個。其中，正相關基因2139個，負相關基因2385個。在細胞周期標記基因中，E2F1、E2F2、PCNA、CCNE1與SOX11表達呈顯著正相關（P＜0.001），E2F3與SOX11表達無顯著相關（P＜0.001）。在視椎光感受器標記基因中，GNAT2與SOX11表達呈顯著負相關（P＜0.001），PDE6C、PDE6H、OPN1SW、AAR3與SOX11表達無顯著相關（P＞0.05）。在視桿光感受器標記基因中，CNGB1、ROM1、PDE6G與SOX11表達呈顯著負相關（P＜0.001），RHO、CNGA1與SOX11表達無顯著相關（P＞0.05）（表1）。篩選SOX11及與其關聯性最強的16個基因繪制聚類熱圖，SOX11與SOX11顯著關聯基因的聚類形式和原始形式大致相同（圖2）。篩選出與SOX11表達顯著關聯且作用于細胞周期的基因繪制聚類熱圖，聚類形式與原始形式進一步契合。
表1
前14位與SOX11表達正負相關基因
圖2
SOX11及16個相關基因聚類熱圖。綠色為組2，紅色為組1，藍色為組3
2.3 與SOX11相關通路分析
KEGG分析結果顯示，與SOX11相關的4524個基因中，有1577個基因涉及21個信號通路，主要包括細胞周期、DNA復制、剪接體、堿基切除修復、嘌呤核苷酸代謝、光感傳導、P53信號通路等（表2）。GO分析結果顯示，SOX11及其關聯表達基因主要涉及有絲分裂細胞周期、細胞凋亡、光感受器細胞發育、光感受器細胞保護通路等（表3）。
表2
與SOX11相關基因的KEGG分析結果
表3
與SOX11相關基因的GO分析結果
2.4 與細胞周期相關信號通路圖
根據與SOX11顯著相關且作用于細胞周期基因繪制KEGG信號通路圖（圖3）。在G1期，Rb與組蛋白去乙酰化酶（HDAC）結合，同時CDK2抑制轉錄因子E2F1及E2F2磷酸化，使E2F1、E2F2與Rb解體，停滯的G1期被激活，細胞無限增生的障礙得以解除。
圖3
KEGG信號通路圖
3 討論
隨著基因測序技術的進展，已有研究發現RB具有相似的表達譜，所表達的基因參與諸多分化進程[3]。但是，RB也存在異質性。有研究通過基因表達譜確認了RB的兩種亞型分別起源于祖細胞及視錐光感受器前體細胞[4]。這為其診斷和治療帶來了新的挑戰。通過基因檢測來實現早期診斷和靶向治療正逐漸成為研究熱點。
Rb1基因是最早發現的抑癌基因，定位于染色體13q14.2上，在RB的發生發展中起重要作用。目前發現諸多與Rb1相關的信號通路，與細胞周期調控及細胞凋亡密切相關，包括Cdkn2a/Rb1腫瘤抑制通路、P53信號凋亡通路、ERK信號通路等。其中Cdkn2a/Rb1通路中，CDK2激活使Rb蛋白與E2F因子解離，細胞無限增生能力激活，是腫瘤細胞形成的關鍵。ERK信號通路調控Rb蛋白活性及RHO家族的表達。RHO基因的表達對于視桿光感受器的發育至關重要[5]。
SOX11基因是位于染色體2p25的編碼轉錄因子，主要參與胚胎發育、細胞凋亡和神經形成。SOX11是診斷套細胞淋巴瘤（MCL）的標記物之一。已有研究表明，SOX11的低表達往往提示MCL預后不良[6]。在許多實體腫瘤中也提示SOX11存在異常表達。Teng等[7]發現，血清SOX11甲基化水平與甲胎蛋白結合可以提高診斷乙肝型肝癌的敏感性。SOX11在肝癌中通過Wnt/β-catenin通路調節細胞周期和凋亡[8]。Zhang等[9]發現，SOX11在鼻咽癌中屬于抑癌基因，提高SOX11的表達可以抑制腫瘤細胞的生長和侵襲。Xu等[10]發現，SOX11在胃癌細胞株和胃癌組織中都有所下調，胃癌組織中SOX11啟動子甲基化陽性率（55.1%）顯著高于非癌組織（7.9%）。SOX11主要參與調節兩條信號通路，植入前胚胎及ERK信號通路。ERK信號通路調控Rb蛋白活性及光感受器發育[11]。在RB、乳腺癌、口腔癌等惡性腫瘤中均發現ERK信號通路的過度激活，其直接下調Rb蛋白活性，使其與E2F因子解離，細胞分裂增生失去限制。SOX11在RB中的作用機制及表達情況值得深入探討。
R2分析平臺是由荷蘭阿姆斯特丹學術醫學中心開發，提供給生物學家進行基因組分析的平臺；其包含TCGA、GEO等可公開訪問數據庫的數據，并提供一組工具，便于生物學家用生物信息學方法對公共數據庫進行分析。本研究利用R2數據分析平臺分析了GEO數據庫中76例RB患者病理組織的測序數據，觀察其在不同亞型RB中的表達、關聯基因和信號通路。結果顯示，SOX11在三組中存在差異表達。在組1中，SOX11表達程度最高。為了進一步驗證SOX11在不同亞型Rb組織中的表達是否存在差異，我們選取了前16位與SOX11表達顯著相關的基因，合并SOX11，繪制聚類熱圖。組2（綠色）相關基因表達最低，歸為一組。組1（紅色）被分為兩部分，組1中15例樣本與組3（藍色）中1例樣本相關基因表達最高，歸為一組。組3及部分組2中SOX11及相關基因表達適中。繪制SOX11及SOX11表達相關基因的聚類熱圖時，隨著基因數量增多，聚類熱圖分組越接近原始分組。有趣的是，無論如何調整選取基因的數量，組2中的4例樣本，總會被歸為一組。這提示SOX11的表達情況或許可以反應不同類型或不同時期的RB，組1與組3代表兩種類型或兩個階段的RB組織，組2或許混入了正常的視網膜組織。
與SOX11表達呈顯著正相關的基因中，E2F1隨著與Rb蛋白解離，其功能得到激活，使停滯在G1期的細胞繼續分裂。CENPF編碼的蛋白可以在有絲分裂中使染色體分離。CENPF同時可以調節Rb蛋白活性來影響細胞的分裂和增生。其余如BIRC5、KPNA2和CKS1B等所編碼的蛋白質均作用于細胞周期，促進細胞增生。GO分析結果顯示，SOX11及其相關基因涉及通路主要調控有絲分裂細胞周期、細胞凋亡以及光感受器的發育和保護。以上研究說明，SOX11及其表達正相關的基因在細胞周期中可能起協同作用，如果抑制SOX11及其表達正相關基因的表達，或許可以降低細胞分裂的活性，延緩腫瘤的進展或是抑制腫瘤的生長。但以上皆基于對轉錄組數據的分析，在真實世界中還需在細胞系中進行進一步驗證，可以指導我們深入研究。
利用生物信息的方法，分析現有公共數據庫，來提出或是解決問題，正逐漸成為主流的思維方式。RB雖是最常見的兒童眼科惡性腫瘤，但是發病率仍相對較低。因腫瘤的異質性，個體研究往往不足以窺其全貌。相較于成人常見腫瘤，眼科腫瘤數量少、發病早。因此，更有必要建立完善的數據庫，更全面了解腫瘤的發生發展機制，實現早診早治。但是，公共數據庫中的數據多為轉錄組數據，并不能體現細胞水平的真實情況。想要得到進一步的驗證，還需進行細胞水平或蛋白質水平的實驗。但這為下一步實驗奠定了基礎，可以將其視為預實驗，提供一個可靠的研究方向。本研究中，SOX11在不同亞型RB中的表達存在差異，與之相關的基因及涉及通路也符合猜想。針對RB，SOX11或許可以成為特定的診斷標記物或是治療靶點，為進一步了解RB提供參考。
