引用本文： 徐嫚鴻, 東莉潔, 王琳妮, 黃欣遠, 李筱榮. 富里酸干預缺氧誘導人視網膜微血管內皮細胞基因表達譜的MiSeq測序分析. 中華眼底病雜志, 2020, 36(10): 795-803. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190403-00128 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病的重要微血管并發癥之一，其發病機制主要包括多元醇途徑、氨基己糖途徑、蛋白激酶C途徑活化、晚期糖基化終末產物的形成和血管緊張素Ⅱ誘發視網膜氧化損傷等[1]。這些途徑進一步誘導氧化應激反應、炎癥反應，觸發血管功能障礙；同時也會導致促血管生成因子和炎癥因子表達的上調[2]。目前較多研究提示炎癥因子在DR致病中發揮重要作用，如在DR患者的房水和玻璃體液中炎癥趨化因子、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等增加尤其明顯[3]。早在用于治療疾病的化學藥物開發之前，人類就發現了植物對疾病的治愈能力。腐植物質（HS）由植物分解而形成，天然存在于水、泥炭、土壤和褐煤中，根據其在酸性或堿性介質中的溶解度不同，可以將HS分為胡敏酸、腐殖酸和富里酸（FA）三類物質[4-5]。FA是通過化學和生物過程降解死亡植物、微生物和動物等有機物質而形成的多酚酸化合物的混合物[6]。其具有抗炎、抗氧化活性和對嗜堿性粒細胞中化學介質釋放的抑制作用以及神經保護作用[7-8]。FA具有分子量小、官能團密集、滲透力強和活性高等特點，能在機體中通過內分泌激素的調節和提高機體免疫功能而發揮治療作用[9]。盡管目前關于FA對細胞和生物功能影響的研究較多，但其在眼科領域的抗炎作用鮮有報道。轉錄組學研究是通過對細胞中基因轉錄和基因調控規律分析，從RNA水平（miRNA和mRNA層面）獲得細胞的全部轉錄信息，并由此得到細胞表型和功能的研究手段。為探究FA的抗炎治療作用，本研究采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）觀察了FA對缺氧刺激人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）氧化應激后炎癥反應的抑制作用，并通過MiSeq測序分析方法揭示FA的分子作用靶點和作用機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC由天津醫科大學眼科醫院劉勃實醫生惠贈。1倍DMEM完全培養基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（P/S）、10%胎牛血清（FBS）、4%多聚甲醛（PFA）（美國Gibco公司）；PBS（上海立菲公司）；細胞培養板（美國Life Technologies公司）；恒溫培養箱、超凈工作臺、DAPI（賽默飛世爾科技公司）；MTT細胞增生及細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；DMSO（美國Sigma公司）；酶聯免疫檢測儀（Infinite M200，瑞士帝肯公司）；FA原液（中國山東煙臺雪飛生物科技有限公司）；Trizol試劑、Isolectin B4（IB4）（美國Invitrogen公司）；移液器、吸頭（德國Eppendorf公司）；EP管、離心管（上海生物工程技術有限公司）；7900HT RT-PCR儀（美國ABI公司）；共聚焦熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
正常培養hRMEC（正常組）：hRMEC使用含有1% P/S、10% FBS的DMEM完全培養基，置于37°C、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。FA處理hRMEC（FA干預組）：將hRMEC以4×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，用10%FBS的DMEM完全培養基在37°C、5% CO2培養箱中培養過夜。待細胞生長融合度為70%時，將細胞隨機分為兩組，一組用含有不同濃度FA的培養基處理hRMEC 30 min后換正常培養基繼續培養24.0 h，另一組用含有不同濃度FA的培養基培養hRMEC 24.5 h。FA的濃度梯度設置為0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml。每個作用濃度的細胞設置3個副孔。缺氧誘導hRMEC（缺氧組）：將處于對數生長期的正常培養hRMEC及FA處理后的hRMEC置于缺氧裝置中，氧氣測量表校準，向裝置中充入N2直至測得氧氣濃度達到2%，關閉進氣口和出氣口，將缺氧裝置連同細胞一起置于37°C、5% CO2培養箱中培養。
1.2.2 免疫熒光染色、MTT比色法及RT-PCR檢測
采用免疫熒光染色鑒定hRMEC。將hRMEC接種于共聚焦培養皿中，待細胞生長至融合度為60%～70%時，棄完全培養液，用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min，PBS洗3次，透膜液室溫孵育15 min，棄透膜液，混合IB4（1:500）和DAPI（1:1000）孵育4 h。采用光學顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態。
采用MTT比色法檢測FA對正常組、缺氧組hRMEC細胞活性的影響。采用0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml FA處理hRMEC，每孔加入110 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續培養4.0 h。小心棄去培養液，每孔加入150 μl DMSO，搖床上低速震蕩5 min使結晶充分溶解。采用酶聯免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值。每個FA濃度設置3個副孔。
采用RT-PCR檢測hRMEC中細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β的mRNA表達。缺氧刺激或FA處理后的hRMEC按照實驗分組接種于6孔板，每組設置2個副孔。待細胞生長融合度為80%時，棄去培養液，按Trizol試劑說明書提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA模版，進行RT-PCR。以GAPDH為內參照。引物序列根據NCBI查詢相應基因信息自行設計（表1）。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。目的基因擴增產物的相對含量用2?ΔΔCt計算。
表1
RT-PCR引物序列
1.2.3 轉錄組分析
提取缺氧組和FA干預組總RNA，每組重復實驗3次，進行質量控制。RNA樣品檢測合格后，使用小RNA（sRNA）Sample Pre Kit構建文庫，利用sRNA的3′端及5′端特殊結構，以總RNA為起始樣品，直接將sRNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA。隨后經過PCR擴增，SDS-PAGE分離目標DNA片段，切膠回收得到的DNA即為cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μl，隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段進行檢測，插入片段符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求融合后進行HiSeq/MiSeq測序。
高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別分析轉化為測序序列即原始數據，為保證信息分析的質量，對原始數據進行質量控制處理得到過濾數據；對各樣品的過濾數據，篩選一定長度范圍內的sRNA來進行分類和定量分析后，再進行表達差異分析和靶基因預測。同時進行候選靶基因基因注釋（GO）功能顯著性富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析（圖1）。
圖1
轉錄組分析流程圖
1.2.4 差異miRNA篩選及靶基因預測及富集分析
miRNA差異表達的輸入數據為miRNA表達水平分析中得到的讀取計數數據，采用基于負二項分布的DESeq2進行差異分析。采用火山圖推斷差異miRNA的整體分布情況，從差異倍數和校正后的顯著水平（padj/q值）兩個水平進行評估，對差異miRNA進行篩選，默認差異miRNA的篩選條件為padj＜0.05。
選用miRanda（www.miranda.org）、PITA（http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html）和Targetscan（www.targetscan.org）3個miRNA數據庫對差異miRNA的靶基因進行預測，取三者交集。根據miRNA與其靶基因間的對應關系，對每組顯著差異表達miRNA的靶基因（P≤0.05）分別進行GO功能顯著性富集分析和KEGG通路顯著性富集分析。
1.3 統計學分析
采用Graphprism軟件對獲得數據進行圖表整理。采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。多組計量資料比較采用方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊時采用t檢驗，總體均數有差異時采用兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 免疫熒光染色、MTT比色法及RT-PCR檢測結果
經IB4和DAPI雙染色，正常培養的hRMEC在光學顯微鏡下呈扁平的長梭形和多角形（圖2A）；熒光顯微鏡下可見IB4染色hRMEC細胞胞體，DAPI染色于細胞核（圖2B）。證實本實驗使用細胞為hRMEC。
圖2
hRMEC細胞鑒定像。2A示光學顯微鏡像，hRMEC呈扁平的長梭形和多角形；2B示熒光顯微鏡像，IB4染色hRMEC細胞胞體，DAPI染色于細胞核 IB4+DAPI 標尺：100 μm
MTT比色法檢測結果顯示，不同濃度的FA處理正常組hRMEC 30 min對細胞活性無影響（t=1.153、0.247、0.386、1.011、1.815，P＞0.05）；不同濃度的FA處理正常組hRMEC 24.5 h對細胞活性也無影響（t=1.495、0.739、1.827、1.851、2.055，P＞0.05）（圖3）。
圖3
不同濃度和不同作用時間的FA對正常組hRMEC細胞活性的影響
MTT比色法檢測結果顯示，FA處理30 min對缺氧組hRMEC的細胞活性無影響（t=0.576、2.261、1.891、1.947、0.719，P＞0.05）；FA處理24.5 h，15、20 μg/mlFA能明顯提高缺氧組hRMEC的細胞活性（t=2.802、4.727，P＜0.05）（圖4）。
圖4
不同濃度和不同作用時間的FA對缺氧組hRMEC細胞活性的影響
RT-PCT檢測結果顯示，缺氧組hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表達較正常組明顯上調，差異有統計學意義（t=3.426、6.011、5.282、6.500，P=0.027、0.004、0.006、0.003）；但兩組之間IL-4、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α的mRNA表達比較，差異無統計學意義（t=0.423、2.722、1.056、1.946、1.563，P＞0.05）。FA干預組hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF- β的mRNA表達較缺氧組明顯下降，差異有統計學意義（t=9.961、3.676、3.613、3.387，P=0.001、0.021、0.023、0.028）；但兩組之間IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10、MMP-2的mRNA表達比較，差異無統計學意義（t=2.616、0.614、2.537、2.059、1.931，P＞0.05）（圖5）。
圖5
缺氧組及FA干預組hRMEC中炎癥因子及炎癥相關因子mRNA表達比較
2.2 差異miRNA及miRNA靶基因預測
所有樣品在illumina HiSeq TM2500/MiSeq測序平臺的轉錄組測序后，分別得到缺氧組和FA干預組總的平均原始數據13 263 715條和13 347 115條；過濾質量較低的數據，得到平均過濾數據分別為12 770 082條和12 856 982條，所占比例分別為96.28%、96.22%。缺氧組miRNA表達數為995，FA干預組miRNA表達數為950；兩組均檢測到的miRNA表達數為852，其中具有差異表達者14個，包括上調者9個，下調者5個（圖6）。通過TargetScan數據庫進行差異表達miRNA靶基因預測，并與前期實驗中驗證的炎癥因子和炎癥相關因子進行交叉對比，發現ICAM-1是多個差異miRNA的共同靶基因（表2）。
表2
差異miRNA統計情況及部分靶基因預測
圖6
缺氧組和FA干預組差異miRNA表達情況。6A示差異miRNA維恩圖；6B示差異miRNA火山圖，可見上調基因9個，下調基因5個
2.3 GO功能顯著性富集分析和KEGG通路顯著性富集分析
GO功能顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA的功能主要分為生物學過程、細胞成分和分子功能3類；而FA刺激后差異miRNA的功能集中在生物學過程和細胞成分，其中miRNA集中富集在細胞發育、細胞分化、單生物發育過程和多細胞有機體發育等生物學過程以及細胞膜等細胞成分中（圖7）。
圖7
差異表達基因GO功能注釋分類統計圖。序號1~20為生物學過程；21~40為細胞成分；41~60為分子功能。1. 定位；2. 細胞外基質中骨形態發生蛋白分離；3. 細胞發育；4. 維持胞外蛋白質定位；5. 胞外蛋白質定位；6. 細胞分化；7. 細胞外配體與受體分離；8. 甘油三酯生物合成過程；9. 維持蛋白質定位；10.單生物發育過程；11. 溶酶體組裝；12. 甘油三酯生物合成過程的正性調控；13. 發育過程；14. 神經元發育；15. 神經元分化；16. 細胞外信號轉導調節；17. 細胞外信號轉導的復性調控；18. 多細胞有機體發育；19. 甘油三酯生物合成過程的調控；20. 甘油三酯代謝過程的正向調控；21. 蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶復合物；22. 磷酸酶復合物；23. 膜；24. 質膜區；25. 膜區；26. 軸系膜；27. 主要過程；28. 纖毛尖端連接；29. 肌球蛋白Ⅶ復合物；30. 纖毛尖端連接密度；31. 端鏈接密度；32. 后突觸；33. 質膜部分；34. 核仁；35. Nem1-Spo7磷酸酶復合物；36. 體元投射；37. 細胞連接；38. 纖毛連接；39. 細胞質囊泡；40. 胞質膜有界囊泡；41. 形態發生活性；42. 脂結合；43.磷脂酰-N-甲基乙醇胺N-甲基轉移酶活性；44. 磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶活性；45. 磷脂酰-N-二甲基乙醇胺N-甲基轉移酶活性；46. 磷酸果嘌呤酰半胱氨酸脫羧酶活性；47. RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，序列特異性轉錄調控區DNA結合；48. 降鈣素結合；49. CP2甘露糖乙醇胺磷酸轉移酶活性；50. 谷胱甘肽轉移酶活性；51.血影蛋白結合；52. IL-4受體（IL-4R）活性；53. 高親和力堿性氨基酸跨膜轉運蛋白活性；54. 高親和力精氨酸跨膜轉運蛋白活性；55. 高親和力賴氨酸跨膜轉運蛋白活性；56. 酰基肉毒堿跨膜轉運蛋白活性；57. 轉錄因子活性，序列特異性DNA結合轉錄因子募集；58. 降鈣素受體活性；59. 組蛋白乙酰轉移酶調節活性；60. 白三烯-C4合成酶（LTC4S）活性
KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA表達高度富集的是癌癥中蛋白多糖通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用通路，差異表達較明顯的是花生四烯酸代謝通路和安非他明成癮性通路。此外，自然殺傷（NK）細胞介導的細胞毒性通路和瞬時受阻點位通道的炎癥介質調節通路也有miRNA富集（圖8）。
圖8
差異miRNA KEGG富集散點圖。1. 維生素消化吸收；2. 血管平滑肌收縮；3. 緊密連接；4. 逆行內源性大麻素信號傳導；5. 癌癥中的蛋白多糖；6. 泛酸和CoA的生物合成；7. NK細胞介導的細胞毒性；8. 嗎啡成癮性；9. 長期增強；10. TRP通道的炎癥介質調節；11. 糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成；12. γ-氨基丁酸能突觸；13. 多巴胺能突觸；14. DNA復制；15. 細胞因子-細胞因子受體相互作用；16. 半胱氨酸和蛋氨酸代謝；17. 膀胱癌；18. 花生四烯酸代謝；19. 安非他明成癮性；20. 非洲錐蟲病
3 討論
FA是由小分子量、親水的含羧基分子組成的微生物有機降解產物[10]。Chien等[7]研究發現，FA抑制人單核細胞中同型半胱氨酸誘導的環氧合酶-2（COX-2）表達，并且具有劑量依賴性。而COX-2是花生四烯酸代謝的限速酶，在組織損傷和炎癥等情況下表達增強[11]。本研究在探討FA對缺氧誘導hRMEC后炎癥因子的調控作用前，我們先驗證了FA是否對正常培養的hRMEC具有細胞毒性。我們采用濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml的FA對正常組細胞進行處理，結果發現不同作用濃度和不同作用方式的FA對細胞活性并無影響；而FA處理缺氧組hRMEC，可明顯增強細胞活性，FA作用濃度為15 μg/ml。此外，通過缺氧誘導hRMEC發生氧化應激，從miRNA層面驗證了缺氧處理可以顯著上調ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的表達水平；而當使用FA處理缺氧的hRMEC后，炎癥因子及炎癥相關因子的表達水平明顯下調，尤其是ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表達水平。這兩項實驗結果表明，FA可以下調由于缺氧導致的hRMEC炎癥因子高表達。
轉錄組分析是利用高通量測序技術對細胞內所有轉錄產物的集合進行分析，較為整體地鑒定差異基因表達[12]。在本實驗中，我們檢測具有小序列變異的高度相似的miRNA，而這種差異用傳統雜交技術很難鑒別，此外MiSeq測序分析還能發現未知轉錄組信息，提供最全面的轉錄組信息，為解釋疾病發生發展的分子作用機制提供重要的指導[13]。MiRNA是功能上重要的一類小的非蛋白質編碼RNA，長度為19～24個核苷酸，是基因表達的轉錄后調節因子[14]。大多數動物miRNA與靶miRNA的3'-UTR中的序列不完全堿基配對，并通過抑制翻譯或促進mRNA去腺苷酸化來抑制蛋白質合成[15]。我們首次使用MiSeq探究FA對缺氧誘導hRMEC炎癥因子基因表達的調控作用，結果發現相較于缺氧組，FA干預組hRMEC中miRNA表達上調者9個，表達下調者5個。值得注意的是，miRNA靶基因預測結果中，hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3170和hsa-miR-7976這4個上調miRNA的靶基因均包含ICAM-1，而miRNA的重要作用之一就是沉默下游mRNA的表達，這與我們RT-PCR結果中FA下調ICAM-1表達的結果相符合。
GO功能顯著性富集分析結果提示，FA作用后差異基因的生物學過程功能主要體現在細胞發育和細胞分化等方面，而差異基因主要參與包括細胞膜、細胞器膜在內的膜的形成。此外，在分子功能方面，差異基因參與IL-4R活性以及LTC4S活性的調控過程。IL-4能調節Th2細胞增生以及Ig合成，通過與IL-4R結合參與啟動信號和轉錄激活因子途徑的激活從而參與過敏性哮喘的發病過程[16-17]。KEGG通路顯著性富集分析結果提示，差異基因參與多條信號轉導通路和生化代謝通路，其中NK細胞介導的細胞毒性通路以及TRP通道的炎癥介質調節通路等與炎癥的發生相關。NK細胞是機體內重要的免疫細胞，其靶細胞包括某些腫瘤細胞、病毒感染細胞和自身組織細胞等，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節的過程中發揮重要作用[18]。Bigger等[19]研究發現，NK細胞的消耗會加劇巨細胞病毒性葡萄膜炎，體內實驗中通過睫狀體注射小鼠巨細胞病毒可顯著破壞小鼠視網膜。這提示NK細胞在巨細胞病毒性葡萄膜炎的病理過程中發揮重要作用。由此可見，FA在炎癥的相關生物學過程中發揮著一定作用。
中性粒細胞黏附到血管內皮細胞是心血管疾病中炎癥反應的病理基礎，在此過程中，ICAM-1起著關鍵作用[20]。有研究表明，結腸癌患者抵抗素能通過激活核因子-κB和ICAM-1的表達進而促進人結腸癌細胞與人臍靜脈內皮細胞的黏附，FA能夠抑制抵抗素的作用[21]。大量證據表明，氧化應激和炎癥是糖尿病患者視網膜血管病變的主要發病機制，氧化應激和ROS導致視網膜內皮細胞出現炎癥反應，從而引發內皮細胞損傷，微血管通透性增加和白細胞募集增加[22]。內皮細胞活化和白細胞與視網膜內皮的黏附增強是DR相關的最早兩個變化，它們參與視網膜內皮細胞損傷的發病機制和血視網膜屏障的破壞。研究表明，視網膜白細胞淤滯和白細胞與血管壁的黏附與視網膜ICAM-1的表達增加相關[23]。本研究首先觀察到FA對于炎癥的潛在治療作用，并通過miRNA測序分析的方法，尋找FA對抗炎癥的作用靶點，分析FA作用于缺氧刺激hRMEC后炎性因子改變的分子生物學機制。
本研究仍存在一定的局限性，轉錄組分析結果所篩選到的差異miRNA數量較少，雖然靶基因預測中有與炎癥反應密切相關的基因，且符合最初的實驗結果，但仍需要大量的后續實驗驗證miRNA和其靶基因對hRMEC的作用和功能。從整體上來看，DR的發病機制十分復雜，在后續的實驗中我們不僅會深入探究FA如何通過調控ICAM-1而發揮抗炎作用，同時也將采用多細胞模型更好詮釋FA的抗炎作用及機制，為FA應用于DR的治療提供理論基礎。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病的重要微血管并發癥之一，其發病機制主要包括多元醇途徑、氨基己糖途徑、蛋白激酶C途徑活化、晚期糖基化終末產物的形成和血管緊張素Ⅱ誘發視網膜氧化損傷等[1]。這些途徑進一步誘導氧化應激反應、炎癥反應，觸發血管功能障礙；同時也會導致促血管生成因子和炎癥因子表達的上調[2]。目前較多研究提示炎癥因子在DR致病中發揮重要作用，如在DR患者的房水和玻璃體液中炎癥趨化因子、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等增加尤其明顯[3]。早在用于治療疾病的化學藥物開發之前，人類就發現了植物對疾病的治愈能力。腐植物質（HS）由植物分解而形成，天然存在于水、泥炭、土壤和褐煤中，根據其在酸性或堿性介質中的溶解度不同，可以將HS分為胡敏酸、腐殖酸和富里酸（FA）三類物質[4-5]。FA是通過化學和生物過程降解死亡植物、微生物和動物等有機物質而形成的多酚酸化合物的混合物[6]。其具有抗炎、抗氧化活性和對嗜堿性粒細胞中化學介質釋放的抑制作用以及神經保護作用[7-8]。FA具有分子量小、官能團密集、滲透力強和活性高等特點，能在機體中通過內分泌激素的調節和提高機體免疫功能而發揮治療作用[9]。盡管目前關于FA對細胞和生物功能影響的研究較多，但其在眼科領域的抗炎作用鮮有報道。轉錄組學研究是通過對細胞中基因轉錄和基因調控規律分析，從RNA水平（miRNA和mRNA層面）獲得細胞的全部轉錄信息，并由此得到細胞表型和功能的研究手段。為探究FA的抗炎治療作用，本研究采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）觀察了FA對缺氧刺激人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）氧化應激后炎癥反應的抑制作用，并通過MiSeq測序分析方法揭示FA的分子作用靶點和作用機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC由天津醫科大學眼科醫院劉勃實醫生惠贈。1倍DMEM完全培養基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（P/S）、10%胎牛血清（FBS）、4%多聚甲醛（PFA）（美國Gibco公司）；PBS（上海立菲公司）；細胞培養板（美國Life Technologies公司）；恒溫培養箱、超凈工作臺、DAPI（賽默飛世爾科技公司）；MTT細胞增生及細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；DMSO（美國Sigma公司）；酶聯免疫檢測儀（Infinite M200，瑞士帝肯公司）；FA原液（中國山東煙臺雪飛生物科技有限公司）；Trizol試劑、Isolectin B4（IB4）（美國Invitrogen公司）；移液器、吸頭（德國Eppendorf公司）；EP管、離心管（上海生物工程技術有限公司）；7900HT RT-PCR儀（美國ABI公司）；共聚焦熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
正常培養hRMEC（正常組）：hRMEC使用含有1% P/S、10% FBS的DMEM完全培養基，置于37°C、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。FA處理hRMEC（FA干預組）：將hRMEC以4×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，用10%FBS的DMEM完全培養基在37°C、5% CO2培養箱中培養過夜。待細胞生長融合度為70%時，將細胞隨機分為兩組，一組用含有不同濃度FA的培養基處理hRMEC 30 min后換正常培養基繼續培養24.0 h，另一組用含有不同濃度FA的培養基培養hRMEC 24.5 h。FA的濃度梯度設置為0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml。每個作用濃度的細胞設置3個副孔。缺氧誘導hRMEC（缺氧組）：將處于對數生長期的正常培養hRMEC及FA處理后的hRMEC置于缺氧裝置中，氧氣測量表校準，向裝置中充入N2直至測得氧氣濃度達到2%，關閉進氣口和出氣口，將缺氧裝置連同細胞一起置于37°C、5% CO2培養箱中培養。
1.2.2 免疫熒光染色、MTT比色法及RT-PCR檢測
采用免疫熒光染色鑒定hRMEC。將hRMEC接種于共聚焦培養皿中，待細胞生長至融合度為60%～70%時，棄完全培養液，用4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min，PBS洗3次，透膜液室溫孵育15 min，棄透膜液，混合IB4（1:500）和DAPI（1:1000）孵育4 h。采用光學顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態。
采用MTT比色法檢測FA對正常組、缺氧組hRMEC細胞活性的影響。采用0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml FA處理hRMEC，每孔加入110 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續培養4.0 h。小心棄去培養液，每孔加入150 μl DMSO，搖床上低速震蕩5 min使結晶充分溶解。采用酶聯免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度［A，舊稱光密度（OD）］值。每個FA濃度設置3個副孔。
采用RT-PCR檢測hRMEC中細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α、TNF-β的mRNA表達。缺氧刺激或FA處理后的hRMEC按照實驗分組接種于6孔板，每組設置2個副孔。待細胞生長融合度為80%時，棄去培養液，按Trizol試劑說明書提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA模版，進行RT-PCR。以GAPDH為內參照。引物序列根據NCBI查詢相應基因信息自行設計（表1）。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。目的基因擴增產物的相對含量用2?ΔΔCt計算。
表1
RT-PCR引物序列
1.2.3 轉錄組分析
提取缺氧組和FA干預組總RNA，每組重復實驗3次，進行質量控制。RNA樣品檢測合格后，使用小RNA（sRNA）Sample Pre Kit構建文庫，利用sRNA的3′端及5′端特殊結構，以總RNA為起始樣品，直接將sRNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA。隨后經過PCR擴增，SDS-PAGE分離目標DNA片段，切膠回收得到的DNA即為cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μl，隨后使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段進行檢測，插入片段符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求融合后進行HiSeq/MiSeq測序。
高通量測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別分析轉化為測序序列即原始數據，為保證信息分析的質量，對原始數據進行質量控制處理得到過濾數據；對各樣品的過濾數據，篩選一定長度范圍內的sRNA來進行分類和定量分析后，再進行表達差異分析和靶基因預測。同時進行候選靶基因基因注釋（GO）功能顯著性富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路顯著性富集分析（圖1）。
圖1
轉錄組分析流程圖
1.2.4 差異miRNA篩選及靶基因預測及富集分析
miRNA差異表達的輸入數據為miRNA表達水平分析中得到的讀取計數數據，采用基于負二項分布的DESeq2進行差異分析。采用火山圖推斷差異miRNA的整體分布情況，從差異倍數和校正后的顯著水平（padj/q值）兩個水平進行評估，對差異miRNA進行篩選，默認差異miRNA的篩選條件為padj＜0.05。
選用miRanda（www.miranda.org）、PITA（http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html）和Targetscan（www.targetscan.org）3個miRNA數據庫對差異miRNA的靶基因進行預測，取三者交集。根據miRNA與其靶基因間的對應關系，對每組顯著差異表達miRNA的靶基因（P≤0.05）分別進行GO功能顯著性富集分析和KEGG通路顯著性富集分析。
1.3 統計學分析
采用Graphprism軟件對獲得數據進行圖表整理。采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。多組計量資料比較采用方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊時采用t檢驗，總體均數有差異時采用兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 免疫熒光染色、MTT比色法及RT-PCR檢測結果
經IB4和DAPI雙染色，正常培養的hRMEC在光學顯微鏡下呈扁平的長梭形和多角形（圖2A）；熒光顯微鏡下可見IB4染色hRMEC細胞胞體，DAPI染色于細胞核（圖2B）。證實本實驗使用細胞為hRMEC。
圖2
hRMEC細胞鑒定像。2A示光學顯微鏡像，hRMEC呈扁平的長梭形和多角形；2B示熒光顯微鏡像，IB4染色hRMEC細胞胞體，DAPI染色于細胞核 IB4+DAPI 標尺：100 μm
MTT比色法檢測結果顯示，不同濃度的FA處理正常組hRMEC 30 min對細胞活性無影響（t=1.153、0.247、0.386、1.011、1.815，P＞0.05）；不同濃度的FA處理正常組hRMEC 24.5 h對細胞活性也無影響（t=1.495、0.739、1.827、1.851、2.055，P＞0.05）（圖3）。
圖3
不同濃度和不同作用時間的FA對正常組hRMEC細胞活性的影響
MTT比色法檢測結果顯示，FA處理30 min對缺氧組hRMEC的細胞活性無影響（t=0.576、2.261、1.891、1.947、0.719，P＞0.05）；FA處理24.5 h，15、20 μg/mlFA能明顯提高缺氧組hRMEC的細胞活性（t=2.802、4.727，P＜0.05）（圖4）。
圖4
不同濃度和不同作用時間的FA對缺氧組hRMEC細胞活性的影響
RT-PCT檢測結果顯示，缺氧組hRMEC中ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的mRNA表達較正常組明顯上調，差異有統計學意義（t=3.426、6.011、5.282、6.500，P=0.027、0.004、0.006、0.003）；但兩組之間IL-4、IL-8、IL-10、MMP-2、TNF-α的mRNA表達比較，差異無統計學意義（t=0.423、2.722、1.056、1.946、1.563，P＞0.05）。FA干預組hRMEC中ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF- β的mRNA表達較缺氧組明顯下降，差異有統計學意義（t=9.961、3.676、3.613、3.387，P=0.001、0.021、0.023、0.028）；但兩組之間IL-1β、IL-4、IL-8、IL-10、MMP-2的mRNA表達比較，差異無統計學意義（t=2.616、0.614、2.537、2.059、1.931，P＞0.05）（圖5）。
圖5
缺氧組及FA干預組hRMEC中炎癥因子及炎癥相關因子mRNA表達比較
2.2 差異miRNA及miRNA靶基因預測
所有樣品在illumina HiSeq TM2500/MiSeq測序平臺的轉錄組測序后，分別得到缺氧組和FA干預組總的平均原始數據13 263 715條和13 347 115條；過濾質量較低的數據，得到平均過濾數據分別為12 770 082條和12 856 982條，所占比例分別為96.28%、96.22%。缺氧組miRNA表達數為995，FA干預組miRNA表達數為950；兩組均檢測到的miRNA表達數為852，其中具有差異表達者14個，包括上調者9個，下調者5個（圖6）。通過TargetScan數據庫進行差異表達miRNA靶基因預測，并與前期實驗中驗證的炎癥因子和炎癥相關因子進行交叉對比，發現ICAM-1是多個差異miRNA的共同靶基因（表2）。
表2
差異miRNA統計情況及部分靶基因預測
圖6
缺氧組和FA干預組差異miRNA表達情況。6A示差異miRNA維恩圖；6B示差異miRNA火山圖，可見上調基因9個，下調基因5個
2.3 GO功能顯著性富集分析和KEGG通路顯著性富集分析
GO功能顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA的功能主要分為生物學過程、細胞成分和分子功能3類；而FA刺激后差異miRNA的功能集中在生物學過程和細胞成分，其中miRNA集中富集在細胞發育、細胞分化、單生物發育過程和多細胞有機體發育等生物學過程以及細胞膜等細胞成分中（圖7）。
圖7
差異表達基因GO功能注釋分類統計圖。序號1~20為生物學過程；21~40為細胞成分；41~60為分子功能。1. 定位；2. 細胞外基質中骨形態發生蛋白分離；3. 細胞發育；4. 維持胞外蛋白質定位；5. 胞外蛋白質定位；6. 細胞分化；7. 細胞外配體與受體分離；8. 甘油三酯生物合成過程；9. 維持蛋白質定位；10.單生物發育過程；11. 溶酶體組裝；12. 甘油三酯生物合成過程的正性調控；13. 發育過程；14. 神經元發育；15. 神經元分化；16. 細胞外信號轉導調節；17. 細胞外信號轉導的復性調控；18. 多細胞有機體發育；19. 甘油三酯生物合成過程的調控；20. 甘油三酯代謝過程的正向調控；21. 蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶復合物；22. 磷酸酶復合物；23. 膜；24. 質膜區；25. 膜區；26. 軸系膜；27. 主要過程；28. 纖毛尖端連接；29. 肌球蛋白Ⅶ復合物；30. 纖毛尖端連接密度；31. 端鏈接密度；32. 后突觸；33. 質膜部分；34. 核仁；35. Nem1-Spo7磷酸酶復合物；36. 體元投射；37. 細胞連接；38. 纖毛連接；39. 細胞質囊泡；40. 胞質膜有界囊泡；41. 形態發生活性；42. 脂結合；43.磷脂酰-N-甲基乙醇胺N-甲基轉移酶活性；44. 磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶活性；45. 磷脂酰-N-二甲基乙醇胺N-甲基轉移酶活性；46. 磷酸果嘌呤酰半胱氨酸脫羧酶活性；47. RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，序列特異性轉錄調控區DNA結合；48. 降鈣素結合；49. CP2甘露糖乙醇胺磷酸轉移酶活性；50. 谷胱甘肽轉移酶活性；51.血影蛋白結合；52. IL-4受體（IL-4R）活性；53. 高親和力堿性氨基酸跨膜轉運蛋白活性；54. 高親和力精氨酸跨膜轉運蛋白活性；55. 高親和力賴氨酸跨膜轉運蛋白活性；56. 酰基肉毒堿跨膜轉運蛋白活性；57. 轉錄因子活性，序列特異性DNA結合轉錄因子募集；58. 降鈣素受體活性；59. 組蛋白乙酰轉移酶調節活性；60. 白三烯-C4合成酶（LTC4S）活性
KEGG通路顯著性富集分析結果顯示，差異miRNA表達高度富集的是癌癥中蛋白多糖通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用通路，差異表達較明顯的是花生四烯酸代謝通路和安非他明成癮性通路。此外，自然殺傷（NK）細胞介導的細胞毒性通路和瞬時受阻點位通道的炎癥介質調節通路也有miRNA富集（圖8）。
圖8
差異miRNA KEGG富集散點圖。1. 維生素消化吸收；2. 血管平滑肌收縮；3. 緊密連接；4. 逆行內源性大麻素信號傳導；5. 癌癥中的蛋白多糖；6. 泛酸和CoA的生物合成；7. NK細胞介導的細胞毒性；8. 嗎啡成癮性；9. 長期增強；10. TRP通道的炎癥介質調節；11. 糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成；12. γ-氨基丁酸能突觸；13. 多巴胺能突觸；14. DNA復制；15. 細胞因子-細胞因子受體相互作用；16. 半胱氨酸和蛋氨酸代謝；17. 膀胱癌；18. 花生四烯酸代謝；19. 安非他明成癮性；20. 非洲錐蟲病
3 討論
FA是由小分子量、親水的含羧基分子組成的微生物有機降解產物[10]。Chien等[7]研究發現，FA抑制人單核細胞中同型半胱氨酸誘導的環氧合酶-2（COX-2）表達，并且具有劑量依賴性。而COX-2是花生四烯酸代謝的限速酶，在組織損傷和炎癥等情況下表達增強[11]。本研究在探討FA對缺氧誘導hRMEC后炎癥因子的調控作用前，我們先驗證了FA是否對正常培養的hRMEC具有細胞毒性。我們采用濃度分別為0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml的FA對正常組細胞進行處理，結果發現不同作用濃度和不同作用方式的FA對細胞活性并無影響；而FA處理缺氧組hRMEC，可明顯增強細胞活性，FA作用濃度為15 μg/ml。此外，通過缺氧誘導hRMEC發生氧化應激，從miRNA層面驗證了缺氧處理可以顯著上調ICAM-1、IL-1β、IL-6和TNF-β的表達水平；而當使用FA處理缺氧的hRMEC后，炎癥因子及炎癥相關因子的表達水平明顯下調，尤其是ICAM-1、IL-6、TNF-α和TNF-β的mRNA表達水平。這兩項實驗結果表明，FA可以下調由于缺氧導致的hRMEC炎癥因子高表達。
轉錄組分析是利用高通量測序技術對細胞內所有轉錄產物的集合進行分析，較為整體地鑒定差異基因表達[12]。在本實驗中，我們檢測具有小序列變異的高度相似的miRNA，而這種差異用傳統雜交技術很難鑒別，此外MiSeq測序分析還能發現未知轉錄組信息，提供最全面的轉錄組信息，為解釋疾病發生發展的分子作用機制提供重要的指導[13]。MiRNA是功能上重要的一類小的非蛋白質編碼RNA，長度為19～24個核苷酸，是基因表達的轉錄后調節因子[14]。大多數動物miRNA與靶miRNA的3'-UTR中的序列不完全堿基配對，并通過抑制翻譯或促進mRNA去腺苷酸化來抑制蛋白質合成[15]。我們首次使用MiSeq探究FA對缺氧誘導hRMEC炎癥因子基因表達的調控作用，結果發現相較于缺氧組，FA干預組hRMEC中miRNA表達上調者9個，表達下調者5個。值得注意的是，miRNA靶基因預測結果中，hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-3170和hsa-miR-7976這4個上調miRNA的靶基因均包含ICAM-1，而miRNA的重要作用之一就是沉默下游mRNA的表達，這與我們RT-PCR結果中FA下調ICAM-1表達的結果相符合。
GO功能顯著性富集分析結果提示，FA作用后差異基因的生物學過程功能主要體現在細胞發育和細胞分化等方面，而差異基因主要參與包括細胞膜、細胞器膜在內的膜的形成。此外，在分子功能方面，差異基因參與IL-4R活性以及LTC4S活性的調控過程。IL-4能調節Th2細胞增生以及Ig合成，通過與IL-4R結合參與啟動信號和轉錄激活因子途徑的激活從而參與過敏性哮喘的發病過程[16-17]。KEGG通路顯著性富集分析結果提示，差異基因參與多條信號轉導通路和生化代謝通路，其中NK細胞介導的細胞毒性通路以及TRP通道的炎癥介質調節通路等與炎癥的發生相關。NK細胞是機體內重要的免疫細胞，其靶細胞包括某些腫瘤細胞、病毒感染細胞和自身組織細胞等，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節的過程中發揮重要作用[18]。Bigger等[19]研究發現，NK細胞的消耗會加劇巨細胞病毒性葡萄膜炎，體內實驗中通過睫狀體注射小鼠巨細胞病毒可顯著破壞小鼠視網膜。這提示NK細胞在巨細胞病毒性葡萄膜炎的病理過程中發揮重要作用。由此可見，FA在炎癥的相關生物學過程中發揮著一定作用。
中性粒細胞黏附到血管內皮細胞是心血管疾病中炎癥反應的病理基礎，在此過程中，ICAM-1起著關鍵作用[20]。有研究表明，結腸癌患者抵抗素能通過激活核因子-κB和ICAM-1的表達進而促進人結腸癌細胞與人臍靜脈內皮細胞的黏附，FA能夠抑制抵抗素的作用[21]。大量證據表明，氧化應激和炎癥是糖尿病患者視網膜血管病變的主要發病機制，氧化應激和ROS導致視網膜內皮細胞出現炎癥反應，從而引發內皮細胞損傷，微血管通透性增加和白細胞募集增加[22]。內皮細胞活化和白細胞與視網膜內皮的黏附增強是DR相關的最早兩個變化，它們參與視網膜內皮細胞損傷的發病機制和血視網膜屏障的破壞。研究表明，視網膜白細胞淤滯和白細胞與血管壁的黏附與視網膜ICAM-1的表達增加相關[23]。本研究首先觀察到FA對于炎癥的潛在治療作用，并通過miRNA測序分析的方法，尋找FA對抗炎癥的作用靶點，分析FA作用于缺氧刺激hRMEC后炎性因子改變的分子生物學機制。
本研究仍存在一定的局限性，轉錄組分析結果所篩選到的差異miRNA數量較少，雖然靶基因預測中有與炎癥反應密切相關的基因，且符合最初的實驗結果，但仍需要大量的后續實驗驗證miRNA和其靶基因對hRMEC的作用和功能。從整體上來看，DR的發病機制十分復雜，在后續的實驗中我們不僅會深入探究FA如何通過調控ICAM-1而發揮抗炎作用，同時也將采用多細胞模型更好詮釋FA的抗炎作用及機制，為FA應用于DR的治療提供理論基礎。
