準確的玻璃體、視網膜相關組織標本取材及保存方法是保證臨床診斷及開展嚴謹基礎研究的基礎。玻璃體標本取材的臨床用途包括微生物培養、細胞學檢測、變性性疾病檢測、PCR分析、液基細胞學檢測細胞形態等；實驗研究用途包括DNA基因分析、蛋白定量分析、代謝物檢查、RNA含量定量分析、細胞因子測定等。視網膜標本取材主要用于視網膜增生膜的PCR分析、免疫組織化學染色、免疫熒光檢查、微血管密度評價以及細胞分離和培養等。了解玻璃體視網膜手術標本的取材和相關檢測技術、材料的應用，可為玻璃體視網膜疾病的診斷提供更全面的思路及相關基礎研究提供更廣泛的參考。
引用本文： 陳瓊, 程朝暉, 胡博杰. 玻璃體和視網膜相關組織標本取材及應用研究現狀. 中華眼底病雜志, 2020, 36(5): 396-399. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190312-00091 復制
玻璃體、視網膜是眼球內重要結構，一旦發生病變將對人眼成像過程產生嚴重影響，甚至可能導致視力嚴重損害。玻璃體視網膜疾病病因復雜，診治方法多樣，玻璃體、視網膜手術學在醫療技術不斷進步及疾病診治率不斷提高的現狀下也進展迅速。對玻璃體視網膜手術取材的進一步研究，有助于細化臨床及基礎研究者對相關疾病的認識，也希望在進一步對玻璃體、視網膜疾病認識的基礎上，能對玻璃體、視網膜疾病的預防、診治、預后有所幫助。現就玻璃體、視網膜取材的相關研究作一綜述。
1 玻璃體
玻璃體是透明的膠體結構，其結構由膠原細纖維及充填其間的大分子透明質酸組成；膠原細纖維構成玻璃體的支架，使玻璃體具有一定的韌性和可塑性，是眼內屈光間質的重要組成部分[1]。玻璃體成分的獲取途徑主要有：（1）細針從平坦部進針連接注射器抽取所需玻璃體[2]。生理狀態下玻璃體為膠體結構，不易被注射器吸取，所以該方法適用于相對液化的玻璃體。（2）因玻璃體視網膜疾病行玻璃體切割手術時，在灌注開通之前切取未稀釋的玻璃體[3-4]。該方法獲取玻璃體時，注意一定是在灌注開通之前收集玻璃體于干燥容器中[5]。（3）因診斷眼內疾病需要，行診斷性玻璃體切割手術[6]。診斷性玻璃體切割時的取材部位首選中央部玻璃體，但在玻璃體病變不均勻時，為提高診斷的靈敏度或實驗取材的準確性可以選取病變部位的玻璃體。（4）尸體解剖時用注射器連接細針頭抽取玻璃體[7]。（5）眼球穿通傷時，于清創縫合之前取材相對未被污染的玻璃體成份[8]。以上方法取材玻璃體時均遵循外科手術的無菌原則，取材所得玻璃體可存于液氮罐中或低溫儲存待用[9]。有研究者提出玻璃體抽吸后，玻璃體腔注入適量廣譜抗生素作為取材手術后的初步處理方式[2]。放棄玻璃體取材的情況為任何原因導致的存在玻璃體積血的樣本[10]。
1.1 玻璃體取材的臨床用途
1.1.1 微生物培養
玻璃體分出一部分用于細菌及真菌培養。玻璃體迅速進行革蘭染色，經氫氧化鉀濕化涂片，接種于培養基上于相應鑒定目的條件下培養，每日檢查培養基，棄去直到觀察截止日期無菌落生長跡象的培養基。培養出的獨立菌落經API試紙進行鑒定[11]。有研究者提出玻璃體切割刀大小會影響玻璃體微生物學培養結果，較小地玻璃體切割刀（30G）獲取的標本培養陽性率為80%，而更大地玻璃體切割刀（25G/27G）獲取的標本培養陽性率僅為31%，且差異有統計學意義[2]。其具體原因有待更多研究者探索驗證。玻璃體的微生物學培養在臨床上主要用于感染性眼內炎的診斷及指導選擇敏感性抗生素[12]。
1.1.2 切片制備
獲取的玻璃體離心棄去上層清液，10%中性福爾馬林固定過夜，常規石蠟包埋切片。顯微鏡下記錄細胞數量、背景外觀、細胞類型和細胞異型性及壞死范圍。該石蠟切片細胞學檢測可用于眼內淋巴瘤等眼內惡性疾病的診斷和鑒別診斷[13]。
1.1.3 變性檢測
玻璃體標本恢復至室溫，剛果紅染色。顯示粗纖維聚集，偏振光下呈蘋果綠色至橙色二色雙折射，與淀粉樣變性一致。提示玻璃體淀粉樣變性。玻璃體淀粉樣變性可提示系統性疾病，有助于發現部分全身性疾病及家族性疾病，玻璃體變性檢測在無全身表現的非家族性原發性玻璃體淀粉樣變性等難以確診的疾病方面具有不可替代的優勢[14]。
1.1.4 PCR分析
DNA提取工具盒提取玻璃體標本中DNA，低溫儲存。應用針對16S rRNA基因具有特異性的細菌通用引物，進行PCR擴增[11]。將擴增混合液加入PCR反應體系，經變性、退火、延伸反應；第二輪PCR取第一輪擴增產物2 μl為模板，嵌套式正向和反向引物進行反應。擴增的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后顯像[11]。也有研究者從玻璃體中進行基因組DNA模板提取，經洗脫，構建PCR反應體系，從DNA擴增16S rDNA，按一般過程完成PCR過程，其產物經電泳分離并染色顯像[15]。玻璃體PCR技術可以更準確地確定病原菌，對疑似眼內炎患者進行抗生素治療時，可提供指導作用。但由于樣本量小、細菌負荷低、既往使用過抗生素以及微生物的挑剔特性等特點也使得這一方法的陽性率較低，未來的研究和實踐中需要更多的研究者攻堅克難。
1.1.5 液基細胞學檢查
玻璃體標品經液基細胞保存液保存，玻璃體與保存液于試管中按1:3混合至總容積1.2 ml，室溫孵育12 h，涂片并于95%酒精或10%福爾馬林緩沖液中處理10 min，伊紅染色后細胞免疫化學染色檢查[4]。玻璃體液基細胞學是細胞學診斷方法，可直接檢測細胞種類及數量從而做出診斷，液基細胞學檢查不僅可以直接觀察到變性的細胞，還可以結合細胞標記的方法識別更多的細胞及微生物等，液基細胞學診斷的準確性，還可通過相應細胞因子和趨化因子提高[4]。
1.2 玻璃體取材的基礎研究用途
1.2.1 DNA基因分析
有機提取尸體眼玻璃體DNA，利用PicoGreen dsDNA定量試劑和Fluoroskan Ascent FL對DNA進行熒光定量分析。該研究者是從法院尸檢途徑獲取玻璃體中的DNA，獲取的DNA可用于基礎實驗的進一步研究[16]。
1.2.2 蛋白定量分析
離心處理去除上層清液的玻璃體低溫儲存，按照ELISA原理對樣本進行加樣、復溫、孵化、反應、水洗、終止反應，吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值測定進行蛋白定量[3]。也有研究在測定玻璃體血紅蛋白濃度時用分光光度計（經典Harboe法）測定玻璃體中微摩爾濃度級的血紅蛋白含量[17]。玻璃體蛋白含量表達檢測可用于研究相關疾病病理機制和病程進展中的生物標記，為診斷及治療疾病提供更多的思路。
也有研究對尸體眼取材的玻璃體制備石蠟切片[18]。玻璃體腔注入10%甲醛溶液0.5 ml，其后置于10%甲醛溶液中24 h，以保持眼球的完整。石蠟包埋5 μm厚地樣本制備切片用于免疫熒光染色和熒光原位雜交。該方法利用抗原抗體的特異性反應用于檢測靶蛋白[18]。
1.2.3 代謝物檢查
每個標本分別采用水和氯仿進行萃取。將混合液渦旋、平衡、層析、分析[9]。玻璃體代謝物分析，旨在闡明不同代謝產物和代謝途徑與疾病的發生發展關系，從而為疾病的研究提供更多可能性參考。
尸體眼玻璃體鉀含量測定。玻璃體標本離心，為避免堵塞分析儀器的細管，取上層清液進行分析。尸體眼鉀離子隨時間濃度改變監測可在實踐中指導死亡執行方式的選擇[19]。尸體眼玻璃體重金屬定量，玻璃體組織先稱得濕重，然后于95 ℃環境中過夜晾干，隔日稱取干重，經組織溶解、加水、渦旋、質譜儀同步分析、稀釋，再將以上樣品經渦旋吸入氣動霧化器，產生的氣溶膠被導向熱等離子體用氬氣流放電。儀器表反應定義為分析物濃度和離子計數（分析物離子計數/內部標準離子計數）之間的線性關系，通過讀取底物的離子計數比率得到分析物濃度。以消化管液的濃度計算金屬組織的干濕重量[20]。
因玻璃體正常位于封閉的眼球內，尸體眼玻璃體改變受環境影響較小，其代謝物的分析在法醫鑒定中能夠提供較為準確的信息[21]。
1.2.4 RNA表達
玻璃體標本置于含無菌DNA酶的無核糖核酸酶冷凍管，低溫保存。離心，去除細胞碎片，將上層清液收集于另一支新地無菌離心管中，再次離心，取上清液低溫儲存備用于RNA量化或細胞因子測量。依實驗條件選用合適地RNA提取包進行純化。分光光度計評估RNA濃度和純度，純化的RNA低溫保存，待做進一步分析[22]。從相關RNA含量定性分析疾病，探測疾病引起的細胞分子水平變化，從而為疾病的診治探索新思路。
1.2.5 細胞因子測定
利用抗原抗體反應原理，應用測量相應底物所需的儀器和設備對玻璃體標本中的細胞因子進行定量分析[7, 23]，如應用ELISA進行細胞因子定量測定[22]。細胞因子的變化往往是疾病分子水平改變的表現，明確疾病分子水平的改變能為疾病的診治探明靶點。
2 視網膜及其前膜
視網膜是位于眼球壁內層透明的膜狀物，內為玻璃體腔，外側緊貼脈絡膜，前始于鋸齒緣，后止于視盤，是視覺形成的初始部位[24]。視網膜組織及其前膜（增生膜）的獲取途徑主要為玻璃體切割手術中，顯微鏡下分離纖維血管增生膜，眼內鑷夾住，切口處取出[23]，立即置于無鈣、無鎂平衡鹽溶液（BSS）的標本杯中。二級無菌生物安全條件下將膜分為小片，用于免疫組織化學檢查或細胞培養[25]。
2.1 視網膜增生膜
2.1.1 PCR分析
應用Trizol試劑從冷凍標本中提取和純化總RNA，按試劑盒要求進行逆轉錄合成DNA，PCR擴增DNA[26]。DNA在生物學行為中被轉錄為RNA，RNA指導蛋白質的合成。蛋白質在疾病的發生發展中具有重要作用，測定靶蛋白的DNA含量，對深化疾病的認識過程可提供重要信息。
2.1.2 免疫組織化學分析
利用免疫學中的抗原抗體反應，借助可見標記物，對相應抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。常用地免疫組織化學方法有熒光免疫和酶免疫組織化學技術、金標免疫組織化學技術和免疫電鏡技術[27]。
增生性玻璃體視網膜病變（PVR）增生膜于室溫下在含10%福爾馬林的Dulbecco緩沖液中固定24 h，然后存于4 ℃的緩沖液中待用于石蠟包埋。石蠟包埋后將其切成6 mm厚的連續切片，二甲苯脫蠟，于不同濃度的酒精中再水化，PBS液洗滌。切片應用相應抗體進行免疫組織化學檢查[25]。
也有研究者將剝離的視網膜前膜置于含4%多聚甲醛的試管中固定，然后嵌入最佳切割溫度化合物中進行免疫組織化學和免疫熒光檢查。復合物切片經室溫風干、溶解、清洗，切片用正常驢血清孵育30 min以阻斷非特異染色，然后與相應抗體反應，以檢測待測因子的量[26]。
2.1.3 免疫熒光檢查
對冷凍切片進行封閉，然后與相應單克隆抗體反應，熒光顯微鏡下觀察陽性反應的玻片[26]。另有文獻報道，切片脫蠟、脫水、沖洗后，微波法提取抗原作為預處理，牛血清白蛋白孵育30 min，最后與相應抗體進行孵育反應[28]。此外，有研究者將來自增生膜的細胞接種到細胞板上保存24～72 h，細胞經固定、洗滌、滲透、封閉處理。為識別具體細胞類型，增生膜細胞與異硫氰酸熒光素酯共軛的單克隆抗體一同孵育，分別與一抗、二抗進行孵育反應，PBS洗滌3次，蓋片，顯微鏡下記錄圖像[25]。采用基礎實驗原理對標本所含靶蛋白進行測定，于蛋白質水平探討疾病發生發展的特點，從而尋找靶向治療和診斷學方法，將繼續成為今后研究的一大熱點。
2.1.4 微血管密度評價
選取合適地視野計數，高倍顯微鏡下（×400）可直接計數增生型糖尿病視網膜病變（PDR）增生膜中CD31陽性的微血管數量[28]。特異性微血管密度的改變及與之相關其他細胞因子的改變，在特定疾病中的變化趨勢，往往提示疾病發生發展而產生的分子水平的改變。
2.1.5 細胞分離和培養
將PVR的增生膜轉移至含膠原酶Ⅱ及0.25%牛血清的PBS中，經孵育、吹打、再懸浮，最終將膜消化成單個細胞懸液。再將膜在Dulbecco改良的Eagle培養基中重新懸浮，并接種于48孔板上[25]。從PDR的視網膜前膜獲取的細胞，可用于細胞水平基礎研究。目前這一來源的細胞在基礎研究中多用作靶細胞。
2.2 黃斑前膜
有研究者在行23G玻璃體切割手術及玻璃體后脫離完成后，眼內鑷輔助下剝膜，亮藍染色，手術完畢時玻璃體腔填充BSS。獲取的黃斑前膜及內界膜（ILM）置于BSS中，細胞培養室進一步處理后，標本于顯微鏡下鋪平固定，行細胞培養及相應處理，最后行細胞免疫組織化學檢測[29]。研究黃斑前膜及ILM的細胞學行為，可為進一步探索玻璃體視網膜界面的病理表現以及抗纖維化治療提供參考[29]。
2.3 ILM
23G玻璃體切割手術完成玻璃體后脫離，關閉灌注、染色、沖洗、剝除ILM；超薄切片機將其切成5 mm厚切片，亞甲藍染色，光學顯微鏡觀察。也有研究者將ILM固定于含戊二醛的PBS中，固定、切片、染色，光學顯微鏡拍照。對于ILM的研究，揭示了ILM與黃斑前膜的組織成分關系。今后需大量研究闡明這些問題細胞和視網膜神經元之間的變化關系[30]。
2.4 視網膜
臨床及基礎研究對于視網膜的取材較少，最常見地取材及操作為視網膜獲取及視網膜細胞的制備與儲存，并將其用于基礎研究。由于該部分內容缺乏相應的參考文獻，在此不做詳細討論。
玻璃體視網膜手術標本取材及保存方法為正確的臨床診斷及嚴謹的基礎研究奠定基礎。經查閱中英文重要數據庫，對于玻璃體視網膜手術取材及保存方法鮮有綜述。本文希望能夠為玻璃體視網膜疾病的診斷提供更全面的思路及相關基礎研究提供更廣泛的參考。目前，玻璃體視網膜取材及保存弊端也較明顯，如通常單例取材所得組織較少、多數取材需在手術條件下或手術過程中獲取等。限制相關檢測技術發展的弊端，需要更多的研究來探索并克服。
玻璃體、視網膜是眼球內重要結構，一旦發生病變將對人眼成像過程產生嚴重影響，甚至可能導致視力嚴重損害。玻璃體視網膜疾病病因復雜，診治方法多樣，玻璃體、視網膜手術學在醫療技術不斷進步及疾病診治率不斷提高的現狀下也進展迅速。對玻璃體視網膜手術取材的進一步研究，有助于細化臨床及基礎研究者對相關疾病的認識，也希望在進一步對玻璃體、視網膜疾病認識的基礎上，能對玻璃體、視網膜疾病的預防、診治、預后有所幫助。現就玻璃體、視網膜取材的相關研究作一綜述。
1 玻璃體
玻璃體是透明的膠體結構，其結構由膠原細纖維及充填其間的大分子透明質酸組成；膠原細纖維構成玻璃體的支架，使玻璃體具有一定的韌性和可塑性，是眼內屈光間質的重要組成部分[1]。玻璃體成分的獲取途徑主要有：（1）細針從平坦部進針連接注射器抽取所需玻璃體[2]。生理狀態下玻璃體為膠體結構，不易被注射器吸取，所以該方法適用于相對液化的玻璃體。（2）因玻璃體視網膜疾病行玻璃體切割手術時，在灌注開通之前切取未稀釋的玻璃體[3-4]。該方法獲取玻璃體時，注意一定是在灌注開通之前收集玻璃體于干燥容器中[5]。（3）因診斷眼內疾病需要，行診斷性玻璃體切割手術[6]。診斷性玻璃體切割時的取材部位首選中央部玻璃體，但在玻璃體病變不均勻時，為提高診斷的靈敏度或實驗取材的準確性可以選取病變部位的玻璃體。（4）尸體解剖時用注射器連接細針頭抽取玻璃體[7]。（5）眼球穿通傷時，于清創縫合之前取材相對未被污染的玻璃體成份[8]。以上方法取材玻璃體時均遵循外科手術的無菌原則，取材所得玻璃體可存于液氮罐中或低溫儲存待用[9]。有研究者提出玻璃體抽吸后，玻璃體腔注入適量廣譜抗生素作為取材手術后的初步處理方式[2]。放棄玻璃體取材的情況為任何原因導致的存在玻璃體積血的樣本[10]。
1.1 玻璃體取材的臨床用途
1.1.1 微生物培養
玻璃體分出一部分用于細菌及真菌培養。玻璃體迅速進行革蘭染色，經氫氧化鉀濕化涂片，接種于培養基上于相應鑒定目的條件下培養，每日檢查培養基，棄去直到觀察截止日期無菌落生長跡象的培養基。培養出的獨立菌落經API試紙進行鑒定[11]。有研究者提出玻璃體切割刀大小會影響玻璃體微生物學培養結果，較小地玻璃體切割刀（30G）獲取的標本培養陽性率為80%，而更大地玻璃體切割刀（25G/27G）獲取的標本培養陽性率僅為31%，且差異有統計學意義[2]。其具體原因有待更多研究者探索驗證。玻璃體的微生物學培養在臨床上主要用于感染性眼內炎的診斷及指導選擇敏感性抗生素[12]。
1.1.2 切片制備
獲取的玻璃體離心棄去上層清液，10%中性福爾馬林固定過夜，常規石蠟包埋切片。顯微鏡下記錄細胞數量、背景外觀、細胞類型和細胞異型性及壞死范圍。該石蠟切片細胞學檢測可用于眼內淋巴瘤等眼內惡性疾病的診斷和鑒別診斷[13]。
1.1.3 變性檢測
玻璃體標本恢復至室溫，剛果紅染色。顯示粗纖維聚集，偏振光下呈蘋果綠色至橙色二色雙折射，與淀粉樣變性一致。提示玻璃體淀粉樣變性。玻璃體淀粉樣變性可提示系統性疾病，有助于發現部分全身性疾病及家族性疾病，玻璃體變性檢測在無全身表現的非家族性原發性玻璃體淀粉樣變性等難以確診的疾病方面具有不可替代的優勢[14]。
1.1.4 PCR分析
DNA提取工具盒提取玻璃體標本中DNA，低溫儲存。應用針對16S rRNA基因具有特異性的細菌通用引物，進行PCR擴增[11]。將擴增混合液加入PCR反應體系，經變性、退火、延伸反應；第二輪PCR取第一輪擴增產物2 μl為模板，嵌套式正向和反向引物進行反應。擴增的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后顯像[11]。也有研究者從玻璃體中進行基因組DNA模板提取，經洗脫，構建PCR反應體系，從DNA擴增16S rDNA，按一般過程完成PCR過程，其產物經電泳分離并染色顯像[15]。玻璃體PCR技術可以更準確地確定病原菌，對疑似眼內炎患者進行抗生素治療時，可提供指導作用。但由于樣本量小、細菌負荷低、既往使用過抗生素以及微生物的挑剔特性等特點也使得這一方法的陽性率較低，未來的研究和實踐中需要更多的研究者攻堅克難。
1.1.5 液基細胞學檢查
玻璃體標品經液基細胞保存液保存，玻璃體與保存液于試管中按1:3混合至總容積1.2 ml，室溫孵育12 h，涂片并于95%酒精或10%福爾馬林緩沖液中處理10 min，伊紅染色后細胞免疫化學染色檢查[4]。玻璃體液基細胞學是細胞學診斷方法，可直接檢測細胞種類及數量從而做出診斷，液基細胞學檢查不僅可以直接觀察到變性的細胞，還可以結合細胞標記的方法識別更多的細胞及微生物等，液基細胞學診斷的準確性，還可通過相應細胞因子和趨化因子提高[4]。
1.2 玻璃體取材的基礎研究用途
1.2.1 DNA基因分析
有機提取尸體眼玻璃體DNA，利用PicoGreen dsDNA定量試劑和Fluoroskan Ascent FL對DNA進行熒光定量分析。該研究者是從法院尸檢途徑獲取玻璃體中的DNA，獲取的DNA可用于基礎實驗的進一步研究[16]。
1.2.2 蛋白定量分析
離心處理去除上層清液的玻璃體低溫儲存，按照ELISA原理對樣本進行加樣、復溫、孵化、反應、水洗、終止反應，吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值測定進行蛋白定量[3]。也有研究在測定玻璃體血紅蛋白濃度時用分光光度計（經典Harboe法）測定玻璃體中微摩爾濃度級的血紅蛋白含量[17]。玻璃體蛋白含量表達檢測可用于研究相關疾病病理機制和病程進展中的生物標記，為診斷及治療疾病提供更多的思路。
也有研究對尸體眼取材的玻璃體制備石蠟切片[18]。玻璃體腔注入10%甲醛溶液0.5 ml，其后置于10%甲醛溶液中24 h，以保持眼球的完整。石蠟包埋5 μm厚地樣本制備切片用于免疫熒光染色和熒光原位雜交。該方法利用抗原抗體的特異性反應用于檢測靶蛋白[18]。
1.2.3 代謝物檢查
每個標本分別采用水和氯仿進行萃取。將混合液渦旋、平衡、層析、分析[9]。玻璃體代謝物分析，旨在闡明不同代謝產物和代謝途徑與疾病的發生發展關系，從而為疾病的研究提供更多可能性參考。
尸體眼玻璃體鉀含量測定。玻璃體標本離心，為避免堵塞分析儀器的細管，取上層清液進行分析。尸體眼鉀離子隨時間濃度改變監測可在實踐中指導死亡執行方式的選擇[19]。尸體眼玻璃體重金屬定量，玻璃體組織先稱得濕重，然后于95 ℃環境中過夜晾干，隔日稱取干重，經組織溶解、加水、渦旋、質譜儀同步分析、稀釋，再將以上樣品經渦旋吸入氣動霧化器，產生的氣溶膠被導向熱等離子體用氬氣流放電。儀器表反應定義為分析物濃度和離子計數（分析物離子計數/內部標準離子計數）之間的線性關系，通過讀取底物的離子計數比率得到分析物濃度。以消化管液的濃度計算金屬組織的干濕重量[20]。
因玻璃體正常位于封閉的眼球內，尸體眼玻璃體改變受環境影響較小，其代謝物的分析在法醫鑒定中能夠提供較為準確的信息[21]。
1.2.4 RNA表達
玻璃體標本置于含無菌DNA酶的無核糖核酸酶冷凍管，低溫保存。離心，去除細胞碎片，將上層清液收集于另一支新地無菌離心管中，再次離心，取上清液低溫儲存備用于RNA量化或細胞因子測量。依實驗條件選用合適地RNA提取包進行純化。分光光度計評估RNA濃度和純度，純化的RNA低溫保存，待做進一步分析[22]。從相關RNA含量定性分析疾病，探測疾病引起的細胞分子水平變化，從而為疾病的診治探索新思路。
1.2.5 細胞因子測定
利用抗原抗體反應原理，應用測量相應底物所需的儀器和設備對玻璃體標本中的細胞因子進行定量分析[7, 23]，如應用ELISA進行細胞因子定量測定[22]。細胞因子的變化往往是疾病分子水平改變的表現，明確疾病分子水平的改變能為疾病的診治探明靶點。
2 視網膜及其前膜
視網膜是位于眼球壁內層透明的膜狀物，內為玻璃體腔，外側緊貼脈絡膜，前始于鋸齒緣，后止于視盤，是視覺形成的初始部位[24]。視網膜組織及其前膜（增生膜）的獲取途徑主要為玻璃體切割手術中，顯微鏡下分離纖維血管增生膜，眼內鑷夾住，切口處取出[23]，立即置于無鈣、無鎂平衡鹽溶液（BSS）的標本杯中。二級無菌生物安全條件下將膜分為小片，用于免疫組織化學檢查或細胞培養[25]。
2.1 視網膜增生膜
2.1.1 PCR分析
應用Trizol試劑從冷凍標本中提取和純化總RNA，按試劑盒要求進行逆轉錄合成DNA，PCR擴增DNA[26]。DNA在生物學行為中被轉錄為RNA，RNA指導蛋白質的合成。蛋白質在疾病的發生發展中具有重要作用，測定靶蛋白的DNA含量，對深化疾病的認識過程可提供重要信息。
2.1.2 免疫組織化學分析
利用免疫學中的抗原抗體反應，借助可見標記物，對相應抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。常用地免疫組織化學方法有熒光免疫和酶免疫組織化學技術、金標免疫組織化學技術和免疫電鏡技術[27]。
增生性玻璃體視網膜病變（PVR）增生膜于室溫下在含10%福爾馬林的Dulbecco緩沖液中固定24 h，然后存于4 ℃的緩沖液中待用于石蠟包埋。石蠟包埋后將其切成6 mm厚的連續切片，二甲苯脫蠟，于不同濃度的酒精中再水化，PBS液洗滌。切片應用相應抗體進行免疫組織化學檢查[25]。
也有研究者將剝離的視網膜前膜置于含4%多聚甲醛的試管中固定，然后嵌入最佳切割溫度化合物中進行免疫組織化學和免疫熒光檢查。復合物切片經室溫風干、溶解、清洗，切片用正常驢血清孵育30 min以阻斷非特異染色，然后與相應抗體反應，以檢測待測因子的量[26]。
2.1.3 免疫熒光檢查
對冷凍切片進行封閉，然后與相應單克隆抗體反應，熒光顯微鏡下觀察陽性反應的玻片[26]。另有文獻報道，切片脫蠟、脫水、沖洗后，微波法提取抗原作為預處理，牛血清白蛋白孵育30 min，最后與相應抗體進行孵育反應[28]。此外，有研究者將來自增生膜的細胞接種到細胞板上保存24～72 h，細胞經固定、洗滌、滲透、封閉處理。為識別具體細胞類型，增生膜細胞與異硫氰酸熒光素酯共軛的單克隆抗體一同孵育，分別與一抗、二抗進行孵育反應，PBS洗滌3次，蓋片，顯微鏡下記錄圖像[25]。采用基礎實驗原理對標本所含靶蛋白進行測定，于蛋白質水平探討疾病發生發展的特點，從而尋找靶向治療和診斷學方法，將繼續成為今后研究的一大熱點。
2.1.4 微血管密度評價
選取合適地視野計數，高倍顯微鏡下（×400）可直接計數增生型糖尿病視網膜病變（PDR）增生膜中CD31陽性的微血管數量[28]。特異性微血管密度的改變及與之相關其他細胞因子的改變，在特定疾病中的變化趨勢，往往提示疾病發生發展而產生的分子水平的改變。
2.1.5 細胞分離和培養
將PVR的增生膜轉移至含膠原酶Ⅱ及0.25%牛血清的PBS中，經孵育、吹打、再懸浮，最終將膜消化成單個細胞懸液。再將膜在Dulbecco改良的Eagle培養基中重新懸浮，并接種于48孔板上[25]。從PDR的視網膜前膜獲取的細胞，可用于細胞水平基礎研究。目前這一來源的細胞在基礎研究中多用作靶細胞。
2.2 黃斑前膜
有研究者在行23G玻璃體切割手術及玻璃體后脫離完成后，眼內鑷輔助下剝膜，亮藍染色，手術完畢時玻璃體腔填充BSS。獲取的黃斑前膜及內界膜（ILM）置于BSS中，細胞培養室進一步處理后，標本于顯微鏡下鋪平固定，行細胞培養及相應處理，最后行細胞免疫組織化學檢測[29]。研究黃斑前膜及ILM的細胞學行為，可為進一步探索玻璃體視網膜界面的病理表現以及抗纖維化治療提供參考[29]。
2.3 ILM
23G玻璃體切割手術完成玻璃體后脫離，關閉灌注、染色、沖洗、剝除ILM；超薄切片機將其切成5 mm厚切片，亞甲藍染色，光學顯微鏡觀察。也有研究者將ILM固定于含戊二醛的PBS中，固定、切片、染色，光學顯微鏡拍照。對于ILM的研究，揭示了ILM與黃斑前膜的組織成分關系。今后需大量研究闡明這些問題細胞和視網膜神經元之間的變化關系[30]。
2.4 視網膜
臨床及基礎研究對于視網膜的取材較少，最常見地取材及操作為視網膜獲取及視網膜細胞的制備與儲存，并將其用于基礎研究。由于該部分內容缺乏相應的參考文獻，在此不做詳細討論。
玻璃體視網膜手術標本取材及保存方法為正確的臨床診斷及嚴謹的基礎研究奠定基礎。經查閱中英文重要數據庫，對于玻璃體視網膜手術取材及保存方法鮮有綜述。本文希望能夠為玻璃體視網膜疾病的診斷提供更全面的思路及相關基礎研究提供更廣泛的參考。目前，玻璃體視網膜取材及保存弊端也較明顯，如通常單例取材所得組織較少、多數取材需在手術條件下或手術過程中獲取等。限制相關檢測技術發展的弊端，需要更多的研究來探索并克服。