引用本文： 牛瑞, 東莉潔, 杜雪利, 何燕華, 聶澤彤, 崔偉娜, 陳瓊, 胡博杰. 卵泡抑素樣蛋白1在增生型糖尿病視網膜病變進程中的潛在作用機制初步探討. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 220-226. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190115-00024 復制
新生血管形成是增生型糖尿病視網膜病變（PDR）的主要特征，細胞損傷所致視網膜缺血、缺氧，是導致糖尿病視網膜病變（DR）進展的主要原因[1]。其中缺氧誘導多種血管生成相關因子表達，加劇DR進展[2-4]。識別促進DR發展的相關作用因子，可能為DR患者治療提供新思路[3]。已有研究發現，卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）在糖尿病進展中發揮作用[5]。FSTL1是一種分泌型糖蛋白，最初由小鼠MC3T3-E1成骨細胞系TGF-β1誘導[6]；廣泛存在于哺乳動物組織中，主要由間充質細胞產生[7]。FSTL1所屬酸性分泌蛋白和富含半胱氨酸家族在器官發生和人類疾病發病機制中發揮關鍵作用[7]。既往研究證實，缺氧導致FSTL1循環水平增加且在其他組織中是一種減輕低氧損傷的缺氧誘導因子，但這種保護作用在晚期逐漸失代償[6-8]。低氧暴露下FSTL1升高確切機制仍不明。本研究觀察PDR患者外周血中FSTL1表達，并構建缺氧細胞模型，初步探討其在缺氧條件下可能作用，為減緩PDR病程進展提供新的思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人視網膜血管內皮細胞（HRCEC）、人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）（天津醫科大學眼科醫院研究所自行保存）。PBS、Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）（上海源培生物科技股份有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺（美國Gibco公司）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；6、96孔板（美國Life technologies公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。
本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審核批準；所有受檢者均獲知情并簽署書面同意書。臨床檢查確診的PDR患者（PDR組）20例及正常人20名（正常組）納入研究。患者符合PDR診斷標準[9]。實時定量PCR（RT-PCR）檢測所有受檢者外周血中FSTL1、TGF-β1、結締組織生長因子（CTGF）mRNA表達水平。抽取受檢者外周血2～5 ml，EDTA抗凝，1800×g離心5 min。棄上清液，加入相同量PBS，3 ml紅細胞裂解液。離心，除去液層，得到含有外周血淋巴細胞的中間白色膜層，并置于15 ml離心管中，加入適量PBS，棄上清液，Trizol提取液裂解白細胞。
ELISA測定正常組、PDR組受檢者外周血中FSTL1、TGβ-1蛋白含量。外周血抗凝后保留上清液。每組3個副孔，實驗重復3次[10]。酶標儀測定波長450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。零孔設為對照，所有標準品和樣品A值減去零孔A值后，應用CurveEXperrtl.4軟件進行回歸擬合生成標準曲線，回歸分析確定最佳擬合曲線（r＞0.99）。得出待測樣品濃度并記錄數據。每個實驗在2個孔中進行。
細胞培養及分組。含10%胎牛血清的HRCEC及HUVEC完全培養基培養細胞（10 000 U/ml青霉素及10 000 g/ml鏈霉素），37 ℃、5%CO2培養箱培養。取第3代細胞用于實驗。將細胞分為HRCEC空白對照組、缺氧組；HUVEC空白對照組、缺氧組。缺氧組細胞于95%N2、5%CO2培養箱中分別培養3、6 h[11]，并據此再分為缺氧3 h組、缺氧6 h組；HRCEC、HUVEC空白對照組為常規培養細胞。
MTT比色法比較HRCEC及HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力。每組3個復孔，實驗重復3次。各組細胞終止培養后棄培養液，細胞培養板中每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，37 ℃培養箱中繼續孵育4 h，棄上清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min。ELISA儀測定波長490 nm處A值。
實時定量PCR（RT-PCR）檢測HRCEC及HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF mRNA表達。按Trizol提取液說明書抽提細胞總RNA，超微量分光光度計檢測濃度，A260/A280比值介于1.8～2.0用于后續實驗。使用具有oligo-dT引物的RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒進行逆轉錄。SYBR熒光染料、模板cDNA、正反向引物等比混合物行RT-PCR[12]，每組設3個復孔，實驗重復3次，數據以GAPDH標準化，采用2?ΔΔCT法進行數據分析。
ELISA測定HRCEC上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白含量。參照前述方法將細胞分為HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組。缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞進行缺氧3、6 h刺激，緩解24 h，2000×g離心20 min，取上清液，實驗重復3次。測定方法同前。
免疫熒光染色法檢測HRCEC及HUVEC中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF的蛋白表達。HRCEC及HUVEC于4%多聚甲醛中固定10 min，PBS洗滌3次，加入0.1%Triton X-100室溫下透化10 min。加入5%牛血清白蛋白封閉30 min，分別加入一抗FSTL1（1∶250）、TGF-β1（1∶250）、CTGF（1∶250）、VEGF（1∶250）按比例稀釋，4 ℃冰箱中孵育過夜。PBST洗滌蓋玻片，加入抗兔二抗室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌后，加入DAPI室溫下避光孵育5～10 min，PBS洗滌后封片，熒光正置顯微鏡觀察。
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。數據均呈正態分布，以均數土標準差（
±s）表示。受檢者血清中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA和蛋白比較行獨立樣本 t 檢驗；多組間細胞生存力、mRNA表達比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RT-PCR檢測結果顯示，與正常組比較，PDR組患者血清中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖1）。
表1
兩組受檢者外周血中各因子mRNA表達比較（
±s）
圖1
PDR組、正常組受試者外周血中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較。*P＜0.05
ELISA測定結果顯示，PDR組、正常組受檢者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達分別為（1.19±0.50）、（0.71±0.24）ng/ml和（734.03±116.45）、（649.36±44.23）ng/L；PDR組患者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達較正常組升高，差異有統計學意義（t=1.88、7.68，P=0.00、0.02）（圖2）。
圖2
正常組、PDR組受檢者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達比較。2A、2B分別示FSTL1、TGF-β1
MTT比色法測量結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力分別為0.61±0.06、0.66±0.05、0.64±0.04；三組細胞生存力比較，差異有統計學意義（F=13.02，P=0.00）（圖3A）；組間兩兩比較，缺氧3 h組、缺氧6 h組分別與HRCEC空白對照組細胞生存力比較，差異均有統計學意義（P=0.00、0.03）。HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力分別為0.59±0.04、0.63±0.06、0.68±0.06；三組細胞生存力比較，差異有統計學意義（F=26.52，P=0.00）（圖3B）；組間兩兩比較，缺氧3 h組、缺氧6 h組分別與HRCEC空白對照組細胞生存力比較，差異均有統計學意義（P=0.04、0.00）。
圖3
各組細胞生存力比較。3A示HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組；3B示HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組
RT-PCR檢測結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較，差異有統計學意義（F =14.75、44.93、85.54、6.23，P=0.01、0.00、0.00、0.03）。組間兩兩比較，缺氧3 h組與HRCEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.01、0.00、0.00、0.03），缺氧6 h組與HRCEC空白對照組之間的差異無統計學意義（P=0.94、1.00、0.13、0.25）（表2，圖4A）。HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=19.08、25.12、22.89、13.07，P=0.00、0.00、0.00、0.01）。組間兩兩比較，缺氧3 h組與HUVEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.00、0.04、0.00、0.02），缺氧6 h組與HUVEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.01、0.00、0.00、0.01）（表3，圖4B）。
表2
HRCEC不同組別細胞中各因子mRNA表達比較（
±s）
表3
HUVEC不同組別細胞中各因子mRNA表達比較（
±s）
圖4
各組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較。4A示HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組；4B示HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組
ELISA測定結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白表達分別為（172.27±3.44）、（183.70±5.39）、（176.38±15.87）ng/ml和（775.53± 8.29）、（845.40±23.83）、（841.30±32.36）ng/L。與HRCEC空白對照組上清液中FSTL1、TGF-β1 mRNA和蛋白表達比較，缺氧3 h組，mRNA表達差異均有統計學意義（P＜0.05）；缺氧6 h組，TGF-β1蛋白表達差異有統計學意義（P=0.03），FSTL1蛋白表達差異無統計學意義（P=0.09）（圖5）。
圖5
HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白表達比較。5A、5B分別示FSTL1、TGF-β1
免疫熒光染色結果顯示，缺氧3 h組、缺氧6 h組HRCEC、HUVEC中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白均呈陽性表達（圖6，7）。
圖6
HRCEC缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞免疫熒光顯微鏡像。6A~6D、6E~6H分別示缺氧3 h組、缺氧6 h組FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白呈陽性表達 DAPI ×20
圖7
HUVEC缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞免疫熒光顯微鏡像。7A~7D、7E~7H分別示缺氧3 h組、缺氧6 h組FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白呈陽性表達 DAPI ×20
3 討論
FSTL1為細胞外糖蛋白，最初從小鼠成骨細胞系中鑒定為TGF-β調節的基因[13]。既往研究已發現其在動物模型中既發揮抗炎又發揮促炎作用[13]。FSTL1作為損傷后誘導的分泌蛋白，可防止缺氧誘導的進一步損傷，然而其促進血管內皮細胞保護和功能的分子機制尚不完全清楚[13]。FSTL1具有細胞外鈣結合和卵泡抑素樣結構域，被歸類為白質的卵泡抑素家族成員[14]。卵泡抑素家族的其他成員通過其作為TGF-β超家族蛋白的細胞外結合伴侶的功能起作用，并拮抗這些配體與受體的結合[15]。然而，尚無研究證實FSTL1或卵泡抑素和FSTL3通過結合TGF-β超家族成員調節細胞功能[13]。
既往研究中，FSTL1作為一種分泌蛋白通過過表達以響應缺氧，并通過激活蘇氨酸蛋白激酶（Akt）和細胞外信號調節激酶（ERK）1/2信號通路保護細胞免受缺氧誘導的細胞凋亡，且保護相關組織免受缺血缺氧再灌注損傷并刺激血管重建[13, 16]。相關研究表明，FSTL1通過顯著抑制ERK信號通路抑制細胞的增生和遷移[7]。ERK是一種可被缺氧激活的關鍵酶[17]。而ERK及其下游VEGF信號通路起關鍵作用[18-19]。PDR患者VEGF是重要的組織因子，也是導致血管細胞分化和管形成的關鍵血管生成因子[18, 20]。因缺氧而分泌增多，導致PDR進一步發展[2, 21]。
TGF-β可激活ERK信號，CTGF活化ERK信號通路并增強其蛋白活性，同時ERK的活化也介導了CTGF表達[22-24]。有研究發現，敲低TGF-β表達可顯著降低VEGF表達，并降低了Akt-ERK的活化[25]。提示FSTL1與ERK通路及其下游因子VEGF及CTGF具有密切關系。FSTL1作為一種減輕低氧損傷的缺氧誘導基因，對血管重塑具有保護性調節[7]。但其保護作用程度有限，甚至對缺氧引起損傷的抵抗作用逐漸失代償[8]。故進一步探究FSTL1在缺氧誘導PDR加劇中的作用，將有助于進一步豐富FSTL1的作用機制，為緩解PDR病程進展提供新思路。
我們前期研究發現，PDR患者外周血中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達水平以及FSTL1、TGF-β蛋白表達水平較正常者增高。在前期研究基礎上，本研究觀察了缺氧時間對HRCEC的影響，發現缺氧時間為3、6 h時細胞均處于增生狀態，細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA和FSTL1、TGF-β1蛋白表達水平均較HRCEC空白對照組升高；缺氧對HRCEC及HUVEC有刺激作用，同時在缺氧條件作用下，FSTL1及TGF-β1等因子表達顯著增高，說明缺氧作為刺激條件，既對微血管內皮細胞有明顯影響，又對大中血管內皮細胞發揮作用，且FSTL1及TGF-β1等因子是其作用的響應因子。但具體FSTL1與TGF-β1、CTGF、VEGF等因子間的分子作用機制因其更為復雜，而有待進一步探討。
目前對于FSTL1的重要性仍有待動物模型及臨床研究結果加以驗證，本研究結果顯示，缺氧3、6 h時，HRCEC中FSTL1 mRNA和蛋白表達均升高；TGF-β1、CTGF、VEGF基因和蛋白表達也有相應增高。今后本研究還將對刺激或抑制FSTL1表達后進一步觀察相關因子變化，明確FSTL1在缺氧加劇PDR進展中的作用。多層面多角度發掘相關因子及作用，并納入更多的細胞模型，包括高糖誘導恒河猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A）聯合缺氧刺激、單純氧化應激刺激HRCEC或高糖誘導RF/6A聯合氧化應激刺激，以期通過多種方式模擬DR患者眼部微環境，進而探索FSTL1在PDR患者發生發展中的作用機制，為PDR進展提供治療思路。
新生血管形成是增生型糖尿病視網膜病變（PDR）的主要特征，細胞損傷所致視網膜缺血、缺氧，是導致糖尿病視網膜病變（DR）進展的主要原因[1]。其中缺氧誘導多種血管生成相關因子表達，加劇DR進展[2-4]。識別促進DR發展的相關作用因子，可能為DR患者治療提供新思路[3]。已有研究發現，卵泡抑素樣蛋白1（FSTL1）在糖尿病進展中發揮作用[5]。FSTL1是一種分泌型糖蛋白，最初由小鼠MC3T3-E1成骨細胞系TGF-β1誘導[6]；廣泛存在于哺乳動物組織中，主要由間充質細胞產生[7]。FSTL1所屬酸性分泌蛋白和富含半胱氨酸家族在器官發生和人類疾病發病機制中發揮關鍵作用[7]。既往研究證實，缺氧導致FSTL1循環水平增加且在其他組織中是一種減輕低氧損傷的缺氧誘導因子，但這種保護作用在晚期逐漸失代償[6-8]。低氧暴露下FSTL1升高確切機制仍不明。本研究觀察PDR患者外周血中FSTL1表達，并構建缺氧細胞模型，初步探討其在缺氧條件下可能作用，為減緩PDR病程進展提供新的思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人視網膜血管內皮細胞（HRCEC）、人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）（天津醫科大學眼科醫院研究所自行保存）。PBS、Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）（上海源培生物科技股份有限公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺（美國Gibco公司）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；6、96孔板（美國Life technologies公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。
本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會審核批準；所有受檢者均獲知情并簽署書面同意書。臨床檢查確診的PDR患者（PDR組）20例及正常人20名（正常組）納入研究。患者符合PDR診斷標準[9]。實時定量PCR（RT-PCR）檢測所有受檢者外周血中FSTL1、TGF-β1、結締組織生長因子（CTGF）mRNA表達水平。抽取受檢者外周血2～5 ml，EDTA抗凝，1800×g離心5 min。棄上清液，加入相同量PBS，3 ml紅細胞裂解液。離心，除去液層，得到含有外周血淋巴細胞的中間白色膜層，并置于15 ml離心管中，加入適量PBS，棄上清液，Trizol提取液裂解白細胞。
ELISA測定正常組、PDR組受檢者外周血中FSTL1、TGβ-1蛋白含量。外周血抗凝后保留上清液。每組3個副孔，實驗重復3次[10]。酶標儀測定波長450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。零孔設為對照，所有標準品和樣品A值減去零孔A值后，應用CurveEXperrtl.4軟件進行回歸擬合生成標準曲線，回歸分析確定最佳擬合曲線（r＞0.99）。得出待測樣品濃度并記錄數據。每個實驗在2個孔中進行。
細胞培養及分組。含10%胎牛血清的HRCEC及HUVEC完全培養基培養細胞（10 000 U/ml青霉素及10 000 g/ml鏈霉素），37 ℃、5%CO2培養箱培養。取第3代細胞用于實驗。將細胞分為HRCEC空白對照組、缺氧組；HUVEC空白對照組、缺氧組。缺氧組細胞于95%N2、5%CO2培養箱中分別培養3、6 h[11]，并據此再分為缺氧3 h組、缺氧6 h組；HRCEC、HUVEC空白對照組為常規培養細胞。
MTT比色法比較HRCEC及HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力。每組3個復孔，實驗重復3次。各組細胞終止培養后棄培養液，細胞培養板中每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，37 ℃培養箱中繼續孵育4 h，棄上清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min。ELISA儀測定波長490 nm處A值。
實時定量PCR（RT-PCR）檢測HRCEC及HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF mRNA表達。按Trizol提取液說明書抽提細胞總RNA，超微量分光光度計檢測濃度，A260/A280比值介于1.8～2.0用于后續實驗。使用具有oligo-dT引物的RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒進行逆轉錄。SYBR熒光染料、模板cDNA、正反向引物等比混合物行RT-PCR[12]，每組設3個復孔，實驗重復3次，數據以GAPDH標準化，采用2?ΔΔCT法進行數據分析。
ELISA測定HRCEC上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白含量。參照前述方法將細胞分為HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組。缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞進行缺氧3、6 h刺激，緩解24 h，2000×g離心20 min，取上清液，實驗重復3次。測定方法同前。
免疫熒光染色法檢測HRCEC及HUVEC中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF的蛋白表達。HRCEC及HUVEC于4%多聚甲醛中固定10 min，PBS洗滌3次，加入0.1%Triton X-100室溫下透化10 min。加入5%牛血清白蛋白封閉30 min，分別加入一抗FSTL1（1∶250）、TGF-β1（1∶250）、CTGF（1∶250）、VEGF（1∶250）按比例稀釋，4 ℃冰箱中孵育過夜。PBST洗滌蓋玻片，加入抗兔二抗室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌后，加入DAPI室溫下避光孵育5～10 min，PBS洗滌后封片，熒光正置顯微鏡觀察。
采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。數據均呈正態分布，以均數土標準差（±s）表示。受檢者血清中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA和蛋白比較行獨立樣本 t 檢驗；多組間細胞生存力、mRNA表達比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
RT-PCR檢測結果顯示，與正常組比較，PDR組患者血清中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖1）。
表1
兩組受檢者外周血中各因子mRNA表達比較（±s）
圖1
PDR組、正常組受試者外周血中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較。*P＜0.05
ELISA測定結果顯示，PDR組、正常組受檢者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達分別為（1.19±0.50）、（0.71±0.24）ng/ml和（734.03±116.45）、（649.36±44.23）ng/L；PDR組患者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達較正常組升高，差異有統計學意義（t=1.88、7.68，P=0.00、0.02）（圖2）。
圖2
正常組、PDR組受檢者血清中FSTL1、TGF-β1蛋白表達比較。2A、2B分別示FSTL1、TGF-β1
MTT比色法測量結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力分別為0.61±0.06、0.66±0.05、0.64±0.04；三組細胞生存力比較，差異有統計學意義（F=13.02，P=0.00）（圖3A）；組間兩兩比較，缺氧3 h組、缺氧6 h組分別與HRCEC空白對照組細胞生存力比較，差異均有統計學意義（P=0.00、0.03）。HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞生存力分別為0.59±0.04、0.63±0.06、0.68±0.06；三組細胞生存力比較，差異有統計學意義（F=26.52，P=0.00）（圖3B）；組間兩兩比較，缺氧3 h組、缺氧6 h組分別與HRCEC空白對照組細胞生存力比較，差異均有統計學意義（P=0.04、0.00）。
圖3
各組細胞生存力比較。3A示HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組；3B示HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組
RT-PCR檢測結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較，差異有統計學意義（F =14.75、44.93、85.54、6.23，P=0.01、0.00、0.00、0.03）。組間兩兩比較，缺氧3 h組與HRCEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.01、0.00、0.00、0.03），缺氧6 h組與HRCEC空白對照組之間的差異無統計學意義（P=0.94、1.00、0.13、0.25）（表2，圖4A）。HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=19.08、25.12、22.89、13.07，P=0.00、0.00、0.00、0.01）。組間兩兩比較，缺氧3 h組與HUVEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.00、0.04、0.00、0.02），缺氧6 h組與HUVEC空白對照組之間的差異有統計學意義（P=0.01、0.00、0.00、0.01）（表3，圖4B）。
表2
HRCEC不同組別細胞中各因子mRNA表達比較（±s）
表3
HUVEC不同組別細胞中各因子mRNA表達比較（±s）
圖4
各組細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達比較。4A示HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組；4B示HUVEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組
ELISA測定結果顯示，HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白表達分別為（172.27±3.44）、（183.70±5.39）、（176.38±15.87）ng/ml和（775.53± 8.29）、（845.40±23.83）、（841.30±32.36）ng/L。與HRCEC空白對照組上清液中FSTL1、TGF-β1 mRNA和蛋白表達比較，缺氧3 h組，mRNA表達差異均有統計學意義（P＜0.05）；缺氧6 h組，TGF-β1蛋白表達差異有統計學意義（P=0.03），FSTL1蛋白表達差異無統計學意義（P=0.09）（圖5）。
圖5
HRCEC空白對照組、缺氧3 h組、缺氧6 h組上清液中FSTL1、TGF-β1蛋白表達比較。5A、5B分別示FSTL1、TGF-β1
免疫熒光染色結果顯示，缺氧3 h組、缺氧6 h組HRCEC、HUVEC中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白均呈陽性表達（圖6，7）。
圖6
HRCEC缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞免疫熒光顯微鏡像。6A~6D、6E~6H分別示缺氧3 h組、缺氧6 h組FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白呈陽性表達 DAPI ×20
圖7
HUVEC缺氧3 h組、缺氧6 h組細胞免疫熒光顯微鏡像。7A~7D、7E~7H分別示缺氧3 h組、缺氧6 h組FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF蛋白呈陽性表達 DAPI ×20
3 討論
FSTL1為細胞外糖蛋白，最初從小鼠成骨細胞系中鑒定為TGF-β調節的基因[13]。既往研究已發現其在動物模型中既發揮抗炎又發揮促炎作用[13]。FSTL1作為損傷后誘導的分泌蛋白，可防止缺氧誘導的進一步損傷，然而其促進血管內皮細胞保護和功能的分子機制尚不完全清楚[13]。FSTL1具有細胞外鈣結合和卵泡抑素樣結構域，被歸類為白質的卵泡抑素家族成員[14]。卵泡抑素家族的其他成員通過其作為TGF-β超家族蛋白的細胞外結合伴侶的功能起作用，并拮抗這些配體與受體的結合[15]。然而，尚無研究證實FSTL1或卵泡抑素和FSTL3通過結合TGF-β超家族成員調節細胞功能[13]。
既往研究中，FSTL1作為一種分泌蛋白通過過表達以響應缺氧，并通過激活蘇氨酸蛋白激酶（Akt）和細胞外信號調節激酶（ERK）1/2信號通路保護細胞免受缺氧誘導的細胞凋亡，且保護相關組織免受缺血缺氧再灌注損傷并刺激血管重建[13, 16]。相關研究表明，FSTL1通過顯著抑制ERK信號通路抑制細胞的增生和遷移[7]。ERK是一種可被缺氧激活的關鍵酶[17]。而ERK及其下游VEGF信號通路起關鍵作用[18-19]。PDR患者VEGF是重要的組織因子，也是導致血管細胞分化和管形成的關鍵血管生成因子[18, 20]。因缺氧而分泌增多，導致PDR進一步發展[2, 21]。
TGF-β可激活ERK信號，CTGF活化ERK信號通路并增強其蛋白活性，同時ERK的活化也介導了CTGF表達[22-24]。有研究發現，敲低TGF-β表達可顯著降低VEGF表達，并降低了Akt-ERK的活化[25]。提示FSTL1與ERK通路及其下游因子VEGF及CTGF具有密切關系。FSTL1作為一種減輕低氧損傷的缺氧誘導基因，對血管重塑具有保護性調節[7]。但其保護作用程度有限，甚至對缺氧引起損傷的抵抗作用逐漸失代償[8]。故進一步探究FSTL1在缺氧誘導PDR加劇中的作用，將有助于進一步豐富FSTL1的作用機制，為緩解PDR病程進展提供新思路。
我們前期研究發現，PDR患者外周血中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA表達水平以及FSTL1、TGF-β蛋白表達水平較正常者增高。在前期研究基礎上，本研究觀察了缺氧時間對HRCEC的影響，發現缺氧時間為3、6 h時細胞均處于增生狀態，細胞中FSTL1、TGF-β1、CTGF、VEGF mRNA和FSTL1、TGF-β1蛋白表達水平均較HRCEC空白對照組升高；缺氧對HRCEC及HUVEC有刺激作用，同時在缺氧條件作用下，FSTL1及TGF-β1等因子表達顯著增高，說明缺氧作為刺激條件，既對微血管內皮細胞有明顯影響，又對大中血管內皮細胞發揮作用，且FSTL1及TGF-β1等因子是其作用的響應因子。但具體FSTL1與TGF-β1、CTGF、VEGF等因子間的分子作用機制因其更為復雜，而有待進一步探討。
目前對于FSTL1的重要性仍有待動物模型及臨床研究結果加以驗證，本研究結果顯示，缺氧3、6 h時，HRCEC中FSTL1 mRNA和蛋白表達均升高；TGF-β1、CTGF、VEGF基因和蛋白表達也有相應增高。今后本研究還將對刺激或抑制FSTL1表達后進一步觀察相關因子變化，明確FSTL1在缺氧加劇PDR進展中的作用。多層面多角度發掘相關因子及作用，并納入更多的細胞模型，包括高糖誘導恒河猴視網膜血管內皮細胞（RF/6A）聯合缺氧刺激、單純氧化應激刺激HRCEC或高糖誘導RF/6A聯合氧化應激刺激，以期通過多種方式模擬DR患者眼部微環境，進而探索FSTL1在PDR患者發生發展中的作用機制，為PDR進展提供治療思路。
