引用本文： 崔璟琳, 路航, 陳晶, 駱濱江, 修巍威, 李慧美, 黃嬌, 陳禹含, 陳敬予. 小鼠眼血管內皮生長因子家族基因相關性研究. 中華眼底病雜志, 2020, 36(3): 211-219. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20180803-00269 復制
血管形成的機制較為復雜，涉及因素較多，而VEGF是血管生成的主要調節因素[1]。已有大量研究表明，VEGF在新生血管性老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變和新生血管性青光眼等許多眼部疾病中有較高表達[2-3]。VEGF家族由VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF和胎盤生長因子（PlGF）7種分泌糖蛋白組成[4-6]。目前常用于治療新生血管性眼部疾病的抗VEGF藥物分為單克隆抗體（單靶點）和受體融合蛋白（多靶點）兩類，單克隆抗體類藥物作用的靶點為VEGFA，受體融合蛋白類藥物作用的靶點為VEGFA、VEGFB和PlGF[7]。雖然近年來抗VEGF藥物在治療新生血管性眼病方面表現出優異的療效，但對于單靶點與多靶點藥物的作用差異一直存在爭議。由于這些藥物作用靶點位于VEGF家族中不同的基因或區域，我們推測其可能通過不同的分子途徑發揮拮抗作用，并由此導致其藥物療效表現不同。為此，本實驗研究設計分析了小鼠眼VEGF家族基因VEGFA、VEGFB和VEGFC之間功能和作用途徑的異同，以期為揭示不同種類抗VEGF藥物的作用機制和敏感性差異提供分子基因學依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
從HEIMED Eye M430v2（Sep08）RMA全基因組數據庫（http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py）中提取VEGFA、VEGFB和VEGFC的表達譜。對基因芯片中使用的VEGF基因探針序列進行鑒定，并比較它們的表達水平，以連鎖群體顯著水平閾值（LRS）表示。其中VEGFA包含VEGFA 1420909、VEGFA 1451959共2個探針，VEGFB包含1個探針VEGFB 1451803，VEGFC包含VEGFC 1419417、VEGFC 1440739、VEGFC 1439766共3個探針。收集6種探針的表達水平數據進行相關性分析，其中每個探針的表達都包含相應基因所有BXD近交系（RI）菌株、親本株、正反交和BALB/cByJ小鼠數據。將每種基因的BXD RI菌株及其親本株中的表達作為一組，通過相互比較不同兩組基因間的表達水平，得出r值。用“強、弱、無”的標準來評估它們之間的相關性。當r值≥0.70或≤－0.70時，為相關性強；當r值介于0.35～0.69之間或－0.35～－0.69之間時，為相關性弱；當r值介于0.00～0.35或0.00～－0.35之間時，為無相關性[8]。
應用GeneNetwork網絡的矩陣函數工具進一步研究VEGF家族基因間的相關性，分析與VEGFA、VEGFB和VEGFC高度相關的前50個基因之間的關系[9]。自HEIMED數據庫中收集提取與6個探針各自表達水平密切相關的排名前50個基因（Top50），每組的50個基因分別表示為50a1、50a2、50b、50c1、50c2和50c3，以代表它們對應的VEGFA 1420909、VEGFA 1451959、VEGFB 1451803、VEGFC 1419417、VEGFC 1440739和VEGFC 1439766探針。構建任意兩組共100個基因之間的基因網絡對比分析，檢驗它們之間的關系。將每組的Top50基因與和其相對應的VEGF家族基因相比較得出一組相關性R值，進一步將兩組基因的50個R值進行比較。用R50n1n2表示其相關性，n為基因數，此處為51～1。例如，50個VEGFA最相關的基因與VEGFA之間相比得到的R值同50個VEGFB最相關的基因與VEGFB相比得到的R值進行比較，則這兩組R值之間的相關性表示為R50ab，據此得出的數據繪制圖表。圓形線上垂直列出的數字為不同水平的R值，外層列出的g1～50表示這50個基因的基因序號。
采用基因網絡繪圖工具對調控每個探針表達水平的基因組區或表達數量性狀位點（eQTL）進行定位，用區間作圖法定位eQTL，進行2000引導試驗以估計其暗示水平（P＜0.05）和顯著水平（P＜0.01）。利用Excel統計函數進行基因表達水平相關性分析，以Genenetwork中的功能統計工具計算Top50基因的相關性，以P≥0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 VEGFA、VEGFB、VEGFC在小鼠眼中的表達
在BXD小鼠眼中，VEGFA 1420909、VEGFA 1451959均有較高表達，平均分別為10.3和9.5；VEGFB 1451803表達水平也較高，平均為9.9；VEGFC 1419417、VEGFC 1440739和VEGFC 1439766表達水平較低，平均分別為6.3、6.7和6.9（圖1，表1）。
表1
BXD小鼠眼VEGF基因探針表達水平
圖1
BXD小鼠眼VEGF基因探針表達水平。1A示VEGFA 1420909；1B示VEGFA 1451959；1C示VEGFB 1451803；1D示VEGFC 1419417；1E示VEGFC 1440739；1F示VEGFC 1439766
2.2 各基因間相關性的總體比較
矩陣比較結果顯示，VEGFC的2個探針VEGFC 1440739和VEGFC 1419417之間呈強正相關（P＜0.01），但VEGFC 1440739和VEGFC 1419417與其他任何探針均沒有強相關性（P＞0.05）；VEGFA 1420909與VEGFC 1440739、VEGFA 1451959與VEGFB 1451803、VEGFC 1419417與其他5個基因均呈弱正相關（P＜0.05），VEGFA 1451959與VEGFC 1419417/VEGFC 1439766、VEGFB 1451803與VEGFC 1439766呈弱負相關（P＜0.05）；而VEGFA 1420909與除VEGFC 1440739之外的4個基因、VEGFA 1451959與VEGFC 1440739、VEGFB 1451803與VEGFA 1420909/VEGFC 1419417/VEGFC 1440739均無相關性（P＞0.05）（圖2，表2）。
圖2
VEGFA、VEGFB和VEGFC基因之間的相關性分析圖。紅色線條：r= 0.70~1.00；黃色線條：r= 0.50~0.70；粉色線條：r= 0.00~0.50；黑色線條：r=－0.50~0.00；綠色線條：r=－0.70~－0.50；藍色線條：r=－1.00~－0.70
表2
VEGFA、VEGFB和VEGFC基因之間的相關性r值
2.3 VEGFA、VEGFB和VEGFC的Top50基因之間的相關性分析
VEGFA 1451959與VEGFB 1451803的大多數Top50基因呈中度正相關；來自VEGFC的3個探針均與VEGFA 1451959的Top50基因呈負相關；VEGFA的2個探針Top50中除1個基因（Gene38）顯示與VEGFB 1451803呈中強度正相關之外，其余基因均顯示與VEGFB 1451803的Top50呈弱負相關；除1個基因（Gene38）為中強度正相關外，VEGFC的3個探針與VEGFB 1451803的Top50基因之間總體是反向負相關；VEGFA 1420909與VEGFC 1440739的Top50基因總體呈弱正相關，而VEGFA 1451959與其呈負相關；VEGFB 1451803與VEGFC 1440739的Top50基因呈負相關（圖3）。
圖3
VEGFA、VEGFB和VEGFC的Top50基因之間相關性分析圖。3A示VEGFA 1451959與VEGFB 1451803的Top50基因相關性；3B示VEGFA 1451959與VEGFC 3個探針的Top50基因相關性；3C示VEGFB 1451803與VEGFC 3個探針的Top50基因相關性；3D示VEGFB 1451803與VEGFA 2個探針的Top50基因相關性；3E示VEGFC1440739與VEGFA 2個探針的Top50基因相關性；3F示VEGFC 1440739與VEGFB 1451803的Top50基因相關性
2.4 調節小鼠眼VEGFA、VEGFB和VEGFC表達水平的eQTLs分析
對BXD小鼠眼VEGF家族中每個基因探針的eQTL進行定位和檢測，共鑒定出1個eQTL達到顯著水平閾值（LRS=18.0，P＜0.01），8個eQTL達到暗示水平（LRS=10.5～17.0，P＜0.05）；其中3個來自VEGFA 1420909探針，2個來自VEGFA 1451959探針，VEGFB 1451803、VEGFC 1419417和VEGFC 1439766各包含1個（圖4）。這些探針中沒有一個eQTL位于同一染色體上。
圖4
VEGF家族基因中每個探針的eQTL位置和LRS。4A~4F分別示VEGFA 1420909、VEGFA 1451959、VEGFB 1451803、VEGFC 1419417、VEGFC 1440739、VEGFC 1439766。圖上方數字表示染色體數目；圖形頂部的粉色線表示顯著水平的閾值；淺灰色線表示暗示水平的閾值。圖中綠色線條（正加系數）表明DBA/2J等位基因增高的性狀值；紅色線條（負加系數）表明C57BL/6J等位基因增高的性狀值；藍色線條表示LRS的綜合分數
3 討論
新生血管形成的實現依賴于其促生長因子和生長抑制因子的平衡[7]。本研究結果表明，在BXD小鼠眼VEGF基因中VEGFA、VEGFB和VEGFC各探針的表達水平并不存在較顯著的相關性。因此，抑制其中一個基因的表達可能并不會影響其他基因的表達水平。同樣，一個基因調節因子的改變或突變也可能不會影響其他基因的表達水平。根據本實驗的數據可以假設，VEGF家族發揮作用的分子通路大致可分為兩組，即VEGFA和其他基因。表達水平與VEGFA最相關的前50位基因與其他VEGF基因的表達水平關系不大。這些數據支持VEGFA有自身的分子通路并發揮作用。另一方面，與VEGFB和VEGFC分別相關的前50個基因有時與另外兩個基因相關，因此證明這兩個基因與其他基因可能有少部分相似的分子路徑。
VEGFA是迄今為止描述的最有效的促血管生成基因，它能誘導內皮細胞的增生、發芽和管腔形成[10]。VEGFA在小鼠中的獨特表達模式和途徑表明了其在血管發生中的重要作用，它影響重要的血管生成過程，包括傷口愈合、排卵、血壓維持、月經和妊娠[11]。本研究結果表明，在小鼠眼中VEGFB偶爾與VEGFA有關聯，而大部分與VEGFC相關性更高。
有研究報道，VEGFB與VEGFA165的氨基酸序列的同源性為47%[12-13]。然而，在本研究中，這兩種基因之間的同源性似乎并不高，因為在與他們分別相關的50個基因中只有1個VEGFB的基因表達與VEGFA基因有較強的正相關性，而其余的基因與VEGFA可能有著不同的功能和機制。有研究表明，與VEGF家族成員的其他成員相比，VEGFB有著獨特的功能和機制，其在正常條件下沒有明顯的活性[14]。然而，VEGFB的過表達促進病理性視網膜、脈絡膜新生血管和血視網膜屏障的分解破壞，在不引起炎癥的情況下促進血管通透性增加，從而參與視網膜新生血管發生發展[15]。此外，最近有報道顯示，在激光損傷引起的脈絡膜新生血管模型和缺血誘導的視網膜新生血管模型中，視網膜下注射腺相關病毒載體（AAV）-VEGF-B167或AAV-VEGF-B186增強了視網膜和脈絡膜的新生血管形成[16]。因此，即使VEGFB在新生血管生長中作用并不是直接的，但其活性的增加在眼部新血管形成方面仍起到重要作用[15]。這提示靶向抑制VEGFB也可能對眼部新生血管性疾病具有治療意義[14]。
本研究結果顯示，VEGFC的表達模式和途徑與VEGFA的表達方式和途徑有部分弱正關聯性。早期實驗證明，VEGFC誘導選擇性淋巴管生成而不伴有血管生成；在轉基因小鼠中，病毒產生的VEGFC誘導血管發生了許多變化，并促進了裸鼠皮膚血管的滲漏[17-18]。Enholm等[19]也得到了類似的結果。
HEIMED Eye M430v2（Sep08）RMA數據集（http://gn1.genenetwork.org/webqtl/main.py）來自103個基因的小鼠的眼內表達數據，包括68個BXD RI菌株、親本株（C57BL/6J和DBA/2J）、正反交和BALB/cByJ小鼠。基因表達數據用來自美國Illumina公司生產的全基因組6代小鼠芯片生成。目前，這是眼RI菌株全基因組表達譜中最大的群體。在對小鼠眼內全基因組數據集表達水平的分析中，VEGFB 1451803探針在18.0處有較高的相對表達水平，可作為調控VEGFB表達的基因之一，但其與VEGF家族其他基因無明顯相關性。在與VEGFB高度相關的50個基因中，有1個基因的表達水平與VEGFA呈負相關，與VEGFA和VEGFB分別相關的50個基因間有著負相關性。這提示VEGFA和VEGFB可能是反向調控基因，或者通過不同的分子途徑發揮生理作用。對于VEGFC 1440739來說，與其密切相關的前50個基因部分與VEGFA的1個探針呈弱正相關。這提示VEGFC與VEGFA可能具有部分相似的分子通路，共同促進新生血管的形成，但其協同作用并不強。它們的關系也在小鼠腎（小鼠腎性平衡m430v2）全基因組表達數據（http://gn1.genenetwork.org/webqtl/main.py?FormID=sharinginfo&GN_AccessionId=239，該數據包含70株遺傳多樣性小鼠成人腎臟mRNA表達的基因表達譜，54株BXD重組自交菌株、15株自交系和1株F1雜交株D2B6F1）中被進一步證實，即VEGFC和VEGFA無相關或呈負相關[20]。
根據eQTL分析結果，VEGF基因探針中eQTL均位于不同的染色體上。這一信息表明，這些基因在VEGF家族中的表達水平的調控機制可能是不同的。據此推測，VEGFA在新生血管的形成中起主要作用，而VEGF家族的其他成員也共同參與了新生血管的形成和發展，其作用不容忽視。因此，抑制VEGFA的單一靶點類藥物可能并不能完全阻斷新生血管的產生和發展。
目前鑒定的VEGF受體（VEGFR）被命名為VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和神經纖毛蛋白（NP）-1、NP-2[21]。VEGFA與VEGFR-1、VEGFR-2、NP-1和NP-2結合；VEGFB與VEGFR-1和NP-1結合，但不與VEGFR-2或VEGFR-3結合；VEGFC與VEGFR-2和VEGFR-3結合；而PlGF與VEGFR-1、NP-1和NP-2結合。有研究表明，PlGF聯合VEGFR-1后，VEGF和VEGFR-2的結合增強[22]。這表明PlGF或可作為治療眼底新生血管性疾病的另一潛在靶點。由于VEGF和VEGFR之間結合的復雜性和相互作用，也從另一方面解釋了病理性血管生成不是單一的基因效應。
本實驗研究是基于小鼠眼VEGF基因數據而得出的結論，與其他使用動物模型的研究一樣，這些數據需要在人類試驗中加以證實，且關于VEGF家族基因的分子調控途徑差異還需進一步研究。因現有的大多數抗VEGF藥物都是人源化的，在非靈長類動物的研究中所得結果可能與人類和其他靈長類動物存在不同。
血管形成的機制較為復雜，涉及因素較多，而VEGF是血管生成的主要調節因素[1]。已有大量研究表明，VEGF在新生血管性老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變和新生血管性青光眼等許多眼部疾病中有較高表達[2-3]。VEGF家族由VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF和胎盤生長因子（PlGF）7種分泌糖蛋白組成[4-6]。目前常用于治療新生血管性眼部疾病的抗VEGF藥物分為單克隆抗體（單靶點）和受體融合蛋白（多靶點）兩類，單克隆抗體類藥物作用的靶點為VEGFA，受體融合蛋白類藥物作用的靶點為VEGFA、VEGFB和PlGF[7]。雖然近年來抗VEGF藥物在治療新生血管性眼病方面表現出優異的療效，但對于單靶點與多靶點藥物的作用差異一直存在爭議。由于這些藥物作用靶點位于VEGF家族中不同的基因或區域，我們推測其可能通過不同的分子途徑發揮拮抗作用，并由此導致其藥物療效表現不同。為此，本實驗研究設計分析了小鼠眼VEGF家族基因VEGFA、VEGFB和VEGFC之間功能和作用途徑的異同，以期為揭示不同種類抗VEGF藥物的作用機制和敏感性差異提供分子基因學依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
從HEIMED Eye M430v2（Sep08）RMA全基因組數據庫（http://www.genenetwork.org/webqtl/main.py）中提取VEGFA、VEGFB和VEGFC的表達譜。對基因芯片中使用的VEGF基因探針序列進行鑒定，并比較它們的表達水平，以連鎖群體顯著水平閾值（LRS）表示。其中VEGFA包含VEGFA 1420909、VEGFA 1451959共2個探針，VEGFB包含1個探針VEGFB 1451803，VEGFC包含VEGFC 1419417、VEGFC 1440739、VEGFC 1439766共3個探針。收集6種探針的表達水平數據進行相關性分析，其中每個探針的表達都包含相應基因所有BXD近交系（RI）菌株、親本株、正反交和BALB/cByJ小鼠數據。將每種基因的BXD RI菌株及其親本株中的表達作為一組，通過相互比較不同兩組基因間的表達水平，得出r值。用“強、弱、無”的標準來評估它們之間的相關性。當r值≥0.70或≤－0.70時，為相關性強；當r值介于0.35～0.69之間或－0.35～－0.69之間時，為相關性弱；當r值介于0.00～0.35或0.00～－0.35之間時，為無相關性[8]。
應用GeneNetwork網絡的矩陣函數工具進一步研究VEGF家族基因間的相關性，分析與VEGFA、VEGFB和VEGFC高度相關的前50個基因之間的關系[9]。自HEIMED數據庫中收集提取與6個探針各自表達水平密切相關的排名前50個基因（Top50），每組的50個基因分別表示為50a1、50a2、50b、50c1、50c2和50c3，以代表它們對應的VEGFA 1420909、VEGFA 1451959、VEGFB 1451803、VEGFC 1419417、VEGFC 1440739和VEGFC 1439766探針。構建任意兩組共100個基因之間的基因網絡對比分析，檢驗它們之間的關系。將每組的Top50基因與和其相對應的VEGF家族基因相比較得出一組相關性R值，進一步將兩組基因的50個R值進行比較。用R50n1n2表示其相關性，n為基因數，此處為51～1。例如，50個VEGFA最相關的基因與VEGFA之間相比得到的R值同50個VEGFB最相關的基因與VEGFB相比得到的R值進行比較，則這兩組R值之間的相關性表示為R50ab，據此得出的數據繪制圖表。圓形線上垂直列出的數字為不同水平的R值，外層列出的g1～50表示這50個基因的基因序號。
采用基因網絡繪圖工具對調控每個探針表達水平的基因組區或表達數量性狀位點（eQTL）進行定位，用區間作圖法定位eQTL，進行2000引導試驗以估計其暗示水平（P＜0.05）和顯著水平（P＜0.01）。利用Excel統計函數進行基因表達水平相關性分析，以Genenetwork中的功能統計工具計算Top50基因的相關性，以P≥0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 VEGFA、VEGFB、VEGFC在小鼠眼中的表達
在BXD小鼠眼中，VEGFA 1420909、VEGFA 1451959均有較高表達，平均分別為10.3和9.5；VEGFB 1451803表達水平也較高，平均為9.9；VEGFC 1419417、VEGFC 1440739和VEGFC 1439766表達水平較低，平均分別為6.3、6.7和6.9（圖1，表1）。
表1
BXD小鼠眼VEGF基因探針表達水平
圖1
BXD小鼠眼VEGF基因探針表達水平。1A示VEGFA 1420909；1B示VEGFA 1451959；1C示VEGFB 1451803；1D示VEGFC 1419417；1E示VEGFC 1440739；1F示VEGFC 1439766
2.2 各基因間相關性的總體比較
矩陣比較結果顯示，VEGFC的2個探針VEGFC 1440739和VEGFC 1419417之間呈強正相關（P＜0.01），但VEGFC 1440739和VEGFC 1419417與其他任何探針均沒有強相關性（P＞0.05）；VEGFA 1420909與VEGFC 1440739、VEGFA 1451959與VEGFB 1451803、VEGFC 1419417與其他5個基因均呈弱正相關（P＜0.05），VEGFA 1451959與VEGFC 1419417/VEGFC 1439766、VEGFB 1451803與VEGFC 1439766呈弱負相關（P＜0.05）；而VEGFA 1420909與除VEGFC 1440739之外的4個基因、VEGFA 1451959與VEGFC 1440739、VEGFB 1451803與VEGFA 1420909/VEGFC 1419417/VEGFC 1440739均無相關性（P＞0.05）（圖2，表2）。
圖2
VEGFA、VEGFB和VEGFC基因之間的相關性分析圖。紅色線條：r= 0.70~1.00；黃色線條：r= 0.50~0.70；粉色線條：r= 0.00~0.50；黑色線條：r=－0.50~0.00；綠色線條：r=－0.70~－0.50；藍色線條：r=－1.00~－0.70
表2
VEGFA、VEGFB和VEGFC基因之間的相關性r值
2.3 VEGFA、VEGFB和VEGFC的Top50基因之間的相關性分析
VEGFA 1451959與VEGFB 1451803的大多數Top50基因呈中度正相關；來自VEGFC的3個探針均與VEGFA 1451959的Top50基因呈負相關；VEGFA的2個探針Top50中除1個基因（Gene38）顯示與VEGFB 1451803呈中強度正相關之外，其余基因均顯示與VEGFB 1451803的Top50呈弱負相關；除1個基因（Gene38）為中強度正相關外，VEGFC的3個探針與VEGFB 1451803的Top50基因之間總體是反向負相關；VEGFA 1420909與VEGFC 1440739的Top50基因總體呈弱正相關，而VEGFA 1451959與其呈負相關；VEGFB 1451803與VEGFC 1440739的Top50基因呈負相關（圖3）。
圖3
VEGFA、VEGFB和VEGFC的Top50基因之間相關性分析圖。3A示VEGFA 1451959與VEGFB 1451803的Top50基因相關性；3B示VEGFA 1451959與VEGFC 3個探針的Top50基因相關性；3C示VEGFB 1451803與VEGFC 3個探針的Top50基因相關性；3D示VEGFB 1451803與VEGFA 2個探針的Top50基因相關性；3E示VEGFC1440739與VEGFA 2個探針的Top50基因相關性；3F示VEGFC 1440739與VEGFB 1451803的Top50基因相關性
2.4 調節小鼠眼VEGFA、VEGFB和VEGFC表達水平的eQTLs分析
對BXD小鼠眼VEGF家族中每個基因探針的eQTL進行定位和檢測，共鑒定出1個eQTL達到顯著水平閾值（LRS=18.0，P＜0.01），8個eQTL達到暗示水平（LRS=10.5～17.0，P＜0.05）；其中3個來自VEGFA 1420909探針，2個來自VEGFA 1451959探針，VEGFB 1451803、VEGFC 1419417和VEGFC 1439766各包含1個（圖4）。這些探針中沒有一個eQTL位于同一染色體上。
圖4
VEGF家族基因中每個探針的eQTL位置和LRS。4A~4F分別示VEGFA 1420909、VEGFA 1451959、VEGFB 1451803、VEGFC 1419417、VEGFC 1440739、VEGFC 1439766。圖上方數字表示染色體數目；圖形頂部的粉色線表示顯著水平的閾值；淺灰色線表示暗示水平的閾值。圖中綠色線條（正加系數）表明DBA/2J等位基因增高的性狀值；紅色線條（負加系數）表明C57BL/6J等位基因增高的性狀值；藍色線條表示LRS的綜合分數
3 討論
新生血管形成的實現依賴于其促生長因子和生長抑制因子的平衡[7]。本研究結果表明，在BXD小鼠眼VEGF基因中VEGFA、VEGFB和VEGFC各探針的表達水平并不存在較顯著的相關性。因此，抑制其中一個基因的表達可能并不會影響其他基因的表達水平。同樣，一個基因調節因子的改變或突變也可能不會影響其他基因的表達水平。根據本實驗的數據可以假設，VEGF家族發揮作用的分子通路大致可分為兩組，即VEGFA和其他基因。表達水平與VEGFA最相關的前50位基因與其他VEGF基因的表達水平關系不大。這些數據支持VEGFA有自身的分子通路并發揮作用。另一方面，與VEGFB和VEGFC分別相關的前50個基因有時與另外兩個基因相關，因此證明這兩個基因與其他基因可能有少部分相似的分子路徑。
VEGFA是迄今為止描述的最有效的促血管生成基因，它能誘導內皮細胞的增生、發芽和管腔形成[10]。VEGFA在小鼠中的獨特表達模式和途徑表明了其在血管發生中的重要作用，它影響重要的血管生成過程，包括傷口愈合、排卵、血壓維持、月經和妊娠[11]。本研究結果表明，在小鼠眼中VEGFB偶爾與VEGFA有關聯，而大部分與VEGFC相關性更高。
有研究報道，VEGFB與VEGFA165的氨基酸序列的同源性為47%[12-13]。然而，在本研究中，這兩種基因之間的同源性似乎并不高，因為在與他們分別相關的50個基因中只有1個VEGFB的基因表達與VEGFA基因有較強的正相關性，而其余的基因與VEGFA可能有著不同的功能和機制。有研究表明，與VEGF家族成員的其他成員相比，VEGFB有著獨特的功能和機制，其在正常條件下沒有明顯的活性[14]。然而，VEGFB的過表達促進病理性視網膜、脈絡膜新生血管和血視網膜屏障的分解破壞，在不引起炎癥的情況下促進血管通透性增加，從而參與視網膜新生血管發生發展[15]。此外，最近有報道顯示，在激光損傷引起的脈絡膜新生血管模型和缺血誘導的視網膜新生血管模型中，視網膜下注射腺相關病毒載體（AAV）-VEGF-B167或AAV-VEGF-B186增強了視網膜和脈絡膜的新生血管形成[16]。因此，即使VEGFB在新生血管生長中作用并不是直接的，但其活性的增加在眼部新血管形成方面仍起到重要作用[15]。這提示靶向抑制VEGFB也可能對眼部新生血管性疾病具有治療意義[14]。
本研究結果顯示，VEGFC的表達模式和途徑與VEGFA的表達方式和途徑有部分弱正關聯性。早期實驗證明，VEGFC誘導選擇性淋巴管生成而不伴有血管生成；在轉基因小鼠中，病毒產生的VEGFC誘導血管發生了許多變化，并促進了裸鼠皮膚血管的滲漏[17-18]。Enholm等[19]也得到了類似的結果。
HEIMED Eye M430v2（Sep08）RMA數據集（http://gn1.genenetwork.org/webqtl/main.py）來自103個基因的小鼠的眼內表達數據，包括68個BXD RI菌株、親本株（C57BL/6J和DBA/2J）、正反交和BALB/cByJ小鼠。基因表達數據用來自美國Illumina公司生產的全基因組6代小鼠芯片生成。目前，這是眼RI菌株全基因組表達譜中最大的群體。在對小鼠眼內全基因組數據集表達水平的分析中，VEGFB 1451803探針在18.0處有較高的相對表達水平，可作為調控VEGFB表達的基因之一，但其與VEGF家族其他基因無明顯相關性。在與VEGFB高度相關的50個基因中，有1個基因的表達水平與VEGFA呈負相關，與VEGFA和VEGFB分別相關的50個基因間有著負相關性。這提示VEGFA和VEGFB可能是反向調控基因，或者通過不同的分子途徑發揮生理作用。對于VEGFC 1440739來說，與其密切相關的前50個基因部分與VEGFA的1個探針呈弱正相關。這提示VEGFC與VEGFA可能具有部分相似的分子通路，共同促進新生血管的形成，但其協同作用并不強。它們的關系也在小鼠腎（小鼠腎性平衡m430v2）全基因組表達數據（http://gn1.genenetwork.org/webqtl/main.py?FormID=sharinginfo&GN_AccessionId=239，該數據包含70株遺傳多樣性小鼠成人腎臟mRNA表達的基因表達譜，54株BXD重組自交菌株、15株自交系和1株F1雜交株D2B6F1）中被進一步證實，即VEGFC和VEGFA無相關或呈負相關[20]。
根據eQTL分析結果，VEGF基因探針中eQTL均位于不同的染色體上。這一信息表明，這些基因在VEGF家族中的表達水平的調控機制可能是不同的。據此推測，VEGFA在新生血管的形成中起主要作用，而VEGF家族的其他成員也共同參與了新生血管的形成和發展，其作用不容忽視。因此，抑制VEGFA的單一靶點類藥物可能并不能完全阻斷新生血管的產生和發展。
目前鑒定的VEGF受體（VEGFR）被命名為VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和神經纖毛蛋白（NP）-1、NP-2[21]。VEGFA與VEGFR-1、VEGFR-2、NP-1和NP-2結合；VEGFB與VEGFR-1和NP-1結合，但不與VEGFR-2或VEGFR-3結合；VEGFC與VEGFR-2和VEGFR-3結合；而PlGF與VEGFR-1、NP-1和NP-2結合。有研究表明，PlGF聯合VEGFR-1后，VEGF和VEGFR-2的結合增強[22]。這表明PlGF或可作為治療眼底新生血管性疾病的另一潛在靶點。由于VEGF和VEGFR之間結合的復雜性和相互作用，也從另一方面解釋了病理性血管生成不是單一的基因效應。
本實驗研究是基于小鼠眼VEGF基因數據而得出的結論，與其他使用動物模型的研究一樣，這些數據需要在人類試驗中加以證實，且關于VEGF家族基因的分子調控途徑差異還需進一步研究。因現有的大多數抗VEGF藥物都是人源化的，在非靈長類動物的研究中所得結果可能與人類和其他靈長類動物存在不同。
