視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是糖尿病視網膜病變、青光眼、視網膜中央動靜脈阻塞等多種缺血性視網膜疾病的重要病理生理基礎。目前關于RIRI的發病機制研究主要有氧化應激、細胞凋亡、細胞壞死性凋亡、血管損傷、炎癥反應等幾種學說。針對上述RIRI發病機制，國內外學者研究提出很多治療RIRI的方法，包括抗自由基損傷、抗谷氨酸興奮性毒性、抗凋亡、抗壞死性凋亡、保護緊密連接、保護內皮細胞、抗炎癥反應等。盡管目前有很多針對RIRI的藥物研究，但對于RIRI的藥物干預時機尚不明確，確定最為有效的治療時間窗可能起到事半功倍的效果，也將對眼科相關疾病的臨床治療起到至關重要的指導作用。
引用本文： 郭苗, 顏華. 視網膜缺血再灌注損傷的發病機制與治療進展. 中華眼底病雜志, 2020, 36(6): 483-488. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20180807-00276 復制
視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是指視網膜在缺血狀態下重新恢復血液灌注后，視網膜原有功能不僅未能恢復，且結構破壞更加嚴重，甚至出現不可逆損傷[1]。RIRI是糖尿病視網膜病變（DR）、青光眼、視網膜中央動靜脈阻塞等多種缺血性視網膜疾病的重要病理生理基礎[2-3]。然而，目前臨床上對此類疾病并無有效可行的治療方法，因此研究其發病機制和治療途徑對臨床工作有重大的指導意義。目前關于RIRI的發病機制研究主要有氧化應激、細胞凋亡、細胞壞死性凋亡、血管損傷、炎癥反應等幾種學說。針對不同發病機制，RIRI的治療研究也取得了極大的進展。現針對RIRI損傷機制與治療進展作一綜述。
1 損傷機制
1.1 氧化應激學說
1.1.1 自由基損傷
自由基作為一種極其活潑的氧化劑，其本身及其誘發的一系列鏈式反應可以對細胞和視網膜組織造成嚴重損害。因此，減少氧自由基產生和抑制氧化應激反應是治療RIRI的一個重要途徑。
RIRI氧化應激反應中，核因子（NF）-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子2相關因子2（Nrf2）信號通路起主要作用。NF-κB是一個氧化還原敏感的轉錄因子，在RIRI后被激活，調節多種氧化應激調節因子和炎癥介質基因[4-7]。在RIRI模型中，NF-κB激活，線粒體電子傳遞鏈解偶聯，吞噬細胞氧化酶（PHOX）和NO合酶（NOS）被激活，產生大量ROS和活性氮，對細胞結構，包括脂質、膜、蛋白、DNA等造成極大的損傷。NF-κB和這些氧化酶的激活主要發生在激活的原住細胞內，如星形膠質細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、浸潤細胞、中性粒細胞，尤其是星形膠質細胞[4-5, 8]。另外，NF-κB失活，可以顯著降低促炎基因TNF-α、趨化因子CCL2、趨化因子CXCL10、細胞間黏附分子（ICAM）1及血管細胞黏附分子的表達，從而減輕RIRI中視網膜損傷[5-6]。這表明NF-κB可以通過其促炎作用在RIRI中發揮作用。MAPK信號通路，包括細胞外信號調節激酶（ERK）1/2、Jun氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK，在ROS引起的損傷中起重要作用[7, 9]。藏紅花酸（Crocetin）具有清除自由基的作用，可以抑制p38和JNK激活，從而降低RIRI中神經節細胞層（GCL）和內核層（INL）細胞丟失[7]。這說明p38和JNK是依賴ROS激活的。Nrf2是一個主要的抗氧化應激調節因子，可以上調抗氧化應激基因，調節多種抗氧化酶的表達，減少超氧化物形成，在RIRI中能減少RGC丟失，增加RGC存活能力，保護視網膜血管變性，從而保護視網膜[10-12]。
1.1.2 谷氨酸興奮性毒性
谷氨酸興奮性毒性誘導的氧化應激在缺血性視網膜疾病引起的mtDNA損傷中起很重要的作用。Tfam是一個核DNA表達的線粒體DNA結合蛋白，在線粒體基因表達和mtDNA維護上起很重要的作用，從而影響氧化磷酸化（OXPHOS）介導的三磷酸腺苷合成。因此，Tfam/OXPHOS復合體水平可以反映線粒體受損傷的程度[13]。另外有研究表明，RIRI中，內層視網膜血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1-R）表達增加可激活PHOX，從而誘導ROS過量產生；ROS引起谷氨酸和天冬氨酸的大量分泌，過量谷氨酸刺激N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）激活，引起多余Ca2+通過NMDA控制的通道內流引起視網膜損傷[14-15]。
1.2 細胞凋亡學說
凋亡是細胞的程序性死亡。多項研究表明，RIRI后凋亡細胞顯著增加[16-17]。目前有關RIRI的研究中，主要有3種細胞凋亡信號途徑。（1）死亡受體介導的胞外凋亡信號通路。一項動物實驗結果表明，發生缺血再灌注后的視網膜死亡受體TNF-α水平增加，凋亡蛋白Bax上調，抗凋亡蛋白Bcl-2下調，進而引起視網膜細胞凋亡增加[18]。（2）線粒體介導的胞內凋亡信號途徑。在RIRI后，線粒體介導的胞內凋亡信號被啟動，細胞色素C從線粒體中釋放出來，視網膜中凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3上調，引起RGC凋亡和視網膜各層變薄[19]。此外，磷酸肌醇3激酶/絲氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路在胞內凋亡途徑中起重要作用。在發生RIRI后，視網膜磷酸化Akt水平顯著降低，引起Bax上調，抗Bcl-2下調，導致RGC凋亡增加[20-23]。（3）內質網應激介導的凋亡途徑。內質網應激引起的凋亡也是視網膜細胞的一種常見凋亡途徑[24-25]。一項RIRI大鼠模型研究結果表明，RIRI加重內質網應激，引起乙酰化組蛋白H3水平降低，同源蛋白、Caspase-12等內質網應激分子上調，從而啟動視網膜細胞凋亡信號，造成GCL和INL細胞大量丟失[26]。
1.3 壞死性凋亡學說
近年來研究發現，在RIRI中存在一種不依賴于Caspase，由死亡受體信號觸發的一種新的程序性死亡形式，即壞死性凋亡[27]。這種死亡形式主要發生在GCL中。在RIRI早期，星形膠質細胞早期被激活，產生大量TNF-α；在受到TNF-α刺激以后，TNF受體1下調下游信號，形成由RIP1、RIP3、未激活的Caspas-8、相關死亡結構域蛋白及混合系列蛋白激酶樣結構域組成的壞死性凋亡小體，起始壞死性凋亡過程[28]。壞死性凋亡通過引起RGC直接丟失和間接誘導炎癥反應來損傷視網膜[29]。細胞在發生壞死性凋亡后，釋放出損傷相關分子模式，從而引發一系列炎癥反應[30-31]。壞死性凋亡的結果是增加了GCL和INL的漿膜通透性，引起細胞自噬作用，而且這些作用不依賴于Caspase[27]。
1.4 血管損傷學說
RIRI可以引起神經元變性和血視網膜屏障（BRB）破壞介導的血管通透性增加。盡管神經元變性死亡已經被廣泛研究，但是BRB破壞的分子機制研究仍然很少。目前BRB破壞機制的研究主要有以下三個方面。
1.4.1 破壞縫隙連接
縫隙連接的主要結構單元是連接蛋白（Connexin），6個Connexin單元組成連接子（connexon），或稱為半通道，連接子與相鄰細胞的類似結構相連形成交流通道。Connexin43是Connexin家族表達最廣泛的一種亞型，它在視網膜內皮細胞、星形膠質細胞、Müller細胞中表達[32-34]。在與相鄰細胞對接之前，Connexin43半通道處于一種低開放狀態，因為開放的通道會形成一個大的、非特異性的膜孔。然而在損傷或疾病狀態下，Connexin43上調，半通道開放，會引起膠質細胞激活、血管完整性破壞、BRB受損、水腫等繼發性損傷，從而導致神經元死亡[33]。
有研究表明，在RIRI后發生顯著的血管滲漏；Connexin43免疫活性在內皮細胞、星形膠質細胞、Müller細胞中顯著升高，星形膠質細胞激活，RGC丟失[32-33]。體外實驗中Connexin43半通道開放直接介導缺氧引起的內皮細胞死亡[33]。這表明RGC丟失可能與Connexin43上調引起的半通道開放、血管滲漏、炎癥反應有關[32-33]。而使用Connexin43 模擬肽阻斷Connexin43引起的血管滲漏可以促進RGC存活，進一步表明縫隙連接破壞是RIRI的一個重要的病理生理過程[32]。
1.4.2 破壞緊密連接
BRB由內BRB（IBRB）和外BRB（OBRB）組成。IBRB由血管內皮細胞復雜緊密連接組成，OBRB由RPE細胞組成。BRB對于維持視網膜正常結構和功能發揮顯著作用。而IBRB較OBRB對RIRI更為敏感[35-36]。VEGF是介導緊密連接改變進而損害BRB的關鍵因子。在RIRI后，發生VEGF介導的VEGF受體（VEGFR）-2磷酸化，引起緊密連接蛋白（ZO）-1、ZO-2和閉合蛋白（Occludin）水平下降，破壞了內皮細胞間的緊密連接和IBRB，進而引起血管通透性增加、血管滲漏，造成視網膜損傷[35-39]。
1.4.3 損傷血管內皮細胞
一項動物實驗研究表明，在RIRI后，視網膜血管內皮細胞變性，周細胞丟失，但血管基膜無明顯變化，很多血管呈現無灌注的狀態；這些變化最終造成IBRB破壞，視網膜神經細胞損傷[40]。另一項研究表明，在缺血再灌注14 d后，RIRI組小鼠較空白對照組視網膜中的脫細胞毛細血管數目顯著增加[41]。脫細胞毛細血管即僅剩基膜的血管套，是發生RIRI后血管內皮細胞和周細胞大量死亡形成的。這項研究證實在RIRI后，血管內皮細胞會發生顯著損傷。同樣，Liu等[42-43]發現，在RIRI后，視網膜脫細胞毛細血管數目顯著增加，并且伴有視網膜厚度變薄、GCL層細胞丟失等。以上這些研究均表明視網膜血管內皮細胞損傷在RIRI的病理生理過程中扮演十分重要的角色。
1.5 炎癥反應學說
在缺血再灌注早期，缺血局部產生大量趨化因子，激活白細胞進入缺血組織或黏附于內皮細胞。白細胞激活的同時，可以釋放IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α、CCL2、ICAM、環氧合酶2（Cox-2）等大量的細胞因子，進一步加劇微循環中白細胞聚集和白細胞與內皮細胞的黏附，堵塞毛細血管血流，形成無復流現象，從而破壞BRB，引起血管滲漏，造成缺血區視網膜GCL及INL層細胞大量死亡。另外，研究表明，NF-κB水平在缺血再灌注視網膜小膠質細胞內及核蛋白提取物中顯著增高，進而誘導炎癥基因的表達，加劇缺血局部炎癥反應[44-45]。此外，大量浸潤的白細胞還可以釋放ROS，加重缺血視網膜損傷。
2 治療進展
目前針對上述RIRI發病機制，國內外學者研究提出很多治療RIRI的方法，包括抗自由基損傷、抗谷氨酸興奮性毒性、抗凋亡、抗壞死性凋亡、保護緊密連接、保護內皮細胞、抗炎癥反應等。
2.1 抗自由基損傷
目前的抗自由基損傷藥物主要通過抑制NF-κB、MAPK激活，上調Nrf2水平來對抗RIRI中的氧化應激作用。藏紅花酸、奧曲肽通過抑制NF-κB激活，來抑制RIRI引起的氧化應激，從而達到保護視網膜損傷的作用[7, 46]。在一個RIRI模型中，匹格列酮通過抑制NF-κB信號通路，抑制Toll樣受體4/NOD樣受體家族含吡啶結構域蛋白3炎癥小體、膠質細胞激活，減少細胞凋亡，促進RGC存活[47-48]。氨基葡萄糖、殼寡糖（COS）可以下調RIRI引起的MAPK信號通路的激活，發揮抵抗氧化應激損傷的作用；也可以通過抑制NF-κB激活和上調NF-κB的抑制蛋白來抑制炎癥反應，如下調ICAM1、TNF-α、IL-1β來發揮抗炎作用，從而保護RGC存活[6, 45, 49]。合成三萜類2-氰基-3,12-二唑烷-1,9-二亞乙基三胺-28-咪唑安定是Nrf2激動劑，可以作為RIRI抗氧化應激的治療方法[10]。此外，兩項研究表明，Nrf2是調節Ⅰ型血紅素氧合酶（HO-1）表達的轉錄因子之一，從西蘭花等十字花科蔬菜中提取的蘿卜硫素和從枸杞中提取的枸杞多糖（LBP）可以通過Nrf2/HO-1抗氧化通路降低ROS產生，從而降低RGC凋亡[1, 50]。甲烷顯著降低8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OHdG）、丙二醛（MDA）水平，提高抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平，通過發揮抗氧化應激作用在RIRI中起視網膜保護作用[51]。玻璃體內注射含有SOD2基因的重組腺相關病毒可以顯著降低超氧化物陰離子、MDA、8-OHdG和硝基酪氨酸，通過其抗氧化應激、抗硝化應激作用來避免RGC和內叢狀層損傷[52]。
2.2 抗谷氨酸興奮性毒性
溴莫尼定是一種α2受體激動劑，阻斷了谷氨酸誘導的氧化應激，避免了Tfam/OXPHOS復合體降低，從而保護RGC存活[13]。輔酶Q10是呼吸鏈組成成分之一，在線粒體氧化磷酸化過程中發揮重要作用。它也是一種脂溶性的抗氧化劑，保護氧化應激造成的脂質、蛋白質、核酸損傷[53]。在RIRI和青光眼鼠模型的飲食中添加輔酶Q10后發現，輔酶Q10通過降低Bax/Bcl-2/Bcl-XL相關死亡啟動子介導的線粒體凋亡途徑和保存Tfam蛋白，避免了谷氨酸興奮性毒性誘導的氧化應激對線粒體損傷，從而保護RIRI中RGC死亡[54-55]。血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物卡托普利和血管緊張素受體阻滯劑類藥物坎地沙坦均可以阻斷AT1-R信號通路，抑制ROS產生，降低胞外谷氨酸含量，減輕氧化應激從而減輕視網膜損傷[14-15]。
2.3 抗凋亡
丙戊酸（VPA），分子式C8H16O2，常被制成丙戊酸鹽，用于對抗多種類型的驚厥，是一種廣譜抗癲癇藥。其主要作用機制是抑制組蛋白去乙酰化酶活性。VPA可以上調熱休克蛋白70（HSP70），使組蛋白H3、HSP70啟動子高度乙酰化，增加了HSP70和Apaf-1的結合，從而阻斷RIRI中凋亡小體形成，降低細胞色素C形成和Caspase-3激活，抑制線粒體介導的凋亡途徑[19]。另一項研究表明VPA通過抑制組蛋白脫乙酰化，上調葡萄糖調節蛋白78表達，使組蛋白H3乙酰化，降低CHOP上調和Caspase-12激活，從而保護內質網應激誘導的凋亡[26]。此外，VPA也可以通過升高HSP70、Bcl-2，降低Bax來發揮抗凋亡作用[34]。神經生長因子、粒細胞集落刺激因子、藏花素、H2吸入后處理通過PI3K/Akt信號通路，上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2/Bax比率來降低RIRI引起的RGC凋亡[20-23]。槲皮素、右旋美托咪啶在RIRI中發揮抗凋亡作用，減輕RIRI造成的視網膜變薄[16-17]。
有研究發現，辛伐他汀可以降低RIRI引起的TNF-α和NF-κB表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax表達，從而顯著降低RIRI中RGC和INL細胞凋亡，進而保護RIRI引起的視網膜損傷[18, 56]。這表明在RIRI中，辛伐他汀可能是通過抑制TNF-α/NF-κB信號通路來影響凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達，進而降低視網膜細胞凋亡。
2.4 抗壞死性凋亡
TNF-α抑制劑（Nec-1）是一個RIP1特異性抑制劑，分子式C13H13N3OS，它通過阻斷RIP1的功能來阻斷壞死性凋亡[27-29]。Nec-1能減輕RIRI中TNF-α誘導的壞死性凋亡，且能降低RIRI引起的RGC死亡和視網膜功能改變[28-29, 57]。
2.5 保護緊密連接
紫花前胡素、內皮抑素、地奧司明貝伐單抗等通過抑制VEGF介導的VEGFR-2 磷酸化，避免了內皮細胞中ZO-1、ZO-2和Occludin丟失，進而抑制血管滲漏和BRB破壞[35, 38-39, 58]。米諾環素避免了RIRI后ZO-1移位，顯著降低了緊密連接破壞和血管通透性，抑制炎癥基因表達、白細胞黏附，然而對神經細胞并沒有明顯的保護作用[59]。一項動物實驗表明，LBP可以減輕RIRI引起的Occludin低表達、血管滲漏和血管密度降低，從而減少RGC丟失[60]。
2.6 保護內皮細胞
內皮祖細胞（EPCs）是一種成年個體骨髓中的血管內皮前體細胞，它能遷移至外周血并分化為成熟血管內皮細胞，具有良好的增生潛能。張惟等[61]發現，EPCs與DR大鼠視網膜血管內皮修復和新生血管形成的關系很密切；DR進程中EPCs數量變化及增生、遷移、黏附、貼壁等功能受損，可能引起DR大鼠視網膜血管修復障礙及病理性新生血管形成。該研究結果提示可以通過補充足量且功能正常的EPCs來促進視網膜損傷血管的修復，進而促進血管內皮功能恢復，為治療RIRI提供了新的思路。
2.7 抗炎癥反應
葉黃素別名類胡蘿卜素，分子式C40H56O2，廣泛存在于綠葉蔬菜中，是一種優良的抗氧化劑。在RIRI模型中，葉黃素可以降低Müller細胞促炎因子IL-1β、Cox-2的表達，抑制膠質細胞活性和NF-κB激活，從而保護RIRI[62]。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物Ex-4是一種強效GLP-1受體激動劑，能模擬GLP-1這種內源性多肽的糖調控作用，降低空腹和餐后血糖，是一種新型降糖藥。Ex-4可以抑制RIRI引起的炎癥因子IL-1b、IL-6、TNF-α、CCL2產生和NF-κB激活以及BRB破壞，從而減輕視網膜結構破壞[44]。這些研究結果表明，葉黃素和Ex-4均可以顯著抑制NF-κB激活，并且NF-κB是一個在炎癥反應中發揮重要作用的轉錄因子。據此我們推測，葉黃素和Ex-4可能是通過抑制NF-κB激活，繼而下調炎癥因子表達來發揮其抗炎作用。
姜黃素是一種從草本植物姜黃、郁金等根莖中提取的多酚類物質。最近有研究發現，姜黃素可以呈劑量依賴地降低RIRI大鼠視網膜中IL-23、IL-17的表達，抑制炎癥反應，保護視網膜結構[63]。
COS又稱為殼聚寡糖，是由殼聚糖降解得到的一種寡糖產品。有研究表明，COS通過阻斷NF-κB、JNK、ERK激活，促進p38激活，顯著降低了炎癥介質TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化蛋白1、誘導型NOS、ICAM1表達和氧化應激，從而促進RGC存活[45]。
3 存在問題及展望
RIRI是多種機制共同作用的結果。針對不同的損傷機制，也有很多藥物被提出和證實能夠減輕RIRI。多項研究證明，枸杞提取物LBP可以通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路、抑制氧化應激、減少炎癥反應、抑制膠質細胞激活、減少GCL和INL細胞凋亡、保護BRB等多種作用機制保護RIRI引起的損傷。因此LBP可能成為一種預防和治療RIRI相關眼科疾病十分有前景的藥物。匹格列酮屬胰島素增敏劑，目前臨床上主要用于治療2型糖尿病。然而在RIRI模型研究中發現，它也可以通過抑制NF-κB信號通路來減少氧化應激、抑制炎癥反應、抑制膠質細胞激活，減少細胞凋亡，促進RGC存活。這提示匹格列酮對于同時患有糖尿病和RIRI相關疾病的患者來說將是一種一舉兩得的藥物。除此之外，EPCs在RIRI相關性眼病中具有良好的應用前景，但是EPCs廣泛應用于臨床還需要克服很多問題。如，EPCs表面標記尚不清楚，無法準確分離擴增；EPCs動員、分化和定向遷移的相關基因調控尚未明確等，因此還需要進一步深入研究。盡管目前有很多針對RIRI的藥物研究，然而對于RIRI的藥物干預時機尚不明確，確定最為有效的治療時間窗可能起到事半功倍的效果，也將對眼科相關疾病的臨床治療起到至關重要的指導作用。
視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是指視網膜在缺血狀態下重新恢復血液灌注后，視網膜原有功能不僅未能恢復，且結構破壞更加嚴重，甚至出現不可逆損傷[1]。RIRI是糖尿病視網膜病變（DR）、青光眼、視網膜中央動靜脈阻塞等多種缺血性視網膜疾病的重要病理生理基礎[2-3]。然而，目前臨床上對此類疾病并無有效可行的治療方法，因此研究其發病機制和治療途徑對臨床工作有重大的指導意義。目前關于RIRI的發病機制研究主要有氧化應激、細胞凋亡、細胞壞死性凋亡、血管損傷、炎癥反應等幾種學說。針對不同發病機制，RIRI的治療研究也取得了極大的進展。現針對RIRI損傷機制與治療進展作一綜述。
1 損傷機制
1.1 氧化應激學說
1.1.1 自由基損傷
自由基作為一種極其活潑的氧化劑，其本身及其誘發的一系列鏈式反應可以對細胞和視網膜組織造成嚴重損害。因此，減少氧自由基產生和抑制氧化應激反應是治療RIRI的一個重要途徑。
RIRI氧化應激反應中，核因子（NF）-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子2相關因子2（Nrf2）信號通路起主要作用。NF-κB是一個氧化還原敏感的轉錄因子，在RIRI后被激活，調節多種氧化應激調節因子和炎癥介質基因[4-7]。在RIRI模型中，NF-κB激活，線粒體電子傳遞鏈解偶聯，吞噬細胞氧化酶（PHOX）和NO合酶（NOS）被激活，產生大量ROS和活性氮，對細胞結構，包括脂質、膜、蛋白、DNA等造成極大的損傷。NF-κB和這些氧化酶的激活主要發生在激活的原住細胞內，如星形膠質細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、浸潤細胞、中性粒細胞，尤其是星形膠質細胞[4-5, 8]。另外，NF-κB失活，可以顯著降低促炎基因TNF-α、趨化因子CCL2、趨化因子CXCL10、細胞間黏附分子（ICAM）1及血管細胞黏附分子的表達，從而減輕RIRI中視網膜損傷[5-6]。這表明NF-κB可以通過其促炎作用在RIRI中發揮作用。MAPK信號通路，包括細胞外信號調節激酶（ERK）1/2、Jun氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK，在ROS引起的損傷中起重要作用[7, 9]。藏紅花酸（Crocetin）具有清除自由基的作用，可以抑制p38和JNK激活，從而降低RIRI中神經節細胞層（GCL）和內核層（INL）細胞丟失[7]。這說明p38和JNK是依賴ROS激活的。Nrf2是一個主要的抗氧化應激調節因子，可以上調抗氧化應激基因，調節多種抗氧化酶的表達，減少超氧化物形成，在RIRI中能減少RGC丟失，增加RGC存活能力，保護視網膜血管變性，從而保護視網膜[10-12]。
1.1.2 谷氨酸興奮性毒性
谷氨酸興奮性毒性誘導的氧化應激在缺血性視網膜疾病引起的mtDNA損傷中起很重要的作用。Tfam是一個核DNA表達的線粒體DNA結合蛋白，在線粒體基因表達和mtDNA維護上起很重要的作用，從而影響氧化磷酸化（OXPHOS）介導的三磷酸腺苷合成。因此，Tfam/OXPHOS復合體水平可以反映線粒體受損傷的程度[13]。另外有研究表明，RIRI中，內層視網膜血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1-R）表達增加可激活PHOX，從而誘導ROS過量產生；ROS引起谷氨酸和天冬氨酸的大量分泌，過量谷氨酸刺激N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）激活，引起多余Ca2+通過NMDA控制的通道內流引起視網膜損傷[14-15]。
1.2 細胞凋亡學說
凋亡是細胞的程序性死亡。多項研究表明，RIRI后凋亡細胞顯著增加[16-17]。目前有關RIRI的研究中，主要有3種細胞凋亡信號途徑。（1）死亡受體介導的胞外凋亡信號通路。一項動物實驗結果表明，發生缺血再灌注后的視網膜死亡受體TNF-α水平增加，凋亡蛋白Bax上調，抗凋亡蛋白Bcl-2下調，進而引起視網膜細胞凋亡增加[18]。（2）線粒體介導的胞內凋亡信號途徑。在RIRI后，線粒體介導的胞內凋亡信號被啟動，細胞色素C從線粒體中釋放出來，視網膜中凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3上調，引起RGC凋亡和視網膜各層變薄[19]。此外，磷酸肌醇3激酶/絲氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路在胞內凋亡途徑中起重要作用。在發生RIRI后，視網膜磷酸化Akt水平顯著降低，引起Bax上調，抗Bcl-2下調，導致RGC凋亡增加[20-23]。（3）內質網應激介導的凋亡途徑。內質網應激引起的凋亡也是視網膜細胞的一種常見凋亡途徑[24-25]。一項RIRI大鼠模型研究結果表明，RIRI加重內質網應激，引起乙酰化組蛋白H3水平降低，同源蛋白、Caspase-12等內質網應激分子上調，從而啟動視網膜細胞凋亡信號，造成GCL和INL細胞大量丟失[26]。
1.3 壞死性凋亡學說
近年來研究發現，在RIRI中存在一種不依賴于Caspase，由死亡受體信號觸發的一種新的程序性死亡形式，即壞死性凋亡[27]。這種死亡形式主要發生在GCL中。在RIRI早期，星形膠質細胞早期被激活，產生大量TNF-α；在受到TNF-α刺激以后，TNF受體1下調下游信號，形成由RIP1、RIP3、未激活的Caspas-8、相關死亡結構域蛋白及混合系列蛋白激酶樣結構域組成的壞死性凋亡小體，起始壞死性凋亡過程[28]。壞死性凋亡通過引起RGC直接丟失和間接誘導炎癥反應來損傷視網膜[29]。細胞在發生壞死性凋亡后，釋放出損傷相關分子模式，從而引發一系列炎癥反應[30-31]。壞死性凋亡的結果是增加了GCL和INL的漿膜通透性，引起細胞自噬作用，而且這些作用不依賴于Caspase[27]。
1.4 血管損傷學說
RIRI可以引起神經元變性和血視網膜屏障（BRB）破壞介導的血管通透性增加。盡管神經元變性死亡已經被廣泛研究，但是BRB破壞的分子機制研究仍然很少。目前BRB破壞機制的研究主要有以下三個方面。
1.4.1 破壞縫隙連接
縫隙連接的主要結構單元是連接蛋白（Connexin），6個Connexin單元組成連接子（connexon），或稱為半通道，連接子與相鄰細胞的類似結構相連形成交流通道。Connexin43是Connexin家族表達最廣泛的一種亞型，它在視網膜內皮細胞、星形膠質細胞、Müller細胞中表達[32-34]。在與相鄰細胞對接之前，Connexin43半通道處于一種低開放狀態，因為開放的通道會形成一個大的、非特異性的膜孔。然而在損傷或疾病狀態下，Connexin43上調，半通道開放，會引起膠質細胞激活、血管完整性破壞、BRB受損、水腫等繼發性損傷，從而導致神經元死亡[33]。
有研究表明，在RIRI后發生顯著的血管滲漏；Connexin43免疫活性在內皮細胞、星形膠質細胞、Müller細胞中顯著升高，星形膠質細胞激活，RGC丟失[32-33]。體外實驗中Connexin43半通道開放直接介導缺氧引起的內皮細胞死亡[33]。這表明RGC丟失可能與Connexin43上調引起的半通道開放、血管滲漏、炎癥反應有關[32-33]。而使用Connexin43 模擬肽阻斷Connexin43引起的血管滲漏可以促進RGC存活，進一步表明縫隙連接破壞是RIRI的一個重要的病理生理過程[32]。
1.4.2 破壞緊密連接
BRB由內BRB（IBRB）和外BRB（OBRB）組成。IBRB由血管內皮細胞復雜緊密連接組成，OBRB由RPE細胞組成。BRB對于維持視網膜正常結構和功能發揮顯著作用。而IBRB較OBRB對RIRI更為敏感[35-36]。VEGF是介導緊密連接改變進而損害BRB的關鍵因子。在RIRI后，發生VEGF介導的VEGF受體（VEGFR）-2磷酸化，引起緊密連接蛋白（ZO）-1、ZO-2和閉合蛋白（Occludin）水平下降，破壞了內皮細胞間的緊密連接和IBRB，進而引起血管通透性增加、血管滲漏，造成視網膜損傷[35-39]。
1.4.3 損傷血管內皮細胞
一項動物實驗研究表明，在RIRI后，視網膜血管內皮細胞變性，周細胞丟失，但血管基膜無明顯變化，很多血管呈現無灌注的狀態；這些變化最終造成IBRB破壞，視網膜神經細胞損傷[40]。另一項研究表明，在缺血再灌注14 d后，RIRI組小鼠較空白對照組視網膜中的脫細胞毛細血管數目顯著增加[41]。脫細胞毛細血管即僅剩基膜的血管套，是發生RIRI后血管內皮細胞和周細胞大量死亡形成的。這項研究證實在RIRI后，血管內皮細胞會發生顯著損傷。同樣，Liu等[42-43]發現，在RIRI后，視網膜脫細胞毛細血管數目顯著增加，并且伴有視網膜厚度變薄、GCL層細胞丟失等。以上這些研究均表明視網膜血管內皮細胞損傷在RIRI的病理生理過程中扮演十分重要的角色。
1.5 炎癥反應學說
在缺血再灌注早期，缺血局部產生大量趨化因子，激活白細胞進入缺血組織或黏附于內皮細胞。白細胞激活的同時，可以釋放IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α、CCL2、ICAM、環氧合酶2（Cox-2）等大量的細胞因子，進一步加劇微循環中白細胞聚集和白細胞與內皮細胞的黏附，堵塞毛細血管血流，形成無復流現象，從而破壞BRB，引起血管滲漏，造成缺血區視網膜GCL及INL層細胞大量死亡。另外，研究表明，NF-κB水平在缺血再灌注視網膜小膠質細胞內及核蛋白提取物中顯著增高，進而誘導炎癥基因的表達，加劇缺血局部炎癥反應[44-45]。此外，大量浸潤的白細胞還可以釋放ROS，加重缺血視網膜損傷。
2 治療進展
目前針對上述RIRI發病機制，國內外學者研究提出很多治療RIRI的方法，包括抗自由基損傷、抗谷氨酸興奮性毒性、抗凋亡、抗壞死性凋亡、保護緊密連接、保護內皮細胞、抗炎癥反應等。
2.1 抗自由基損傷
目前的抗自由基損傷藥物主要通過抑制NF-κB、MAPK激活，上調Nrf2水平來對抗RIRI中的氧化應激作用。藏紅花酸、奧曲肽通過抑制NF-κB激活，來抑制RIRI引起的氧化應激，從而達到保護視網膜損傷的作用[7, 46]。在一個RIRI模型中，匹格列酮通過抑制NF-κB信號通路，抑制Toll樣受體4/NOD樣受體家族含吡啶結構域蛋白3炎癥小體、膠質細胞激活，減少細胞凋亡，促進RGC存活[47-48]。氨基葡萄糖、殼寡糖（COS）可以下調RIRI引起的MAPK信號通路的激活，發揮抵抗氧化應激損傷的作用；也可以通過抑制NF-κB激活和上調NF-κB的抑制蛋白來抑制炎癥反應，如下調ICAM1、TNF-α、IL-1β來發揮抗炎作用，從而保護RGC存活[6, 45, 49]。合成三萜類2-氰基-3,12-二唑烷-1,9-二亞乙基三胺-28-咪唑安定是Nrf2激動劑，可以作為RIRI抗氧化應激的治療方法[10]。此外，兩項研究表明，Nrf2是調節Ⅰ型血紅素氧合酶（HO-1）表達的轉錄因子之一，從西蘭花等十字花科蔬菜中提取的蘿卜硫素和從枸杞中提取的枸杞多糖（LBP）可以通過Nrf2/HO-1抗氧化通路降低ROS產生，從而降低RGC凋亡[1, 50]。甲烷顯著降低8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OHdG）、丙二醛（MDA）水平，提高抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平，通過發揮抗氧化應激作用在RIRI中起視網膜保護作用[51]。玻璃體內注射含有SOD2基因的重組腺相關病毒可以顯著降低超氧化物陰離子、MDA、8-OHdG和硝基酪氨酸，通過其抗氧化應激、抗硝化應激作用來避免RGC和內叢狀層損傷[52]。
2.2 抗谷氨酸興奮性毒性
溴莫尼定是一種α2受體激動劑，阻斷了谷氨酸誘導的氧化應激，避免了Tfam/OXPHOS復合體降低，從而保護RGC存活[13]。輔酶Q10是呼吸鏈組成成分之一，在線粒體氧化磷酸化過程中發揮重要作用。它也是一種脂溶性的抗氧化劑，保護氧化應激造成的脂質、蛋白質、核酸損傷[53]。在RIRI和青光眼鼠模型的飲食中添加輔酶Q10后發現，輔酶Q10通過降低Bax/Bcl-2/Bcl-XL相關死亡啟動子介導的線粒體凋亡途徑和保存Tfam蛋白，避免了谷氨酸興奮性毒性誘導的氧化應激對線粒體損傷，從而保護RIRI中RGC死亡[54-55]。血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物卡托普利和血管緊張素受體阻滯劑類藥物坎地沙坦均可以阻斷AT1-R信號通路，抑制ROS產生，降低胞外谷氨酸含量，減輕氧化應激從而減輕視網膜損傷[14-15]。
2.3 抗凋亡
丙戊酸（VPA），分子式C8H16O2，常被制成丙戊酸鹽，用于對抗多種類型的驚厥，是一種廣譜抗癲癇藥。其主要作用機制是抑制組蛋白去乙酰化酶活性。VPA可以上調熱休克蛋白70（HSP70），使組蛋白H3、HSP70啟動子高度乙酰化，增加了HSP70和Apaf-1的結合，從而阻斷RIRI中凋亡小體形成，降低細胞色素C形成和Caspase-3激活，抑制線粒體介導的凋亡途徑[19]。另一項研究表明VPA通過抑制組蛋白脫乙酰化，上調葡萄糖調節蛋白78表達，使組蛋白H3乙酰化，降低CHOP上調和Caspase-12激活，從而保護內質網應激誘導的凋亡[26]。此外，VPA也可以通過升高HSP70、Bcl-2，降低Bax來發揮抗凋亡作用[34]。神經生長因子、粒細胞集落刺激因子、藏花素、H2吸入后處理通過PI3K/Akt信號通路，上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2/Bax比率來降低RIRI引起的RGC凋亡[20-23]。槲皮素、右旋美托咪啶在RIRI中發揮抗凋亡作用，減輕RIRI造成的視網膜變薄[16-17]。
有研究發現，辛伐他汀可以降低RIRI引起的TNF-α和NF-κB表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，下調促凋亡蛋白Bax表達，從而顯著降低RIRI中RGC和INL細胞凋亡，進而保護RIRI引起的視網膜損傷[18, 56]。這表明在RIRI中，辛伐他汀可能是通過抑制TNF-α/NF-κB信號通路來影響凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達，進而降低視網膜細胞凋亡。
2.4 抗壞死性凋亡
TNF-α抑制劑（Nec-1）是一個RIP1特異性抑制劑，分子式C13H13N3OS，它通過阻斷RIP1的功能來阻斷壞死性凋亡[27-29]。Nec-1能減輕RIRI中TNF-α誘導的壞死性凋亡，且能降低RIRI引起的RGC死亡和視網膜功能改變[28-29, 57]。
2.5 保護緊密連接
紫花前胡素、內皮抑素、地奧司明貝伐單抗等通過抑制VEGF介導的VEGFR-2 磷酸化，避免了內皮細胞中ZO-1、ZO-2和Occludin丟失，進而抑制血管滲漏和BRB破壞[35, 38-39, 58]。米諾環素避免了RIRI后ZO-1移位，顯著降低了緊密連接破壞和血管通透性，抑制炎癥基因表達、白細胞黏附，然而對神經細胞并沒有明顯的保護作用[59]。一項動物實驗表明，LBP可以減輕RIRI引起的Occludin低表達、血管滲漏和血管密度降低，從而減少RGC丟失[60]。
2.6 保護內皮細胞
內皮祖細胞（EPCs）是一種成年個體骨髓中的血管內皮前體細胞，它能遷移至外周血并分化為成熟血管內皮細胞，具有良好的增生潛能。張惟等[61]發現，EPCs與DR大鼠視網膜血管內皮修復和新生血管形成的關系很密切；DR進程中EPCs數量變化及增生、遷移、黏附、貼壁等功能受損，可能引起DR大鼠視網膜血管修復障礙及病理性新生血管形成。該研究結果提示可以通過補充足量且功能正常的EPCs來促進視網膜損傷血管的修復，進而促進血管內皮功能恢復，為治療RIRI提供了新的思路。
2.7 抗炎癥反應
葉黃素別名類胡蘿卜素，分子式C40H56O2，廣泛存在于綠葉蔬菜中，是一種優良的抗氧化劑。在RIRI模型中，葉黃素可以降低Müller細胞促炎因子IL-1β、Cox-2的表達，抑制膠質細胞活性和NF-κB激活，從而保護RIRI[62]。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物Ex-4是一種強效GLP-1受體激動劑，能模擬GLP-1這種內源性多肽的糖調控作用，降低空腹和餐后血糖，是一種新型降糖藥。Ex-4可以抑制RIRI引起的炎癥因子IL-1b、IL-6、TNF-α、CCL2產生和NF-κB激活以及BRB破壞，從而減輕視網膜結構破壞[44]。這些研究結果表明，葉黃素和Ex-4均可以顯著抑制NF-κB激活，并且NF-κB是一個在炎癥反應中發揮重要作用的轉錄因子。據此我們推測，葉黃素和Ex-4可能是通過抑制NF-κB激活，繼而下調炎癥因子表達來發揮其抗炎作用。
姜黃素是一種從草本植物姜黃、郁金等根莖中提取的多酚類物質。最近有研究發現，姜黃素可以呈劑量依賴地降低RIRI大鼠視網膜中IL-23、IL-17的表達，抑制炎癥反應，保護視網膜結構[63]。
COS又稱為殼聚寡糖，是由殼聚糖降解得到的一種寡糖產品。有研究表明，COS通過阻斷NF-κB、JNK、ERK激活，促進p38激活，顯著降低了炎癥介質TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化蛋白1、誘導型NOS、ICAM1表達和氧化應激，從而促進RGC存活[45]。
3 存在問題及展望
RIRI是多種機制共同作用的結果。針對不同的損傷機制，也有很多藥物被提出和證實能夠減輕RIRI。多項研究證明，枸杞提取物LBP可以通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路、抑制氧化應激、減少炎癥反應、抑制膠質細胞激活、減少GCL和INL細胞凋亡、保護BRB等多種作用機制保護RIRI引起的損傷。因此LBP可能成為一種預防和治療RIRI相關眼科疾病十分有前景的藥物。匹格列酮屬胰島素增敏劑，目前臨床上主要用于治療2型糖尿病。然而在RIRI模型研究中發現，它也可以通過抑制NF-κB信號通路來減少氧化應激、抑制炎癥反應、抑制膠質細胞激活，減少細胞凋亡，促進RGC存活。這提示匹格列酮對于同時患有糖尿病和RIRI相關疾病的患者來說將是一種一舉兩得的藥物。除此之外，EPCs在RIRI相關性眼病中具有良好的應用前景，但是EPCs廣泛應用于臨床還需要克服很多問題。如，EPCs表面標記尚不清楚，無法準確分離擴增；EPCs動員、分化和定向遷移的相關基因調控尚未明確等，因此還需要進一步深入研究。盡管目前有很多針對RIRI的藥物研究，然而對于RIRI的藥物干預時機尚不明確，確定最為有效的治療時間窗可能起到事半功倍的效果，也將對眼科相關疾病的臨床治療起到至關重要的指導作用。