脈絡膜新生血管（CNV）是導致滲出型老年性黃斑變性（wAMD）患者中心視力喪失的主要原因。吸煙不僅增加wAMD患者CNV發生率，還加重wAMD患者病情，使其臨床治療效果及預后更差。尼古丁作為煙草中的重要有害物質，是一種易成癮且高毒性的生物堿。動物實驗和臨床研究均證實，尼古丁可通過煙堿型乙酰膽堿受體、骨髓原始細胞、炎癥、補體系統等介導血管生成，加重wAMD。積極探討尼古丁加重wAMD CNV形成的確切機制，有助于早期采取相應干預措施來預防或延緩其發展。
引用本文： 鞏亞軍, 賴坤貝, 金陳進. 尼古丁加重滲出型老年性黃斑變性脈絡膜新生血管形成的研究現狀. 中華眼底病雜志, 2020, 36(4): 319-322. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20180704-00226 復制
脈絡膜新生血管（CNV）是滲出型老年性黃斑變性（wAMD）的特征性病理表現，由于新生血管通透性高導致視網膜下出血和滲出物沉積使視錐細胞變性壞死從而造成90%的AMD患者永久性視力喪失[1-2]。CNV的病因及發病機制尚未完全明確。大量的流行病學調查表明，吸煙不僅加速早期AMD患者的病情進展，而且使晚期AMD患者CNV發生率明顯增加[3]。煙草燃燒所產生的煙霧中含有7000余種化合物，大部分對人體有害[4]。尼古丁作為煙草中的重要有害物質，是一種易成癮且高毒性的生物堿（占煙草全部生物堿的95%以上）[5]。動物實驗和臨床研究均證實煙草中的尼古丁可加重CNV病情，而且吸煙對wAMD患者病情的有害作用即使在戒煙后仍可持續將近20年[6-9]。同時尼古丁可以阻斷抗VEGF藥物抑制CNV的效應，使wAMD吸煙患者抗VEGF藥物治療的療效明顯降低[10-11]。這或許從一定程度上解釋了為何臨床中部分患者對抗VEGF藥物不敏感的原因。但關于尼古丁加重wAMD患者病情的機制迄今不明，目前臨床上也無任何手段能有效阻止吸煙患者的CNV病情的惡化。因此，積極探討尼古丁加重wAMD的確切發病機制，有助于早期采取相應干預措施來預防或延緩其發展。現就尼古丁加重wAMD CNV形成的研究現狀作一綜述。
1 煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的結構
尼古丁是通過結合到相應細胞表面的nAChR上來發揮生物學效應，其促進新生血管的作用大部分也是通過nAChR介導的[12-14]。nAChR屬于膽堿能受體系統，是一種配體門控型離子通道蛋白，由5個亞基以不同的組合形式構成的同聚體或異聚體[15]。起初發現是在可興奮細胞內，但后來在內皮細胞、血管平滑肌細胞、角質細胞、免疫細胞和RPE細胞等許多類型的細胞上也發現了該受體[16-20]。nAChR在中樞和外周神經系統、肌肉間介導神經遞質的轉換以及非神經組織中發揮著重要的生理作用。內源性的乙酰膽堿或外源性的尼古丁能與nAChR相結合，使受體活化，通過亞基結構的改變使離子通道開放，而該通道對鈣離子具有高選擇通透性，這種短暫鈣離子的內流可能繼發性地引起其他鈣離子通道開放或胞內儲存鈣離子的釋放，維持胞內大約60 s的高鈣離子狀態，這種高鈣狀態參與一系列血管活動的調節[14, 21-24]。
2 內皮nAChR介導的尼古丁血管生成作用
尼古丁促進新生血管的作用主要是通過細胞表面的膽堿能受體介導的，其中內皮nAChR是重要的一類，而其中起決定性作用的是α7亞型。α7亞型是nAChR的一個同聚體，是內皮細胞上nAChR的優勢亞型[25]。研究表明，尼古丁能通過α7-nAChR促進VEGF、血小板源性生長因子、成纖維生長因子（FGF）2、早期生長反應基因1、金屬蛋白酶等的活化或釋放，從而促進內皮細胞的增生、移行、成管，并且該作用能被α7-nAChR的拮抗劑α-銀環蛇神經毒素、六烴季胺、美加明、MG624或該受體缺乏的小鼠所抑制[26-27]。VEGF是最重要的促血管生長因子，在CNV的發展中起著關鍵作用[28]。而人體中還存在著色素上皮衍生因子（PEDF）等抑制血管生長的因子，正常情況下這兩類因子保持平衡；但在病理狀態下，這種平衡被打破，使VEGF/PEDF比值升高，促進病理性血管的形成[20, 29]。經siRNA干擾其他亞型的表達后發現沒有作用亦或甚至加強了基礎及尼古丁誘導的新生血管；值得注意的是，干擾α9亞型后，內皮細胞的增生增強，這表明其他的亞型似乎并沒有參與尼古丁血管生成作用，這可能與他們亞基的聚合有關[21]。此外研究表明，M型膽堿能受體也可通過釋放血管生成因子、NO等促進皮膚血管生成，但缺乏對視網膜及脈絡膜內皮細胞的研究[30]。Pons和Marincastano[20]認為，尼古丁可以調節細胞外蛋白激酶1/2信號通路，從而促進血管生成。尼古丁結合nAChR后，除了能直接通過信號通路促進生長因子的表達、活化外，還能與VEGF、FGF等血管生成因子相互作用促進血管生成因子基因轉錄，并且可以增強VEGF受體的活性；此外，還可以促進內皮素、前列環素、NO的分泌，研究表明這三者也可以促進血管生成[31]。
3 骨髓原始細胞在尼古丁血管生成中的作用
既往研究認為，血管生成（angiogenesis）與血管發生（vasculogenesis）的機制是不同的，血管生成只是原有血管（主要指毛細血管和毛細血管后靜脈）以芽生的方式長出新的血管[32]。CNV的病理機制是血管生成，但現在這個觀念發生了改變。實驗表明，骨髓來源細胞（BMCs）參與生理性和病理性的血管生成[33-34]。Sheridan等[35]證明，BMCs在CNV的發展中起著重要的作用。盡管目前并不清楚前體細胞上是否有nAChR的表達，但實驗表明尼古丁可以劑量依賴性地增強BMCs增生、遷移、黏附和成管作用，增多小鼠骨髓和脾臟中BMCs數量，并且可以募集它們進入缺氧組織的血管系統，誘導分化為血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等，這三者的構成比在CNV的發展中會發生變化，預示著它們在CNV的不同發生發展階段發揮著不同的作用，但具體作用機制仍不十分清楚[34,36]。有研究認為，尼古丁能通過VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管細胞黏附分子（VCAM）-1來發揮作用；其實驗結果表明，尼古丁暴露上調病灶周圍VEGF、bFGF、VCAM-1的表達，VEGF和bFGF能加強動員和募集BMCs，VCAM-1能加強內皮細胞對BMCs的黏附[37-39]。
4 補體系統激活介導的尼古丁血管生成作用
補體是人體內一種重要的免疫分子，廣泛參與機體的防御反應及免疫調節，并可介導免疫病理的損傷性反應，是體內具有重要生物學作用的效應系統和效應放大系統。在細胞變性和有異常組織沉積的疾病中會發生補體的激活和與之相關的炎癥反應[40]。現有的研究顯示，補體系統的激活可能在CNV發病過程中發揮重要作用，尤其是旁路途徑。大樣本的臨床研究表明，吸煙和補體因子H（CFH）多態性是非常重要的AMD危險因素，超過50%的AMD患者發現有Y402H變異，而CFH是一種重要的補體調節蛋白，該變異嚴重影響補體系統的功能[41]。動物實驗發現，激光誘導的CNV小鼠模型補體因子B表達增高而補體調節蛋白CFH表達下降[42]。另有研究發現，尼古丁喂養的小鼠CD59高表達，CD59是補體系統的一個重要調控蛋白，可以募集、調控膜攻擊復合物（MAC），尼古丁調控轉錄因子核因子-κB從而調控CD59的轉錄，進而上調MAC，激活補體系統[43]。近年來的研究表明，尼古丁還可以通過裂解補體因子C3而直接激活補體級聯反應，活化補體旁路激活途徑，加重病灶局部的補體炎癥反應，從而促進CNV的形成[44]。但是尼古丁通過補體系統激活加重CNV的確切機制還有待進一步研究。
5 炎癥介導的尼古丁血管生成作用
CNV可以看作炎癥不斷發展的結果，隨炎癥發展，異常細胞外基質積聚，玻璃膜的構成成分和通透性逐漸發生改變，脂質和蛋白質含量增加，對水溶性物質、氨基酸以及RPE代謝產物的通透性均下降。為對抗這種改變，RPE產生VEGF和FGF，這些物質可以促進新生血管的生長。炎癥通過巨噬細胞、中性粒細胞、炎癥因子、補體系統、NO等促進CNV的生成和發展，尼古丁暴露促使RPE細胞分泌纖維連接蛋白、層粘連蛋白以及單核細胞趨化蛋白1等巨噬細胞趨化因子，使巨噬細胞趨化浸潤到病灶處[45]。此外，尼古丁通過巨噬細胞表面的nAchRs使其發生M2極化而分泌一系列炎癥因子和VEGF，促進CNV的形成[46]。作為CNV病灶VEGF的主要來源細胞，RPE細胞和巨噬細胞之間的交互在促進CNV形成中發揮關鍵作用[47-48]。
6 其他機制
Sastry和Hemontolor[49]研究發現，尼古丁及其代謝產物可影響磷脂酶A2（PLA2）的活性，視網膜中富含視蛋白、視紫紅質等多不飽和脂肪酸，激活的PLA2可以分解這些脂肪酸產生花生四烯酸和促炎前列腺素，而后者是強有力的促炎介質，進而可能通過炎癥機制使吸煙者發生AMD。此外，視黃醇是光感受器細胞中的重要活性物質，其在視細胞中的循環是產生光電轉化的物質基礎。有研究發現，尼古丁代謝產物可以催化視網膜中不飽和醛和酮的Z-to-E烯烴異構化，它是n-視黃醛-n-視黃醛乙醇胺的生物合成前體，而n-視黃醛-n-視黃醛乙醇胺是AMD的標志，煙堿催化的視網膜異構化可能是AMD的潛在分子機制[50]。Maugeri等[51]研究表明，尼古丁可以在低氧/高糖模型下激活細胞外信號調節激酶1/2磷酸化和上調HIF-1α/HIF-2α，進而促進VEGF分泌增多，最終導致RPE細胞的完整性破壞。VEGF是很強的促血管生成因子，因此尼古丁也可能通過此機制加重wAMD患者的CNV。
7 存在問題及展望
現有的研究雖然表明了尼古丁等煙草物質對wAMD患者的影響，但機制研究、基因易感性及新的治療靶點的尋找方面仍比較欠缺。鑒于即使戒煙后曾經吸煙對wAMD患者的損傷依然持續且二手煙不可避免的存在，目前臨床上無任何手段能有效阻止吸煙患者CNV病情的惡化。因此當務之急是尋找尼古丁加重wAMD的主要確切機制，針對可能機制的靶向治療協同抗VEGF藥物治療，為吸煙患者耐藥問題提供新的治療方式和更好的視覺質量。當前新一代測序方法很大程度上幫助研究者對疾病與基因內在聯系的認識，探索吸煙人群對尼古丁的易感性有助于我們對患者精準治療；炎癥機制在wAMD發病過程中的重要作用越來越被研究者重視，積極研究尼古丁如何通過炎癥機制加重wAMD，在此基礎上從中醫藥中發掘新型抗炎藥物是我們努力的方向。
脈絡膜新生血管（CNV）是滲出型老年性黃斑變性（wAMD）的特征性病理表現，由于新生血管通透性高導致視網膜下出血和滲出物沉積使視錐細胞變性壞死從而造成90%的AMD患者永久性視力喪失[1-2]。CNV的病因及發病機制尚未完全明確。大量的流行病學調查表明，吸煙不僅加速早期AMD患者的病情進展，而且使晚期AMD患者CNV發生率明顯增加[3]。煙草燃燒所產生的煙霧中含有7000余種化合物，大部分對人體有害[4]。尼古丁作為煙草中的重要有害物質，是一種易成癮且高毒性的生物堿（占煙草全部生物堿的95%以上）[5]。動物實驗和臨床研究均證實煙草中的尼古丁可加重CNV病情，而且吸煙對wAMD患者病情的有害作用即使在戒煙后仍可持續將近20年[6-9]。同時尼古丁可以阻斷抗VEGF藥物抑制CNV的效應，使wAMD吸煙患者抗VEGF藥物治療的療效明顯降低[10-11]。這或許從一定程度上解釋了為何臨床中部分患者對抗VEGF藥物不敏感的原因。但關于尼古丁加重wAMD患者病情的機制迄今不明，目前臨床上也無任何手段能有效阻止吸煙患者的CNV病情的惡化。因此，積極探討尼古丁加重wAMD的確切發病機制，有助于早期采取相應干預措施來預防或延緩其發展。現就尼古丁加重wAMD CNV形成的研究現狀作一綜述。
1 煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的結構
尼古丁是通過結合到相應細胞表面的nAChR上來發揮生物學效應，其促進新生血管的作用大部分也是通過nAChR介導的[12-14]。nAChR屬于膽堿能受體系統，是一種配體門控型離子通道蛋白，由5個亞基以不同的組合形式構成的同聚體或異聚體[15]。起初發現是在可興奮細胞內，但后來在內皮細胞、血管平滑肌細胞、角質細胞、免疫細胞和RPE細胞等許多類型的細胞上也發現了該受體[16-20]。nAChR在中樞和外周神經系統、肌肉間介導神經遞質的轉換以及非神經組織中發揮著重要的生理作用。內源性的乙酰膽堿或外源性的尼古丁能與nAChR相結合，使受體活化，通過亞基結構的改變使離子通道開放，而該通道對鈣離子具有高選擇通透性，這種短暫鈣離子的內流可能繼發性地引起其他鈣離子通道開放或胞內儲存鈣離子的釋放，維持胞內大約60 s的高鈣離子狀態，這種高鈣狀態參與一系列血管活動的調節[14, 21-24]。
2 內皮nAChR介導的尼古丁血管生成作用
尼古丁促進新生血管的作用主要是通過細胞表面的膽堿能受體介導的，其中內皮nAChR是重要的一類，而其中起決定性作用的是α7亞型。α7亞型是nAChR的一個同聚體，是內皮細胞上nAChR的優勢亞型[25]。研究表明，尼古丁能通過α7-nAChR促進VEGF、血小板源性生長因子、成纖維生長因子（FGF）2、早期生長反應基因1、金屬蛋白酶等的活化或釋放，從而促進內皮細胞的增生、移行、成管，并且該作用能被α7-nAChR的拮抗劑α-銀環蛇神經毒素、六烴季胺、美加明、MG624或該受體缺乏的小鼠所抑制[26-27]。VEGF是最重要的促血管生長因子，在CNV的發展中起著關鍵作用[28]。而人體中還存在著色素上皮衍生因子（PEDF）等抑制血管生長的因子，正常情況下這兩類因子保持平衡；但在病理狀態下，這種平衡被打破，使VEGF/PEDF比值升高，促進病理性血管的形成[20, 29]。經siRNA干擾其他亞型的表達后發現沒有作用亦或甚至加強了基礎及尼古丁誘導的新生血管；值得注意的是，干擾α9亞型后，內皮細胞的增生增強，這表明其他的亞型似乎并沒有參與尼古丁血管生成作用，這可能與他們亞基的聚合有關[21]。此外研究表明，M型膽堿能受體也可通過釋放血管生成因子、NO等促進皮膚血管生成，但缺乏對視網膜及脈絡膜內皮細胞的研究[30]。Pons和Marincastano[20]認為，尼古丁可以調節細胞外蛋白激酶1/2信號通路，從而促進血管生成。尼古丁結合nAChR后，除了能直接通過信號通路促進生長因子的表達、活化外，還能與VEGF、FGF等血管生成因子相互作用促進血管生成因子基因轉錄，并且可以增強VEGF受體的活性；此外，還可以促進內皮素、前列環素、NO的分泌，研究表明這三者也可以促進血管生成[31]。
3 骨髓原始細胞在尼古丁血管生成中的作用
既往研究認為，血管生成（angiogenesis）與血管發生（vasculogenesis）的機制是不同的，血管生成只是原有血管（主要指毛細血管和毛細血管后靜脈）以芽生的方式長出新的血管[32]。CNV的病理機制是血管生成，但現在這個觀念發生了改變。實驗表明，骨髓來源細胞（BMCs）參與生理性和病理性的血管生成[33-34]。Sheridan等[35]證明，BMCs在CNV的發展中起著重要的作用。盡管目前并不清楚前體細胞上是否有nAChR的表達，但實驗表明尼古丁可以劑量依賴性地增強BMCs增生、遷移、黏附和成管作用，增多小鼠骨髓和脾臟中BMCs數量，并且可以募集它們進入缺氧組織的血管系統，誘導分化為血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞等，這三者的構成比在CNV的發展中會發生變化，預示著它們在CNV的不同發生發展階段發揮著不同的作用，但具體作用機制仍不十分清楚[34,36]。有研究認為，尼古丁能通過VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管細胞黏附分子（VCAM）-1來發揮作用；其實驗結果表明，尼古丁暴露上調病灶周圍VEGF、bFGF、VCAM-1的表達，VEGF和bFGF能加強動員和募集BMCs，VCAM-1能加強內皮細胞對BMCs的黏附[37-39]。
4 補體系統激活介導的尼古丁血管生成作用
補體是人體內一種重要的免疫分子，廣泛參與機體的防御反應及免疫調節，并可介導免疫病理的損傷性反應，是體內具有重要生物學作用的效應系統和效應放大系統。在細胞變性和有異常組織沉積的疾病中會發生補體的激活和與之相關的炎癥反應[40]。現有的研究顯示，補體系統的激活可能在CNV發病過程中發揮重要作用，尤其是旁路途徑。大樣本的臨床研究表明，吸煙和補體因子H（CFH）多態性是非常重要的AMD危險因素，超過50%的AMD患者發現有Y402H變異，而CFH是一種重要的補體調節蛋白，該變異嚴重影響補體系統的功能[41]。動物實驗發現，激光誘導的CNV小鼠模型補體因子B表達增高而補體調節蛋白CFH表達下降[42]。另有研究發現，尼古丁喂養的小鼠CD59高表達，CD59是補體系統的一個重要調控蛋白，可以募集、調控膜攻擊復合物（MAC），尼古丁調控轉錄因子核因子-κB從而調控CD59的轉錄，進而上調MAC，激活補體系統[43]。近年來的研究表明，尼古丁還可以通過裂解補體因子C3而直接激活補體級聯反應，活化補體旁路激活途徑，加重病灶局部的補體炎癥反應，從而促進CNV的形成[44]。但是尼古丁通過補體系統激活加重CNV的確切機制還有待進一步研究。
5 炎癥介導的尼古丁血管生成作用
CNV可以看作炎癥不斷發展的結果，隨炎癥發展，異常細胞外基質積聚，玻璃膜的構成成分和通透性逐漸發生改變，脂質和蛋白質含量增加，對水溶性物質、氨基酸以及RPE代謝產物的通透性均下降。為對抗這種改變，RPE產生VEGF和FGF，這些物質可以促進新生血管的生長。炎癥通過巨噬細胞、中性粒細胞、炎癥因子、補體系統、NO等促進CNV的生成和發展，尼古丁暴露促使RPE細胞分泌纖維連接蛋白、層粘連蛋白以及單核細胞趨化蛋白1等巨噬細胞趨化因子，使巨噬細胞趨化浸潤到病灶處[45]。此外，尼古丁通過巨噬細胞表面的nAchRs使其發生M2極化而分泌一系列炎癥因子和VEGF，促進CNV的形成[46]。作為CNV病灶VEGF的主要來源細胞，RPE細胞和巨噬細胞之間的交互在促進CNV形成中發揮關鍵作用[47-48]。
6 其他機制
Sastry和Hemontolor[49]研究發現，尼古丁及其代謝產物可影響磷脂酶A2（PLA2）的活性，視網膜中富含視蛋白、視紫紅質等多不飽和脂肪酸，激活的PLA2可以分解這些脂肪酸產生花生四烯酸和促炎前列腺素，而后者是強有力的促炎介質，進而可能通過炎癥機制使吸煙者發生AMD。此外，視黃醇是光感受器細胞中的重要活性物質，其在視細胞中的循環是產生光電轉化的物質基礎。有研究發現，尼古丁代謝產物可以催化視網膜中不飽和醛和酮的Z-to-E烯烴異構化，它是n-視黃醛-n-視黃醛乙醇胺的生物合成前體，而n-視黃醛-n-視黃醛乙醇胺是AMD的標志，煙堿催化的視網膜異構化可能是AMD的潛在分子機制[50]。Maugeri等[51]研究表明，尼古丁可以在低氧/高糖模型下激活細胞外信號調節激酶1/2磷酸化和上調HIF-1α/HIF-2α，進而促進VEGF分泌增多，最終導致RPE細胞的完整性破壞。VEGF是很強的促血管生成因子，因此尼古丁也可能通過此機制加重wAMD患者的CNV。
7 存在問題及展望
現有的研究雖然表明了尼古丁等煙草物質對wAMD患者的影響，但機制研究、基因易感性及新的治療靶點的尋找方面仍比較欠缺。鑒于即使戒煙后曾經吸煙對wAMD患者的損傷依然持續且二手煙不可避免的存在，目前臨床上無任何手段能有效阻止吸煙患者CNV病情的惡化。因此當務之急是尋找尼古丁加重wAMD的主要確切機制，針對可能機制的靶向治療協同抗VEGF藥物治療，為吸煙患者耐藥問題提供新的治療方式和更好的視覺質量。當前新一代測序方法很大程度上幫助研究者對疾病與基因內在聯系的認識，探索吸煙人群對尼古丁的易感性有助于我們對患者精準治療；炎癥機制在wAMD發病過程中的重要作用越來越被研究者重視，積極研究尼古丁如何通過炎癥機制加重wAMD，在此基礎上從中醫藥中發掘新型抗炎藥物是我們努力的方向。