基因治療是視網膜色素變性(RP)治療研究的熱點之一。經動物實驗及臨床試驗證實, 腺相關病毒(AAV)載體因其無致病性、宿主范圍廣、轉染和表達效率高、目的基因長期表達等優點成為視網膜疾病基因治療的重要載體。但如何建立安全有效的基因治療導入系統是目前臨床需要首要解決的問題。此外, 由于基因的導向性和表達的調控性較為局限, 也限制了AAV載體介導的基因治療在臨床的廣泛應用。進一步深入研究AAV的病毒生物學基礎, 設計更多的組織特異性啟動子以提高AAV載體的轉染效率、靶向能力和安全性將為RP基因治療帶來新的曙光。
引用本文： 李光輝, 曾芳, 王曄愷, 黎運呈, 宋毅果. 腺相關病毒載體在視網膜色素變性基因治療中的應用研究進展. 中華眼底病雜志, 2014, 30(6): 636-639. doi: 10.3760/cam.j.issn.1005-1015.2014.06.031 復制
基因治療是視網膜色素變性(RP)治療研究的熱點之一，而如何建立安全有效的基因治療導入系統也成為臨床關注的重點。腺相關病毒(AAV)載體作為基因轉移載體具有安全性好、宿主范圍廣、轉染和表達效率高、目的基因長期表達等優勢，是RP基因治療領域最具潛力和應用價值的病毒載體。其已在RP基因治療研究中得到廣泛應用，并有若干項目進入臨床試驗。現就AAV在RP基因治療中的應用及研究進展作一綜述。
1 AAV和重組AAV(rAAV)載體的基因轉移途徑
AAV和rAAV載體介導的眼部基因轉移途徑為體內途徑。根據治療目的不同，主要注射方式包括玻璃體腔注射、視網膜下注射、前房注射、結膜下注射等，針對不同的組織和細胞產生不同的轉染效果。研究表明，在多種動物模型中，玻璃體腔注射AAV和rAAV載體主要轉染視網膜神經節細胞、無長突細胞及Müller細胞；視網膜下腔注射AAV和rAAV載體主要轉染視網膜色素上皮(RPE)細胞和光感受器細胞，不會觸發體液免疫反應，并且對于另一只眼再次進行視網膜下腔注射也無影響。說明視網膜下注射或玻璃體腔注射AAV和rAAV載體可以穩定、高效和長期地轉染目的細胞。并且，rAAV不含產生細胞免疫反應的病毒基，一般不會誘發炎癥反應。采用rAAV載體雖然效率降低，但是可以增強AAV的輸送能力[1, 2]。
2 AAV載體在RP基因治療動物實驗中的應用
2.1 AAV介導的基因替代療法
某些RP因某一基因變異、功能缺陷而產生。對于這類RP，把正常基因導入視網膜靶細胞，使其產生正常的基因表現型且穩定表達即可，這是目前最常用的基因治療技術。該技術適合于常染色體隱性遺傳RP(ARRP)，因為只需要通過基因增補技術把正常基因導入光感受器細胞內，以產生正常的基因表型發揮補償作用即可。目前已發現了RPE65、磷酸二酯酶(PDE)、視紫紅質(RHO)、Peripherin／RDS等多個與RP有關的基因突變。RPE65基因突變可導致早發型ARRP。Acland等[3, 4]和Weber等[5]采用自然發生的RPE65基因突變致盲的大型哺乳動物狗遺傳模型，發現rAAV介導的一個RPE表達基因RPE65的導入，能阻止在狗中發生的視網膜退化，而且視覺得到明顯恢復。Le Meur等[6]報道，Leber先天性黑矇(LCA)瑞典Briard狗視網膜下注射rAAV介導的人RPE65 cDNA，2周后瞳孔對光反應改善、眼球震顫減輕，5周后視網膜電圖(ERG)出現反應，3個月達到高峰后逐漸下降，3年后ERG波幅仍明顯大于對照眼。Bennicelli等[7]對RPE65基因突變小鼠行視網膜下注射AAV2攜帶的野生型人RPE65 cDNA重組體，發現其ERG和視敏度有改善；在狗的視網膜下注入人RPE65基因片段載體，發現狗視覺行為和視功能瞳孔反應也有提高。
RHO與RP發病有關，在常染色體顯性遺傳RP(ADRP)、ARRP患者中均有RHO基因突變。RHO基因是最早發現的和RP發病有關的基因，它可以表達成一個由348氨基酸構成的蛋白，僅在視桿細胞中表達，其突變是ADRP患者發病的一個主要原因。研究表明，約30%ADRP的產生是RHO基因突變引起[8]。
編碼Peripherin-2的Prph2基因突變可引起ADRP、黃斑變性等視網膜疾病。將Prph2基因轉移到完全不能形成外節的rd小鼠后，光感受器細胞的外節形態能維持42周。研究發現，在攜帶Peripherin-2突變基因的rd小鼠模型中，以AAV為載體導入Vwh2基因，可以促進不同的光感受器細胞亞型功能和超微結構的改變，還可以增加視覺敏感度，這對幼年小鼠和成年小鼠的光感受器細胞均有一定的改善效果，并且對幼年小鼠的改善尤為明顯；但隨著導入基因表達的降低，并沒有明顯改善光感受器細胞的凋亡。
PDE基因突變是ARRP常見病因，可使環磷酸鳥苷(cGMP)-PDE蛋白分子變短，酶活性下降，導致cGMP在光感受器細胞內積聚和視網膜變性的發生。Pang等[9]以AAV8為載體將PDEβ注入PDEβ突變所致rd10小鼠視網膜下，發現對小鼠視網膜有保護作用。Yao等[10]發現AAV載體介導的PDEβ基因治療，可以有效改善視網膜的結構和功能，但持續時間短。為了延長治療持續時間，他們用AAV5載體將性連鎖凋亡抑制基因(XIAP)和PDEβ導入rd10小鼠視網膜下腔，發現與對照組相比，抗凋亡基因XIAP的輔助治療可以給PDEβ基因替代療法提供更大的年齡范圍，從而有效延長治療干預的機會窗口。Petit等[11]檢驗了rAAV載體介導的基因治療在視桿視錐發育不良Ⅰ型(rcdⅠ)狗身上的效果，這種基因缺陷狗極度類似于人視桿細胞cGMPPDE6β缺陷的病理改變。實驗結果顯示，與對照組相比，視網膜下注射AAV2/5或AAV2/8載體介導的基因可以有效改善視網膜功能，1個月后35%的治療眼功能正常，并且在18個月的觀察期內保持功能穩定。首次證明基因治療可以成功應用于常染色體隱性遺傳視桿視錐細胞營養不良的大型動物模型，而且療效穩定，很有潛力應用于大規模的臨床前研究。
2.2 AAV介導的基因阻斷療法
某些ADRP發病的原因是某些基因變異在光感受器產生了異常蛋白或者基因產物錯位表達，對光感受器產生毒性作用，進而通過凋亡途徑誘導細胞死亡。因此，治療這類疾病可以通過消除或矯正錯誤基因來挽救視功能。目前常用的是基因失活技術，包括反義治療和核酶治療。反義治療是指天然存在的或者人工合成的一類RNA分子，它不能編碼蛋白質，但它的核苷酸順序與某種mRNA可互補配對，所以這種反義RNA可與mRNA結合配對從而干擾mRNA的翻譯，使相應的基因不能表達。這種利用反義RNA封閉某個基因(靶基因)的技術就成為反義技術。核酶治療可以把目的mRNA消化，從而阻斷其翻譯。基因失活技術主要應用于ADRP，利用RNA干擾來封閉異常基因表達。把異常基因刪除或封閉其表達，同時保持正常野生型蛋白質的功能。
Maguire等[12]應用RNA干擾技術在RHO基因突變引起的RP小鼠視網膜下腔注入攜帶RHO的AAV載體，并聯合植入野生型RHO基因，發現該方法可以有效治療RHO基因突變引起的RP。目前有多個研究已經或正在開發使用RNAi和AAV載體的聯合應用對ADRP進行治療[13, 14]。Millington-Ward等[15]使用了兩種載體來治療ADRP小鼠模型，一個AAV病毒載體提供轉移shRNA和另一個提供轉移替換RHO的cRNA，20周注射治療后，眼中產生平均為60 μV的b波響應。Mao等[16]使用了單一的AAV載體系統，表達RHO置換cDNA和小干擾RNA(siRNA)來對抗小鼠和人類P23H RHO mRNA，對視網膜結構和功能產生持久影響，防止產生過多的RHO引起對光感受器細胞的損害；變性的視網膜色素細胞在注射后2個月，視網膜功能恢復，出現ERG反應，并且一直保持到9個月實驗結束時，實驗組外核層和光感受器細胞外段保持正常厚度，對照組變薄。表明單一的AAV載體表達修飾cDNA和siRNA可以對ADRP產生持久保護。因為siRNA的靶向在人和大鼠之間沒有區別。提示這種復合表達載體可以治療相關疾病。
目前核酶在ADRP的基因治療研究中應用廣泛[17]。可使用核酶通過阻斷突變體等位基因的基因產物，從而阻止或減緩ADRP疾病的進展。Drenser等[18]研究表明，核酶可以用來降低突變體的RHO信使RNA量。隨后采用rAAV轉導核酶和視蛋白啟動子到RHO突變體(pro23his)轉基因鼠光感受器細胞，證明核酶可以減緩光感受器變性，治療是有效的[19]。Shaw等[20]將rAAV轉導錘頭狀核酶導入P347L豬眼后，發現錘頭狀核酶能靶向破壞P347L序列，發揮保護光感受器細胞的作用。Gorbatyuk等[21]在P23H基因突變鼠的視網膜下注射攜帶獨立等位基因核酶Rz525的rAAV2/5載體，12周后檢測結果顯示能明顯保護實驗眼暗適應ERG的a、b波振幅，證明基因轉移能阻止視網膜外核層的變性。研究者將有催化活性的錘頭狀或發夾狀核酶導入P23H基因突變大鼠，發現能明顯延緩光感受器細胞的變性且至少維持3個月，而導入無催化活性的核酶則無治療作用；其他AAV載體聯合核酶治療ADRP的潛力也已經在組織培養和動物模型實驗中被證明[22-24]。
2.3 AAV介導抗凋亡因子
細胞凋亡被公認是RP中光感受器細胞破壞的最主要機制，通過抑制光感受器細胞凋亡可延緩RP的發生。2007年，Leonard等[25]使用AAV載體將XIAP導入P23H和S334 RHO轉基因RP大鼠模型，發現其在結構和功能學水平上產生了持久的光感受器神經保護作用。B細胞淋巴瘤(bcl)-2家族是應用廣泛的一種抑制凋亡的基因。Bax基因的產物與bcl-2家族蛋白同源，可以拮抗bcl-2家族抑制凋亡蛋白的生物活性，導致細胞凋亡。2014年Comitato等[26]發現鈣蛋白酶1和組織蛋白酶D可以激活bax基因和凋亡誘導因子(Aif)的核內傳遞，導致光感受器細胞的凋亡；通過玻璃體內注射蛋白酶抑制劑可以抑制鈣蛋白酶1和組織蛋白酶D引起的bax基因激活，從而可以保護rd1、 P23H轉基因和RHO基因敲除視網膜的光感受器細胞。Bcl-2家族已被證實可以阻斷光感受器細胞的凋亡而促進細胞的存活，然而其過度表達也可能導致野生型大鼠光感受器細胞死亡。Nir等[27]利用AAV攜帶bcl-xl注射到RDS大鼠視網膜下腔，發現bcl-2在局部廣泛表達，注射后2、3、4周外核層明顯較對照組增厚；雖然RDS大鼠光感受器外段沒有形成，但是阻止了光感受器細胞的凋亡。Tsang等[28]以AAV為載體，通過轉基因技術將凋亡抑制基因bcl-2導入Pdegtml/Pdegtml小鼠中，發現其能延緩光感受器細胞變性的發生和發展。提示bcl-2可以有效控制Pdegtml/Pdegtml小鼠模型中視網膜光感受器細胞的凋亡。
2.4 AAV介導生長因子的基因治療
AAV介導生長因子的基因包括睫狀肌源性神經營養因子(CNTF)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、堿性成纖維生長因子(BFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(ngf)等。視網膜下腔或玻璃體腔注入細胞生長因子或神經營養因子均能延緩光感受器細胞變性的形成，這種營養因子可以起到保護視網膜光感受器細胞的作用。所以，導入編碼這些因子的基因將是一種可行的方法。
Cayouette等[29]將AAV攜帶的CNTF cDNA分別導入rd/rds鼠光感受器細胞中，發現可阻止視網膜變性中視桿細胞的丟失，且暗適應ERG波幅有明顯改善。提示治療后光感受器細胞功能有明顯提高。Liang等[30]利用AAV攜帶CNTF基因視網膜下注射治療RHO基因缺失的小鼠，組織學觀察發現注射部位的光感受器細胞有明顯的保留，并且這種作用在3個月內的實驗階段持續存在。Bok等[31]將載有CNTF cDNA片斷的AAV注入RP rd小鼠和先天性視網膜變性rds小鼠的玻璃體腔，發現延緩了光感受器細胞的萎縮，視桿細胞內的RHO含量增加，相應暗適應ERG的波幅也得到改善。Rhee等[32]將rAAV介導的CNTF注射到RP小鼠視網膜下腔，發現可以維持光感受器細胞內RHO的表達。然而，CNTF的感光基因表達是短暫的。
McGee等[33]利用AAV攜帶GDNF基因導人小鼠45 d后，細胞體、光感受器細胞內節及外節和RPE均表達GDNF，治療組的結構和功能均優于對照組。多項研究結果亦證明，應用GDNF治療RP動物模型可維持光感受器細胞存活，并保存視功能，GDNF聯合基因替換或細胞移植治療RP可獲得協同效應[34, 35]。Buch等[36]采用Prph2 rd2/rd2鼠模型和視網膜變性RCS大鼠模型發現，AAV-CBA-GDNF可明顯改善ERG功能，GDNF無反應性抑制視網膜電生理的副作用，同時可以加強基因移植治療的作用。
Lau等[37]利用AAV攜帶BFGF基因視網膜下注射轉基因RP鼠模型，發現視網膜內高水平BFGF減慢了光感受器細胞的變性速度，對改善光感受器細胞功能有一定的療效。多種視網膜細胞具有編碼BFGF mRNA的功能，視網膜組織缺乏BFGF，可引起順行性營養性神經細胞壞死。
3 AAV在RP基因治療中的臨床應用
2008年美國和英國的3個研究小組幾乎同時宣布，其成功為9例LCAⅡ型患者施行基因治療，更重要的是3個治療組均沒有患者出現嚴重眼內炎癥反應[38, 39]。這是人類第一次在遺傳性視網膜疾病方面進行的基因治療，同時也是第一次在眼科疾病方面進行的基因治療，它標志著基因治療真正從實驗室走向臨床，真正開啟了眼科遺傳性疾病基因治療的新時代，為今后進行遺傳性視網膜疾病的基因治療開辟了光明前景。
Bainbridge等[38]給予3例RPE65基因突變導致的青年早發性嚴重視網膜變性患者視網膜下腔注射rAAV介導的RPE65基因，盡管患者視力無明顯改善，但均未發生嚴重不良反應，且其中1例患者的暗適應和微視野功能明顯改善。Maguire等[12]對3例患者行視網膜下腔注射AAV2病毒載體治療，1例患者主觀視功能輕微改善；1例患者形成無癥狀性黃斑裂孔，視網膜功能有一定恢復。Simonelli等[40]對這3例患者進行了1.5年的隨訪觀察，未見對外源性RPE65蛋白產生的體液免疫反應，無手術后感染和急性視網膜毒性反應。說明基因治療的有效性和持續性至少可以達1.5年。Cideciyan等[39]報道，3例LCA患者經視網膜下腔局部注射治療后30 d，視敏感度明顯增加，后續觀察2個月，無明顯變化；視錐細胞視敏感度較治療前增加約50倍，視桿細胞提高63 000倍。治療后隨訪1年期間，患者視敏感度沒有下降，無全身及局部毒性反應。治療后1年，患者注視點逐漸轉變至黃斑旁的治療域，并能在低照明下辨別視標。提示基因治療后患者視功能可以逐步改善。Maguire等[41]進行了一期臨床試驗，試驗包括12例RPE65相關的LCA患者，使用攜帶RPE65基因的rAAV(AAV2-hRPE65v2)進行最差眼單眼視網膜下注射，劑量分為低(1.5×1010載體基因組)、中(4.8×1010載體基因組)和高劑量(1.5×1011載體基因組)，治療持續2年。試驗結束對患者視網膜和視覺功能進行評估，結果顯示AAV2-hRPE65v2耐受性好，所有患者在主觀和客觀指標(暗適應、瞳孔直徑測定、ERG、眼球震顫和行為學)上都有了明顯改善，瞳孔對光反射靈敏；所有兒童患者都獲得了動態視覺，1例8歲患者的光敏感度恢復至與同齡者類似。提示AAV介導的基因治療在治療遺傳性視網膜疾病時顯示了卓越的安全性和穩定性，能提高患者視力，越早干預效果越好。至目前為止，超過30例患者接受了基因治療，隨訪時間90 d到1.5年不等，大多數患者特別是兒童的視力表現出持續的改善，而且沒有嚴重的副作用[42, 43]。
基因治療是RP目前最有前景的治療方法之一。雖然已有研究證實基因治療RP有較好效果，但缺乏大樣本長期隨機對照實驗，尚處于摸索階段，未來亟待大量臨床試驗來驗證。相信在不久的將來，隨著對RP認識的進一步加深，大量的動物模型及人體試驗將會給RP患者帶來福音。
基因治療是視網膜色素變性(RP)治療研究的熱點之一，而如何建立安全有效的基因治療導入系統也成為臨床關注的重點。腺相關病毒(AAV)載體作為基因轉移載體具有安全性好、宿主范圍廣、轉染和表達效率高、目的基因長期表達等優勢，是RP基因治療領域最具潛力和應用價值的病毒載體。其已在RP基因治療研究中得到廣泛應用，并有若干項目進入臨床試驗。現就AAV在RP基因治療中的應用及研究進展作一綜述。
1 AAV和重組AAV(rAAV)載體的基因轉移途徑
AAV和rAAV載體介導的眼部基因轉移途徑為體內途徑。根據治療目的不同，主要注射方式包括玻璃體腔注射、視網膜下注射、前房注射、結膜下注射等，針對不同的組織和細胞產生不同的轉染效果。研究表明，在多種動物模型中，玻璃體腔注射AAV和rAAV載體主要轉染視網膜神經節細胞、無長突細胞及Müller細胞；視網膜下腔注射AAV和rAAV載體主要轉染視網膜色素上皮(RPE)細胞和光感受器細胞，不會觸發體液免疫反應，并且對于另一只眼再次進行視網膜下腔注射也無影響。說明視網膜下注射或玻璃體腔注射AAV和rAAV載體可以穩定、高效和長期地轉染目的細胞。并且，rAAV不含產生細胞免疫反應的病毒基，一般不會誘發炎癥反應。采用rAAV載體雖然效率降低，但是可以增強AAV的輸送能力[1, 2]。
2 AAV載體在RP基因治療動物實驗中的應用
2.1 AAV介導的基因替代療法
某些RP因某一基因變異、功能缺陷而產生。對于這類RP，把正常基因導入視網膜靶細胞，使其產生正常的基因表現型且穩定表達即可，這是目前最常用的基因治療技術。該技術適合于常染色體隱性遺傳RP(ARRP)，因為只需要通過基因增補技術把正常基因導入光感受器細胞內，以產生正常的基因表型發揮補償作用即可。目前已發現了RPE65、磷酸二酯酶(PDE)、視紫紅質(RHO)、Peripherin／RDS等多個與RP有關的基因突變。RPE65基因突變可導致早發型ARRP。Acland等[3, 4]和Weber等[5]采用自然發生的RPE65基因突變致盲的大型哺乳動物狗遺傳模型，發現rAAV介導的一個RPE表達基因RPE65的導入，能阻止在狗中發生的視網膜退化，而且視覺得到明顯恢復。Le Meur等[6]報道，Leber先天性黑矇(LCA)瑞典Briard狗視網膜下注射rAAV介導的人RPE65 cDNA，2周后瞳孔對光反應改善、眼球震顫減輕，5周后視網膜電圖(ERG)出現反應，3個月達到高峰后逐漸下降，3年后ERG波幅仍明顯大于對照眼。Bennicelli等[7]對RPE65基因突變小鼠行視網膜下注射AAV2攜帶的野生型人RPE65 cDNA重組體，發現其ERG和視敏度有改善；在狗的視網膜下注入人RPE65基因片段載體，發現狗視覺行為和視功能瞳孔反應也有提高。
RHO與RP發病有關，在常染色體顯性遺傳RP(ADRP)、ARRP患者中均有RHO基因突變。RHO基因是最早發現的和RP發病有關的基因，它可以表達成一個由348氨基酸構成的蛋白，僅在視桿細胞中表達，其突變是ADRP患者發病的一個主要原因。研究表明，約30%ADRP的產生是RHO基因突變引起[8]。
編碼Peripherin-2的Prph2基因突變可引起ADRP、黃斑變性等視網膜疾病。將Prph2基因轉移到完全不能形成外節的rd小鼠后，光感受器細胞的外節形態能維持42周。研究發現，在攜帶Peripherin-2突變基因的rd小鼠模型中，以AAV為載體導入Vwh2基因，可以促進不同的光感受器細胞亞型功能和超微結構的改變，還可以增加視覺敏感度，這對幼年小鼠和成年小鼠的光感受器細胞均有一定的改善效果，并且對幼年小鼠的改善尤為明顯；但隨著導入基因表達的降低，并沒有明顯改善光感受器細胞的凋亡。
PDE基因突變是ARRP常見病因，可使環磷酸鳥苷(cGMP)-PDE蛋白分子變短，酶活性下降，導致cGMP在光感受器細胞內積聚和視網膜變性的發生。Pang等[9]以AAV8為載體將PDEβ注入PDEβ突變所致rd10小鼠視網膜下，發現對小鼠視網膜有保護作用。Yao等[10]發現AAV載體介導的PDEβ基因治療，可以有效改善視網膜的結構和功能，但持續時間短。為了延長治療持續時間，他們用AAV5載體將性連鎖凋亡抑制基因(XIAP)和PDEβ導入rd10小鼠視網膜下腔，發現與對照組相比，抗凋亡基因XIAP的輔助治療可以給PDEβ基因替代療法提供更大的年齡范圍，從而有效延長治療干預的機會窗口。Petit等[11]檢驗了rAAV載體介導的基因治療在視桿視錐發育不良Ⅰ型(rcdⅠ)狗身上的效果，這種基因缺陷狗極度類似于人視桿細胞cGMPPDE6β缺陷的病理改變。實驗結果顯示，與對照組相比，視網膜下注射AAV2/5或AAV2/8載體介導的基因可以有效改善視網膜功能，1個月后35%的治療眼功能正常，并且在18個月的觀察期內保持功能穩定。首次證明基因治療可以成功應用于常染色體隱性遺傳視桿視錐細胞營養不良的大型動物模型，而且療效穩定，很有潛力應用于大規模的臨床前研究。
2.2 AAV介導的基因阻斷療法
某些ADRP發病的原因是某些基因變異在光感受器產生了異常蛋白或者基因產物錯位表達，對光感受器產生毒性作用，進而通過凋亡途徑誘導細胞死亡。因此，治療這類疾病可以通過消除或矯正錯誤基因來挽救視功能。目前常用的是基因失活技術，包括反義治療和核酶治療。反義治療是指天然存在的或者人工合成的一類RNA分子，它不能編碼蛋白質，但它的核苷酸順序與某種mRNA可互補配對，所以這種反義RNA可與mRNA結合配對從而干擾mRNA的翻譯，使相應的基因不能表達。這種利用反義RNA封閉某個基因(靶基因)的技術就成為反義技術。核酶治療可以把目的mRNA消化，從而阻斷其翻譯。基因失活技術主要應用于ADRP，利用RNA干擾來封閉異常基因表達。把異常基因刪除或封閉其表達，同時保持正常野生型蛋白質的功能。
Maguire等[12]應用RNA干擾技術在RHO基因突變引起的RP小鼠視網膜下腔注入攜帶RHO的AAV載體，并聯合植入野生型RHO基因，發現該方法可以有效治療RHO基因突變引起的RP。目前有多個研究已經或正在開發使用RNAi和AAV載體的聯合應用對ADRP進行治療[13, 14]。Millington-Ward等[15]使用了兩種載體來治療ADRP小鼠模型，一個AAV病毒載體提供轉移shRNA和另一個提供轉移替換RHO的cRNA，20周注射治療后，眼中產生平均為60 μV的b波響應。Mao等[16]使用了單一的AAV載體系統，表達RHO置換cDNA和小干擾RNA(siRNA)來對抗小鼠和人類P23H RHO mRNA，對視網膜結構和功能產生持久影響，防止產生過多的RHO引起對光感受器細胞的損害；變性的視網膜色素細胞在注射后2個月，視網膜功能恢復，出現ERG反應，并且一直保持到9個月實驗結束時，實驗組外核層和光感受器細胞外段保持正常厚度，對照組變薄。表明單一的AAV載體表達修飾cDNA和siRNA可以對ADRP產生持久保護。因為siRNA的靶向在人和大鼠之間沒有區別。提示這種復合表達載體可以治療相關疾病。
目前核酶在ADRP的基因治療研究中應用廣泛[17]。可使用核酶通過阻斷突變體等位基因的基因產物，從而阻止或減緩ADRP疾病的進展。Drenser等[18]研究表明，核酶可以用來降低突變體的RHO信使RNA量。隨后采用rAAV轉導核酶和視蛋白啟動子到RHO突變體(pro23his)轉基因鼠光感受器細胞，證明核酶可以減緩光感受器變性，治療是有效的[19]。Shaw等[20]將rAAV轉導錘頭狀核酶導入P347L豬眼后，發現錘頭狀核酶能靶向破壞P347L序列，發揮保護光感受器細胞的作用。Gorbatyuk等[21]在P23H基因突變鼠的視網膜下注射攜帶獨立等位基因核酶Rz525的rAAV2/5載體，12周后檢測結果顯示能明顯保護實驗眼暗適應ERG的a、b波振幅，證明基因轉移能阻止視網膜外核層的變性。研究者將有催化活性的錘頭狀或發夾狀核酶導入P23H基因突變大鼠，發現能明顯延緩光感受器細胞的變性且至少維持3個月，而導入無催化活性的核酶則無治療作用；其他AAV載體聯合核酶治療ADRP的潛力也已經在組織培養和動物模型實驗中被證明[22-24]。
2.3 AAV介導抗凋亡因子
細胞凋亡被公認是RP中光感受器細胞破壞的最主要機制，通過抑制光感受器細胞凋亡可延緩RP的發生。2007年，Leonard等[25]使用AAV載體將XIAP導入P23H和S334 RHO轉基因RP大鼠模型，發現其在結構和功能學水平上產生了持久的光感受器神經保護作用。B細胞淋巴瘤(bcl)-2家族是應用廣泛的一種抑制凋亡的基因。Bax基因的產物與bcl-2家族蛋白同源，可以拮抗bcl-2家族抑制凋亡蛋白的生物活性，導致細胞凋亡。2014年Comitato等[26]發現鈣蛋白酶1和組織蛋白酶D可以激活bax基因和凋亡誘導因子(Aif)的核內傳遞，導致光感受器細胞的凋亡；通過玻璃體內注射蛋白酶抑制劑可以抑制鈣蛋白酶1和組織蛋白酶D引起的bax基因激活，從而可以保護rd1、 P23H轉基因和RHO基因敲除視網膜的光感受器細胞。Bcl-2家族已被證實可以阻斷光感受器細胞的凋亡而促進細胞的存活，然而其過度表達也可能導致野生型大鼠光感受器細胞死亡。Nir等[27]利用AAV攜帶bcl-xl注射到RDS大鼠視網膜下腔，發現bcl-2在局部廣泛表達，注射后2、3、4周外核層明顯較對照組增厚；雖然RDS大鼠光感受器外段沒有形成，但是阻止了光感受器細胞的凋亡。Tsang等[28]以AAV為載體，通過轉基因技術將凋亡抑制基因bcl-2導入Pdegtml/Pdegtml小鼠中，發現其能延緩光感受器細胞變性的發生和發展。提示bcl-2可以有效控制Pdegtml/Pdegtml小鼠模型中視網膜光感受器細胞的凋亡。
2.4 AAV介導生長因子的基因治療
AAV介導生長因子的基因包括睫狀肌源性神經營養因子(CNTF)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、堿性成纖維生長因子(BFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(ngf)等。視網膜下腔或玻璃體腔注入細胞生長因子或神經營養因子均能延緩光感受器細胞變性的形成，這種營養因子可以起到保護視網膜光感受器細胞的作用。所以，導入編碼這些因子的基因將是一種可行的方法。
Cayouette等[29]將AAV攜帶的CNTF cDNA分別導入rd/rds鼠光感受器細胞中，發現可阻止視網膜變性中視桿細胞的丟失，且暗適應ERG波幅有明顯改善。提示治療后光感受器細胞功能有明顯提高。Liang等[30]利用AAV攜帶CNTF基因視網膜下注射治療RHO基因缺失的小鼠，組織學觀察發現注射部位的光感受器細胞有明顯的保留，并且這種作用在3個月內的實驗階段持續存在。Bok等[31]將載有CNTF cDNA片斷的AAV注入RP rd小鼠和先天性視網膜變性rds小鼠的玻璃體腔，發現延緩了光感受器細胞的萎縮，視桿細胞內的RHO含量增加，相應暗適應ERG的波幅也得到改善。Rhee等[32]將rAAV介導的CNTF注射到RP小鼠視網膜下腔，發現可以維持光感受器細胞內RHO的表達。然而，CNTF的感光基因表達是短暫的。
McGee等[33]利用AAV攜帶GDNF基因導人小鼠45 d后，細胞體、光感受器細胞內節及外節和RPE均表達GDNF，治療組的結構和功能均優于對照組。多項研究結果亦證明，應用GDNF治療RP動物模型可維持光感受器細胞存活，并保存視功能，GDNF聯合基因替換或細胞移植治療RP可獲得協同效應[34, 35]。Buch等[36]采用Prph2 rd2/rd2鼠模型和視網膜變性RCS大鼠模型發現，AAV-CBA-GDNF可明顯改善ERG功能，GDNF無反應性抑制視網膜電生理的副作用，同時可以加強基因移植治療的作用。
Lau等[37]利用AAV攜帶BFGF基因視網膜下注射轉基因RP鼠模型，發現視網膜內高水平BFGF減慢了光感受器細胞的變性速度，對改善光感受器細胞功能有一定的療效。多種視網膜細胞具有編碼BFGF mRNA的功能，視網膜組織缺乏BFGF，可引起順行性營養性神經細胞壞死。
3 AAV在RP基因治療中的臨床應用
2008年美國和英國的3個研究小組幾乎同時宣布，其成功為9例LCAⅡ型患者施行基因治療，更重要的是3個治療組均沒有患者出現嚴重眼內炎癥反應[38, 39]。這是人類第一次在遺傳性視網膜疾病方面進行的基因治療，同時也是第一次在眼科疾病方面進行的基因治療，它標志著基因治療真正從實驗室走向臨床，真正開啟了眼科遺傳性疾病基因治療的新時代，為今后進行遺傳性視網膜疾病的基因治療開辟了光明前景。
Bainbridge等[38]給予3例RPE65基因突變導致的青年早發性嚴重視網膜變性患者視網膜下腔注射rAAV介導的RPE65基因，盡管患者視力無明顯改善，但均未發生嚴重不良反應，且其中1例患者的暗適應和微視野功能明顯改善。Maguire等[12]對3例患者行視網膜下腔注射AAV2病毒載體治療，1例患者主觀視功能輕微改善；1例患者形成無癥狀性黃斑裂孔，視網膜功能有一定恢復。Simonelli等[40]對這3例患者進行了1.5年的隨訪觀察，未見對外源性RPE65蛋白產生的體液免疫反應，無手術后感染和急性視網膜毒性反應。說明基因治療的有效性和持續性至少可以達1.5年。Cideciyan等[39]報道，3例LCA患者經視網膜下腔局部注射治療后30 d，視敏感度明顯增加，后續觀察2個月，無明顯變化；視錐細胞視敏感度較治療前增加約50倍，視桿細胞提高63 000倍。治療后隨訪1年期間，患者視敏感度沒有下降，無全身及局部毒性反應。治療后1年，患者注視點逐漸轉變至黃斑旁的治療域，并能在低照明下辨別視標。提示基因治療后患者視功能可以逐步改善。Maguire等[41]進行了一期臨床試驗，試驗包括12例RPE65相關的LCA患者，使用攜帶RPE65基因的rAAV(AAV2-hRPE65v2)進行最差眼單眼視網膜下注射，劑量分為低(1.5×1010載體基因組)、中(4.8×1010載體基因組)和高劑量(1.5×1011載體基因組)，治療持續2年。試驗結束對患者視網膜和視覺功能進行評估，結果顯示AAV2-hRPE65v2耐受性好，所有患者在主觀和客觀指標(暗適應、瞳孔直徑測定、ERG、眼球震顫和行為學)上都有了明顯改善，瞳孔對光反射靈敏；所有兒童患者都獲得了動態視覺，1例8歲患者的光敏感度恢復至與同齡者類似。提示AAV介導的基因治療在治療遺傳性視網膜疾病時顯示了卓越的安全性和穩定性，能提高患者視力，越早干預效果越好。至目前為止，超過30例患者接受了基因治療，隨訪時間90 d到1.5年不等，大多數患者特別是兒童的視力表現出持續的改善，而且沒有嚴重的副作用[42, 43]。
基因治療是RP目前最有前景的治療方法之一。雖然已有研究證實基因治療RP有較好效果，但缺乏大樣本長期隨機對照實驗，尚處于摸索階段，未來亟待大量臨床試驗來驗證。相信在不久的將來，隨著對RP認識的進一步加深，大量的動物模型及人體試驗將會給RP患者帶來福音。