目的構建含BMP-2和TGF-β3基因的重組腺病毒載體，雙基因共轉染滇南小耳豬BMSCs并檢測其表達，為組織工程軟骨支架提供改良的種子細胞。 方法用PCR方法擴增人BMP-2和TGF-β3目的基因，將2個基因亞克隆至穿梭載體pEC3.1（+）中，構建pEC-GIE3.1-BMP-2和pEC-GIE3.1-TGF-β3重組質粒，通過體外同源重組反應將pEC-GIE3.1-BMP-2、pEC-GIE3.1-TGF-β3重組至腺病毒骨架質粒pGSadeno中，構建重組腺病毒表達質粒pGSadeno-BMP-2、pGSadeno-TGF-β3，線性化后轉染HEK293細胞進行包裝，獲得重組腺病毒Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3。取成年滇南小耳豬的骨髓，采用離心加貼壁法分離BMSCs，分別用基因Ad-BMP-2（A組）、Ad-TGF-β3（B組）和Ad-BMP-2+Ad-TGF-β3（C組）轉染，以未轉染細胞作為對照（D組）。采用免疫熒光、Western blot、PCR檢測目的基因和蛋白表達，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察成軟骨分化情況。 結果Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3經PCR及測序鑒定正確，帶BMP-2、TGF-β3基因的載體在HEK293細胞中包裝成功，病毒滴度分別為5.6×108、1.6×108 pfu/mL。雙基因共轉染滇南小耳豬BMSCs 72 h后，PCR示A組在310 bp處可見條帶，B組在114 bp處可見條帶，C組在310、114 bp處同時可見條帶，D組未見目的條帶表達；免疫熒光示A、B組細胞質內有分別有紅色、綠色熒光表達，C組同時表達紅色及綠色熒光，D組未見熒光表達；Western blot示A組在相對分子質量為18×103處有陽性條帶，B組在50×103處有陽性條帶，C組在18×103、50×103處同時可見條帶，D組未見目的條帶表達。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示A、B、C組呈陽性，C組染色強于A、B組，D組染色呈陰性。 結論成功構建含BMP-2和TGF-β3基因的重組腺病毒載體。Ad-BMP-2和Ad-TGF-β3雙基因聯合轉染滇南小耳豬BMSCs后目的基因和蛋白均可成功表達，并促進BMSCs成軟骨分化，可作為組織工程軟骨研究的改良種子細胞。