引用本文： 劉夕霞, 封虹宇, 梁輝, 陳啟波. 二甲雙胍對顳葉癲癇小鼠焦慮行為的影響及炎癥機制研究. 癲癇雜志, 2023, 9(2): 96-101. doi: 10.7507/2096-0247.202302002 復制
顳葉癲癇（Temporal lobe epilepsy，TLE）是癲癇中較為常見的類型，其病因復雜，臨床用藥時間長，且癥狀難以控制，常常伴發認知障礙及焦慮、抑郁等精神癥狀[1-2]。因癲癇伴發焦慮、抑郁等心理問題病因尚不明確，目前尚無有效預防及改善癲癇患者心理狀態的藥物[3]。近年來通過對動物模型及人腦組織的研究發現，自身免疫系統的激活及炎癥過程在癲癇的發生和發展中起重要作用[4]。其中，與癲癇有關的重要炎癥介質包括白細胞介素-1（Interleukin-1， IL-1）和Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）等[5]。有研究發現，癲癇發作過程中，腦內高遷移率族蛋白B1（High mobility group protein B1， HMGB1）與Toll樣受體4（Toll-like recepter 4，TLR4）結合增多，通過激活核因子-κB（Nuclear factor κappa-B，NF-κB）活性，促進多種炎癥因子基因的轉錄活性增加，從而參與到癲癇的致病過程[6]。因此，課題組猜測TLR介導的炎癥反應及NF-κB的活性可能導致是癲癇患者焦慮、抑郁等心理障礙的重要原因。
研究發現，二甲雙胍（Metformin，MET）可通過抑制NF-κB活性降低炎因子水平表達[7]，激活腺苷酸活化蛋白激酶途徑，抑制氧化應激[8]等機制發揮抗炎作用，且該藥能通過血腦屏障進入腦內[9]，這為MET對神經系統的作用提供了可能性依據。已有動物實驗研究發現，MET可能通過保護海馬組織神經元的形態，減少神經元的凋亡，改善小鼠的學習、記憶功能[10]，但MET是否對癲癇的焦慮行為產生影響，經查閱國內外文獻，目前尚未見相關報道。因此，本研究中，我們利用戊四氮（Pentylenetetrazol，PTZ）構建癲癇小鼠模型，并利用MET進行干預，通過曠場實驗（Open field test，OFT）和高架十字迷宮實驗（Elevated plus maze，EPM）檢測小鼠的焦慮狀態，最后通過免疫印跡方法檢測小鼠大腦皮層組織中TLR4和NF-κB的表達，以探討MET對癲癇小鼠焦慮情況的影響及可能的炎癥干預機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
購清潔級健康雄性8周齡C57BL/6小鼠60只，體重20～23 g。實驗過程中，給予標準飼養環境（溫度22～26℃，濕度50～60%，自然晝夜節律光照，自由飲食與活動，標準飲水及飼料）。所有動物實驗嚴格按照國家實驗動物倫理委員會的規定操作和處理動物。
將60只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（Normal）、顳葉癲癇（Temporal Lobe Epilepsy，TLE）模型對照組（TLE-con）、TLE+MET治療組（TLE-MET）、正常小鼠+MET干預組（MET-con），每組15只。
1.2 PTZ誘導建立癲癇動物模型
TLE-con和TLE-MET小鼠造模：首次給予PTZ（60 mg/kg）腹腔注射，之后隔日給予PTZ（35 mg/kg）腹腔注射重復點燃14次/28天作為頻繁發作慢性癲癇模型，每次注射后觀察30 min。首次誘導發作小鼠大約經100 s左右潛伏期后出現全身強直痙攣發作，持續幾十秒至2～3 min，按照Racine分級法[11]分級，首次PTZ發作達到IV～V級，并且在隨后的14次重復點燃中，有連續4次以上≥Ⅱ級或2次以上≥Ⅳ級的動物作為成功TLE模型納入實驗組。Normal及MET-con組小鼠給予0.9%生理鹽水同劑量隔日注射共15次/30天。
實驗動物癇性發作Racine分級法的分級標準[11]：0級：無抽搐發作，無動作行為改變；Ⅰ級：咀嚼，觸須顫動及嗅探；Ⅱ級：面部陣攣伴節律性點頭；Ⅲ級：單側前肢陣攣或抓撓動作；Ⅳ級：雙側前肢陣攣，伴站立；Ⅴ級：廣泛的肌肉收縮痙攣，伴有失平衡或跌倒。
1.3 給藥
給藥方案：首次誘導發作日視為首日（奇數日），次日（偶數日）開始PTZ重復點燃與給藥交替進行；TLE-MET治療組及MET-con組每偶數日給予MET 200 mg/（kg·d）腹腔注射，連續14次，共28天；Normal組與TLE-con組于每偶數日給予等劑量、等療程的0.9% NaCl溶液。
1.4 行為學測試
1.4.1 高架十字迷宮實驗
本實驗利用小鼠對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來考察動物的焦慮狀態。實驗裝置由兩條開放臂（50 cm×10 cm）和兩條閉合臂（50 cm×50 cm×10 cm）及中央區（10 cm×10 cm）連接而成，閉合臂屬暗環境，開放臂屬相對亮環境，裝置距離地面50 cm，裝置上方1 m處設置記錄攝像頭。操作方法：將小鼠依次從中央格面向開放臂放入，觀察、記錄5 min內的活動情況，比較各組小鼠開放臂進入次數及停留時間，閉合臂進入次數與停留時間。進入開放臂次數及停留時間與小鼠的焦慮情緒成負相關，進入開放臂次數越少，停留時間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴重。
1.4.2 曠場實驗
OFT利用動物懼怕空曠環境但又喜歡探索的心理沖突，被廣泛應用于鑒定動物焦慮心理及自主探究行為學的研究。實驗裝置由曠場反應箱和數據自動采集、處理系統兩部分組成。曠場反應箱高30～40 cm，兩底邊長100 cm，內壁涂黑，底面平均分為25個20 cm×20 cm小方格，沿四壁的16個方格稱外周格，其余的9個方格為中央格。反應箱正上方2 m處架一數碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內部。實驗人員和計算機等設備位于另一房間以減小對動物的干擾，盡量減少實驗室安靜，較少背景噪音。將小鼠依次放在中央格，觀察并記錄小鼠在10 min內的活動情況。觀察指標：比較各組小鼠在中央格（inner）停留時間以及進入中央格次數。中央格爬行停留時間和距離與小鼠的焦慮樣行為成反比，中央格停留時間越短，說明小鼠焦慮狀態越嚴重。
1.5 組織標本獲取及免疫印跡檢測
行為學測試完成后，將小鼠予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。待小鼠疼痛刺激反應消失后，斷頭取腦，冰上快速分離小鼠皮層組織，利用含有磷酸酶抑制劑的全蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）提取腦組織蛋白，并利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測各組織蛋白濃度。各樣本加入雙蒸水將濃度配平后，加入SDS溶液混勻并煮5 min使其變性，蛋白保存致?20℃冰箱中待用。
利用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）配置凝膠，依次上樣各組蛋白樣本：蛋白marker、Normal、TLE-con、TLE-MET、MET-con；90～110 v電泳槽（美國，Bio-Rad）電泳1.5 h后，取出膠并置于轉膜儀（美國，Bio-Rad）濕轉致PVDF膜，至5%的脫脂奶粉中室溫孵育1 h；利用一抗2 500倍稀釋液（TLR4（abcam，USA），NF-κB（abcam，USA）及β-actin（abcam，USA））4℃過夜孵育；PBST洗膜后，在二抗稀釋液（山羊抗兔，abcam，4 000倍）中室溫孵育1h；最后利用化學發光底物滴加于PVDF上，在ImageQuant300紫外線凝膠成像儀（美國，GE公司）中顯色并應用Image J圖像分析軟件，計算PVDF膜上條帶的光密度值。
1.6 統計學處理
應用GraphPad Prism 5軟件對實驗數據進行統計處及作圖。計量所有數據經檢驗符合正態分布后均用以均數±標準差（mean±SD）表示。實驗數據采用單因素方差分析（one way ANOVA）進行統計，進一步采用Turkey 進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 戊四氮誘導并反復點燃成功制造TLE模型
首次PTZ（60 mg/kg）腹腔注射后，TLE-con組與TLE-MET組每組15只小鼠中，各有14只小鼠約經100秒左右潛伏期后出現≥Ⅳ級全身強直陣攣發作，持續數十秒至2～3 min，并參與重復點燃刺激；各有1只小鼠發作20 min后死亡；在隨后的29天隔日腹腔注射PTZ（35 mg/kg）及MET溶液或生理鹽水交替干預治療過程中，各組小鼠全部存活；TLE-con組與TLE-MET組小鼠（n=14/組）在重復點燃刺激過程中出現連續4次以上≥Ⅱ級或2次以上≥Ⅳ級發作，作為成功TLE模型并參與EPM行為學測試，每組隨機選取10只小鼠進行了OFT測試。
2.2 行為學測試結果
2.2.1 高架十字迷宮實驗結果
經數據統計分析顯示，與Normal組相比，TLE-con組小鼠進入開放臂的時間和次數明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01），TLE-MET組與MET組均Normal組顯示未見明顯變化（P>0.05）；與TLE-con組相比，TLE-MET組小鼠位于開放臂的時間延長（P<0.05），進入開放臂的次數增多，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可明顯減少癲癇小鼠的焦慮程度（圖1）。
圖1
各組小鼠高架十字迷宮（EPM）進入開放臂的時間（A）和次數（B）比較
與Normal組相比，**
Compared with Normal group，**
2.2.2 曠場實驗結果
經數據統計分析顯示，與Normal組相比，TLE-con組小鼠在中央格區活動的時間減少，差異有統計學意義（P<0.01），且進入中央區的次數明顯減少，差異有顯著統計學意義（P<0.01）；與TLE-con組相比，TLE-MET組小鼠位于中央區的時間延長（P<0.05），進入中央區的次數增多，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可減少癲癇小鼠的焦慮程度（圖2）。
圖2
各組小鼠曠場實驗中央隔區活動時間（A）與穿越中央區次數（B）比較
與Normal組相比，**
Compared with Normal group，**
2.3 免疫印跡檢驗結果
利用Western Blot檢測TLR4與NF-κBp65表達結果顯示：與Normal組相比，TLE-con小鼠腦組織中TLR4及NF-κBp65表達均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與TLE-con組癲癇模型鼠相比，TLE-MET組癲癇小鼠經MET干預后TLR4及NF-κBp65的表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可部分改善癲癇小鼠TLR4與NF-κBp65的高表達（圖3）。
圖3
各組小鼠腦組織TLR4與NF-κBp65的表達水平
將各組小鼠腦組織等量混合后的蛋白標本進行半定量檢測（
Semi-quantitative detection were carried out （
3 討論
癲癇是由多種原因引起神經元短暫、反復異常放電導致的腦功能異常，是神經科常見的慢性臨床綜合征，其中原發性癲癇以TLE最為常見。而認知障礙、焦慮、抑郁等精神癥狀是顳葉癲癇患者的常見并發癥[12]。有研究表明，癲癇患者客觀認知功能、抑郁、焦慮與主觀記憶密切相關，抑郁和焦慮在癲癇患者客觀認知功能和主觀記憶之間起中介作用[13]，而且患者的心理狀態直接影響癲癇治療的依從性，甚至增加患者自殺、意外死亡等發生率，嚴重影響家庭穩定和社會和諧[14]。通過本次行為學研究課題組發現，在EPM試驗中，TLE模型小鼠進入開放臂的時間和次數明顯減少（P<0.01），且在曠場試驗中，TLE模型小鼠在中央格區活動的時間減少，且進入中央區的次數明顯減少（P<0.01），表明癲癇小鼠探索性減弱及對空曠區域的緊張情緒增加，焦慮行為增強。
TLR4是Toll 樣家族最早發現的一個重要的天然免疫受體，在銜接天然性免疫應答和獲得性免疫應答中發揮著重要作用[15-17]。近年來研究發現，TLR4信號通路參與癲癇相關炎癥反應，癲癇患者血清HMGB1、TLR4水平高于非癲癇患者，癲癇患者血清NF-κBp65與TLR4水平呈正相關關系[18]，為癲癇研究提供了新理論的基礎。本研究中，TLE模型小鼠腦組織中TLR4及NF-κBp65表達均明顯升高，而TLE-MET組癲癇小鼠經MET干預后TLR4及NF-κBp65的表達均明顯降低（P<0.05），提示MET干預可部分改善癲癇小鼠TLR4與NF-κBp65的高表達。
MET作為治療2型糖尿病患者的一線藥物，降糖效果好且相對副作用少。越來越多的研究發現，除增加胰島素敏感性降低血糖外，MET還具有抑制食欲、抗炎、抗腫瘤、保護血管、促進神經細胞損傷修復和再生，修復周圍神經病變等重要功效[19-20]。本研究行為學測試中，經MET干預后，小鼠位于EPM開放臂的時間延長（P<0.05），進入開放臂的次數增多，且在曠場實驗中，小鼠位于中央區的時間延長，進入中央區的次數增多（P<0.05），提示MET干預可減少癲癇小鼠的焦慮程度。本研究證實，MET改善小鼠焦慮行為的同時，改善了患者的TLR4通路及炎癥因子過表達水平。另有研究證明，MET可能通過抑制TLR4/NF-κB通路抑制CD4+幼稚T細胞向Th17細胞分化并減少中樞神經系統中Th17細胞的浸潤，從而改善腦內炎癥反應[21]。因此，我們猜測，MET改善癲癇小鼠焦慮癥狀可能通過改善腦內炎癥通路，尤其是TLR4通路實現。關于癲癇更進一步的顱內炎癥反應機制及MET在通路中發揮的具體作用則需要更進一步的科學研究。
綜上，課題組通過PTZ腹腔注射建立TLE小鼠模型，并用MET干預，發現MET可能通過影響Toll樣受體炎癥通路，從而影響NF-κB的激活，糾正炎癥因子的過度表達，從而改善癲癇小鼠的焦慮狀態，可能為預防及控制癲癇患者焦慮、抑郁等心理障礙的發生、發展提供新的靶點。MET作為多生物活性藥物，其改善參與調節心理健康狀態的機制，以及對炎癥反應的的調控機制則需要更進一步、更全面的研究。
利益沖突 所有作者無利益沖突。
顳葉癲癇（Temporal lobe epilepsy，TLE）是癲癇中較為常見的類型，其病因復雜，臨床用藥時間長，且癥狀難以控制，常常伴發認知障礙及焦慮、抑郁等精神癥狀[1-2]。因癲癇伴發焦慮、抑郁等心理問題病因尚不明確，目前尚無有效預防及改善癲癇患者心理狀態的藥物[3]。近年來通過對動物模型及人腦組織的研究發現，自身免疫系統的激活及炎癥過程在癲癇的發生和發展中起重要作用[4]。其中，與癲癇有關的重要炎癥介質包括白細胞介素-1（Interleukin-1， IL-1）和Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）等[5]。有研究發現，癲癇發作過程中，腦內高遷移率族蛋白B1（High mobility group protein B1， HMGB1）與Toll樣受體4（Toll-like recepter 4，TLR4）結合增多，通過激活核因子-κB（Nuclear factor κappa-B，NF-κB）活性，促進多種炎癥因子基因的轉錄活性增加，從而參與到癲癇的致病過程[6]。因此，課題組猜測TLR介導的炎癥反應及NF-κB的活性可能導致是癲癇患者焦慮、抑郁等心理障礙的重要原因。
研究發現，二甲雙胍（Metformin，MET）可通過抑制NF-κB活性降低炎因子水平表達[7]，激活腺苷酸活化蛋白激酶途徑，抑制氧化應激[8]等機制發揮抗炎作用，且該藥能通過血腦屏障進入腦內[9]，這為MET對神經系統的作用提供了可能性依據。已有動物實驗研究發現，MET可能通過保護海馬組織神經元的形態，減少神經元的凋亡，改善小鼠的學習、記憶功能[10]，但MET是否對癲癇的焦慮行為產生影響，經查閱國內外文獻，目前尚未見相關報道。因此，本研究中，我們利用戊四氮（Pentylenetetrazol，PTZ）構建癲癇小鼠模型，并利用MET進行干預，通過曠場實驗（Open field test，OFT）和高架十字迷宮實驗（Elevated plus maze，EPM）檢測小鼠的焦慮狀態，最后通過免疫印跡方法檢測小鼠大腦皮層組織中TLR4和NF-κB的表達，以探討MET對癲癇小鼠焦慮情況的影響及可能的炎癥干預機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
購清潔級健康雄性8周齡C57BL/6小鼠60只，體重20～23 g。實驗過程中，給予標準飼養環境（溫度22～26℃，濕度50～60%，自然晝夜節律光照，自由飲食與活動，標準飲水及飼料）。所有動物實驗嚴格按照國家實驗動物倫理委員會的規定操作和處理動物。
將60只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組（Normal）、顳葉癲癇（Temporal Lobe Epilepsy，TLE）模型對照組（TLE-con）、TLE+MET治療組（TLE-MET）、正常小鼠+MET干預組（MET-con），每組15只。
1.2 PTZ誘導建立癲癇動物模型
TLE-con和TLE-MET小鼠造模：首次給予PTZ（60 mg/kg）腹腔注射，之后隔日給予PTZ（35 mg/kg）腹腔注射重復點燃14次/28天作為頻繁發作慢性癲癇模型，每次注射后觀察30 min。首次誘導發作小鼠大約經100 s左右潛伏期后出現全身強直痙攣發作，持續幾十秒至2～3 min，按照Racine分級法[11]分級，首次PTZ發作達到IV～V級，并且在隨后的14次重復點燃中，有連續4次以上≥Ⅱ級或2次以上≥Ⅳ級的動物作為成功TLE模型納入實驗組。Normal及MET-con組小鼠給予0.9%生理鹽水同劑量隔日注射共15次/30天。
實驗動物癇性發作Racine分級法的分級標準[11]：0級：無抽搐發作，無動作行為改變；Ⅰ級：咀嚼，觸須顫動及嗅探；Ⅱ級：面部陣攣伴節律性點頭；Ⅲ級：單側前肢陣攣或抓撓動作；Ⅳ級：雙側前肢陣攣，伴站立；Ⅴ級：廣泛的肌肉收縮痙攣，伴有失平衡或跌倒。
1.3 給藥
給藥方案：首次誘導發作日視為首日（奇數日），次日（偶數日）開始PTZ重復點燃與給藥交替進行；TLE-MET治療組及MET-con組每偶數日給予MET 200 mg/（kg·d）腹腔注射，連續14次，共28天；Normal組與TLE-con組于每偶數日給予等劑量、等療程的0.9% NaCl溶液。
1.4 行為學測試
1.4.1 高架十字迷宮實驗
本實驗利用小鼠對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來考察動物的焦慮狀態。實驗裝置由兩條開放臂（50 cm×10 cm）和兩條閉合臂（50 cm×50 cm×10 cm）及中央區（10 cm×10 cm）連接而成，閉合臂屬暗環境，開放臂屬相對亮環境，裝置距離地面50 cm，裝置上方1 m處設置記錄攝像頭。操作方法：將小鼠依次從中央格面向開放臂放入，觀察、記錄5 min內的活動情況，比較各組小鼠開放臂進入次數及停留時間，閉合臂進入次數與停留時間。進入開放臂次數及停留時間與小鼠的焦慮情緒成負相關，進入開放臂次數越少，停留時間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴重。
1.4.2 曠場實驗
OFT利用動物懼怕空曠環境但又喜歡探索的心理沖突，被廣泛應用于鑒定動物焦慮心理及自主探究行為學的研究。實驗裝置由曠場反應箱和數據自動采集、處理系統兩部分組成。曠場反應箱高30～40 cm，兩底邊長100 cm，內壁涂黑，底面平均分為25個20 cm×20 cm小方格，沿四壁的16個方格稱外周格，其余的9個方格為中央格。反應箱正上方2 m處架一數碼攝像頭，其視野可覆蓋整個曠場內部。實驗人員和計算機等設備位于另一房間以減小對動物的干擾，盡量減少實驗室安靜，較少背景噪音。將小鼠依次放在中央格，觀察并記錄小鼠在10 min內的活動情況。觀察指標：比較各組小鼠在中央格（inner）停留時間以及進入中央格次數。中央格爬行停留時間和距離與小鼠的焦慮樣行為成反比，中央格停留時間越短，說明小鼠焦慮狀態越嚴重。
1.5 組織標本獲取及免疫印跡檢測
行為學測試完成后，將小鼠予10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。待小鼠疼痛刺激反應消失后，斷頭取腦，冰上快速分離小鼠皮層組織，利用含有磷酸酶抑制劑的全蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）提取腦組織蛋白，并利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）檢測各組織蛋白濃度。各樣本加入雙蒸水將濃度配平后，加入SDS溶液混勻并煮5 min使其變性，蛋白保存致?20℃冰箱中待用。
利用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）配置凝膠，依次上樣各組蛋白樣本：蛋白marker、Normal、TLE-con、TLE-MET、MET-con；90～110 v電泳槽（美國，Bio-Rad）電泳1.5 h后，取出膠并置于轉膜儀（美國，Bio-Rad）濕轉致PVDF膜，至5%的脫脂奶粉中室溫孵育1 h；利用一抗2 500倍稀釋液（TLR4（abcam，USA），NF-κB（abcam，USA）及β-actin（abcam，USA））4℃過夜孵育；PBST洗膜后，在二抗稀釋液（山羊抗兔，abcam，4 000倍）中室溫孵育1h；最后利用化學發光底物滴加于PVDF上，在ImageQuant300紫外線凝膠成像儀（美國，GE公司）中顯色并應用Image J圖像分析軟件，計算PVDF膜上條帶的光密度值。
1.6 統計學處理
應用GraphPad Prism 5軟件對實驗數據進行統計處及作圖。計量所有數據經檢驗符合正態分布后均用以均數±標準差（mean±SD）表示。實驗數據采用單因素方差分析（one way ANOVA）進行統計，進一步采用Turkey 進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 戊四氮誘導并反復點燃成功制造TLE模型
首次PTZ（60 mg/kg）腹腔注射后，TLE-con組與TLE-MET組每組15只小鼠中，各有14只小鼠約經100秒左右潛伏期后出現≥Ⅳ級全身強直陣攣發作，持續數十秒至2～3 min，并參與重復點燃刺激；各有1只小鼠發作20 min后死亡；在隨后的29天隔日腹腔注射PTZ（35 mg/kg）及MET溶液或生理鹽水交替干預治療過程中，各組小鼠全部存活；TLE-con組與TLE-MET組小鼠（n=14/組）在重復點燃刺激過程中出現連續4次以上≥Ⅱ級或2次以上≥Ⅳ級發作，作為成功TLE模型并參與EPM行為學測試，每組隨機選取10只小鼠進行了OFT測試。
2.2 行為學測試結果
2.2.1 高架十字迷宮實驗結果
經數據統計分析顯示，與Normal組相比，TLE-con組小鼠進入開放臂的時間和次數明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01），TLE-MET組與MET組均Normal組顯示未見明顯變化（P>0.05）；與TLE-con組相比，TLE-MET組小鼠位于開放臂的時間延長（P<0.05），進入開放臂的次數增多，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可明顯減少癲癇小鼠的焦慮程度（圖1）。
圖1
各組小鼠高架十字迷宮（EPM）進入開放臂的時間（A）和次數（B）比較
與Normal組相比，**
Compared with Normal group，**
2.2.2 曠場實驗結果
經數據統計分析顯示，與Normal組相比，TLE-con組小鼠在中央格區活動的時間減少，差異有統計學意義（P<0.01），且進入中央區的次數明顯減少，差異有顯著統計學意義（P<0.01）；與TLE-con組相比，TLE-MET組小鼠位于中央區的時間延長（P<0.05），進入中央區的次數增多，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可減少癲癇小鼠的焦慮程度（圖2）。
圖2
各組小鼠曠場實驗中央隔區活動時間（A）與穿越中央區次數（B）比較
與Normal組相比，**
Compared with Normal group，**
2.3 免疫印跡檢驗結果
利用Western Blot檢測TLR4與NF-κBp65表達結果顯示：與Normal組相比，TLE-con小鼠腦組織中TLR4及NF-κBp65表達均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與TLE-con組癲癇模型鼠相比，TLE-MET組癲癇小鼠經MET干預后TLR4及NF-κBp65的表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），提示MET干預可部分改善癲癇小鼠TLR4與NF-κBp65的高表達（圖3）。
圖3
各組小鼠腦組織TLR4與NF-κBp65的表達水平
將各組小鼠腦組織等量混合后的蛋白標本進行半定量檢測（
Semi-quantitative detection were carried out （
3 討論
癲癇是由多種原因引起神經元短暫、反復異常放電導致的腦功能異常，是神經科常見的慢性臨床綜合征，其中原發性癲癇以TLE最為常見。而認知障礙、焦慮、抑郁等精神癥狀是顳葉癲癇患者的常見并發癥[12]。有研究表明，癲癇患者客觀認知功能、抑郁、焦慮與主觀記憶密切相關，抑郁和焦慮在癲癇患者客觀認知功能和主觀記憶之間起中介作用[13]，而且患者的心理狀態直接影響癲癇治療的依從性，甚至增加患者自殺、意外死亡等發生率，嚴重影響家庭穩定和社會和諧[14]。通過本次行為學研究課題組發現，在EPM試驗中，TLE模型小鼠進入開放臂的時間和次數明顯減少（P<0.01），且在曠場試驗中，TLE模型小鼠在中央格區活動的時間減少，且進入中央區的次數明顯減少（P<0.01），表明癲癇小鼠探索性減弱及對空曠區域的緊張情緒增加，焦慮行為增強。
TLR4是Toll 樣家族最早發現的一個重要的天然免疫受體，在銜接天然性免疫應答和獲得性免疫應答中發揮著重要作用[15-17]。近年來研究發現，TLR4信號通路參與癲癇相關炎癥反應，癲癇患者血清HMGB1、TLR4水平高于非癲癇患者，癲癇患者血清NF-κBp65與TLR4水平呈正相關關系[18]，為癲癇研究提供了新理論的基礎。本研究中，TLE模型小鼠腦組織中TLR4及NF-κBp65表達均明顯升高，而TLE-MET組癲癇小鼠經MET干預后TLR4及NF-κBp65的表達均明顯降低（P<0.05），提示MET干預可部分改善癲癇小鼠TLR4與NF-κBp65的高表達。
MET作為治療2型糖尿病患者的一線藥物，降糖效果好且相對副作用少。越來越多的研究發現，除增加胰島素敏感性降低血糖外，MET還具有抑制食欲、抗炎、抗腫瘤、保護血管、促進神經細胞損傷修復和再生，修復周圍神經病變等重要功效[19-20]。本研究行為學測試中，經MET干預后，小鼠位于EPM開放臂的時間延長（P<0.05），進入開放臂的次數增多，且在曠場實驗中，小鼠位于中央區的時間延長，進入中央區的次數增多（P<0.05），提示MET干預可減少癲癇小鼠的焦慮程度。本研究證實，MET改善小鼠焦慮行為的同時，改善了患者的TLR4通路及炎癥因子過表達水平。另有研究證明，MET可能通過抑制TLR4/NF-κB通路抑制CD4+幼稚T細胞向Th17細胞分化并減少中樞神經系統中Th17細胞的浸潤，從而改善腦內炎癥反應[21]。因此，我們猜測，MET改善癲癇小鼠焦慮癥狀可能通過改善腦內炎癥通路，尤其是TLR4通路實現。關于癲癇更進一步的顱內炎癥反應機制及MET在通路中發揮的具體作用則需要更進一步的科學研究。
綜上，課題組通過PTZ腹腔注射建立TLE小鼠模型，并用MET干預，發現MET可能通過影響Toll樣受體炎癥通路，從而影響NF-κB的激活，糾正炎癥因子的過度表達，從而改善癲癇小鼠的焦慮狀態，可能為預防及控制癲癇患者焦慮、抑郁等心理障礙的發生、發展提供新的靶點。MET作為多生物活性藥物，其改善參與調節心理健康狀態的機制，以及對炎癥反應的的調控機制則需要更進一步、更全面的研究。
利益沖突 所有作者無利益沖突。
