耐藥癲癇的治療依然是神經科重大難題。在研究耐藥癲癇病理生理改變及篩選抗癲癇發作藥物時，所選擇的癲癇模型起到十分重要的作用。本文就近年來國內外的耐藥癲癇模型研究進展作一比較，8種耐藥癲癇的依次為：3-巰基丙酸模型、海馬海人酸模型、鋰-匹羅卡品模型、角膜點燃模型、單純杏仁核點燃模型、抗苯妥英鈉杏仁核點燃模型、苯巴比妥耐藥癲癇模型、抗拉莫三嗪杏仁核點燃模型。這些模型中，前三種為單純化學點燃模型，之后兩種主要為單純電點燃模型，最后三種為化學刺激加電點燃模型。本文文從設備條件、造模過程、成功率、耐藥評估、海馬病理改變等多方面歸納對比，以便學者根據實驗室條件和實驗目的選用合適的耐藥癲癇模型。
引用本文： 劉錢坤, 陳陽美. 耐藥癲癇動物模型的研究進展. 癲癇雜志, 2022, 8(4): 331-337. doi: 10.7507/2096-0247.202204006 復制
癲癇是神經系統常見的慢性疾病之一, 其以異常放電的腦神經元的引起的短暫大腦功能障礙為特征, 全世界約有多達7 000 萬人受其影響[1]。雖然常規抗癲癇發作藥物（Anti-seizure medications，ASMs）可以控制大部分患者的癲癇發作，但仍有大約30%的患者對藥物不耐受[2-3]。不耐受患者中僅少于1%會選擇手術治療，絕大多數依然期待藥物治療[4]。耐藥癲癇會增加患者的身心負擔而且還可能導致患者認知功能受損甚至猝死[5-6]。耐藥癲癇模型的開發應該跟疾病的病理過程息息相關，以此更好的模擬疾病的發生發展過程，進而為干預疾病打下正確的現實基礎。根據患者對ASMs的動態反應，國外有學者認為耐藥癲癇動物模型可以被定義為反復的驚厥發作對單用藥物治療不反應或反應弱，同時用到兩種及以上最大可耐受劑量的ASMs[7]。癲癇耐藥是一個亟待解決的問題，選擇正確的動物模型有助于研究的進一步展開。多種耐藥癲癇模型如表1[8-21]所示，并給予補充說明如下。
表1
多種耐藥癲癇模型的對照表
1 3-巰基丙酸模型
3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MP）模型最先被Enrique等[8]學者建立報道，旨在建立一個耐藥篩選模型，連續23天，每天一次腹腔注射給藥，通過給予MP抑制抑制性神經遞質γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）的合成，導致瑞士白化小鼠興奮性癇性發作的原理來實現。該模型簡稱為MP23模型，具有簡易的優勢，具有潛在的推廣應用價值。該模型在構建過程中第19天，小鼠的癇性發作分數為4.33±0.02，第23天變為5.66±0.02（P<0.05）。該模型于第24天檢測耐藥性，發現對苯妥英鈉有極高的耐藥性為100%，對苯巴比妥耐藥率為80%。在造模過程中總的死亡率為20%。該模型報道小鼠的耐藥特性在造模完成后至少7天內保持穩定。在具有耐藥特性的小鼠取腦區組織免疫組織化學染色發現P糖蛋白（P-gp；Mdr1）的高表達。在大腦皮層、海馬和紋狀體都可以見P糖蛋白的表達升高。P糖蛋白屬于ATP依賴的外排轉運體超家族中的一種膜蛋白，如今有研究證實了某些ASMs是作為P糖蛋白的底物而存在的[22]，也有研究表明[23]，血腦屏障上ATP依賴的外排轉運體的底物經靜脈給藥于大鼠時，可見腦組織間液和腦脊液里藥物濃度比血漿低，也有實驗證明對于P糖蛋白的底物藥物，在 Mdr1a(-/-) 大鼠腦脊液的藥物濃度比野生型大鼠的高[24]。這些結果表明，耐藥癲癇中P糖蛋白的表達上調可能加重了藥物抵抗。
2 海馬海人酸模型
海馬海人酸模型是通過單次在立體定位儀下海馬內注射海人酸，Baraban等[9,25]報道，大多數小鼠在注射后可誘發癲癇持續狀態，之后發生高度頻繁的腦電圖性癲癇發作和較少的驚厥發作。Riban等[9]在2002年報道了該模型的從海馬記錄的腦電圖癇性發作對主要的ASMs（如卡馬西平、苯妥英和丙戊酸鹽）具有抗藥性，而地西泮可以抑制這些局灶性腦電圖癇性發作。由于該模型為自發性慢性癲癇模型，再加上海馬內放電的高復發，ASMs極易地在ASMs注射后1～2 h內進行測試，也可在慢性治療期間進行測試，因此Guillemain等[26]在2012年提議該模型適合作為難以治療的局灶性癲癇發作的模型。
近年來，海馬內測海人酸模型在NMRI、瑞士、C57BL/6或FVB/N小鼠均有研究，Klein等[27]在2015年構建了這個模型，并檢查了FVB/N癲癇小鼠對ASMs的個體反應，在ASMs注射后2 h內監測視頻腦電，發現局灶性非驚厥性癲癇發作對卡馬西平和苯妥英有抗藥性，而丙戊酸鹽和左乙拉西坦具有中度、苯巴比妥和地西泮具有顯著的抗癲癇作用。而參與測試的這6種ASMs似乎都抑制了全身性抽搐發作。
3 鋰-匹羅卡品模型
該模型給予SD大鼠腹腔注射匹羅卡品讓其出現Ⅳ級及以上癲癇持續發作90 min后用10 mg/kg地西泮終止發作，將 14 d 后有自發性癲癇發作的大鼠視為造模成功，在其右側杏仁核植入電極監測腦電圖[28]。模型制作成功后記錄大鼠癲性發作頻率、持續時間和發作級別。2 周后開始行耐藥篩選，同時腹腔注射苯巴比妥（Phenobarbital，PB）[18]，30 mg/kg，2 次/d，給藥過程共持續2周并記錄癲癇發作次數和腦電圖較之前的變化，用PB后癲癇發作持續時間和發作頻率減少>50% 的為藥物敏感的大鼠，反之則為耐PB的大鼠。后面繼續用卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）進行類似篩選，判斷方法同上，對PB和CBZ均耐藥者納入耐藥組。
按許蘭等[11]的建立方法，60只SD大鼠參與造模，44只完成造模過程，癲癇發作29只，最終篩選出符合耐藥條件的12只，耐藥率12/29=41%。此種模型的病理改變如表1所述，同時具有模型穩定的特點。
也有學者用鋰-匹羅卡品制作耐苯妥英鈉的SD大鼠耐藥癲癇模型[10]，監測視頻腦電，46～60 d為基線期，61～75 d為篩選期，篩選期間給予苯妥英鈉（2次/d），76～90 d為苯妥英鈉洗脫期。根據苯妥英鈉給藥前后癲癇頻次變化篩選出苯妥英鈉耐藥模型（篩選期發作頻次較基線期降低<50%），余為苯妥英鈉不耐藥模型鼠。
4 杏仁核點燃模型
杏仁核點燃模型被唐太峰等[12]探索過，每日予SD大鼠杏仁核1次電刺激，連續3次4～5級全面發作視為點燃成功，于第二天記錄后發放電位閾值（After discharge threshold，ADT），即引起大鼠全面發作所需的最小電流強度。再進行耐藥篩選，當給予ASMs后，ADT值與未用藥時相比增加不超過20%視為耐藥癲癇鼠。1次/周，先用苯妥英鈉篩選，篩選期3周，再用同樣方法用PB篩選，最終滿足對兩種藥物耐藥即表示此模型的造模成功。
該模型的建立需要立體定位儀，BL-420F生物機能系統等設備，在唐太峰等學者的研究中，該模型成功點燃需要3～30 d，在點燃過程中，除去死亡和電極脫落的數量，點燃成功率為24/47（51%），最終通過耐藥篩選出7只（7/24=29%）耐藥癲癇模型。該模型具有穩定的優點，又符合臨床上對耐藥癲癇的定義，能較好地模擬癲癇的病理改變。有學者就把杏仁核點燃模型和鋰-匹羅卡品模型兩種耐藥癲癇模型的大鼠海馬區的病理改變做了一次比較，發現兩者在海馬神經元壞死方面無明顯差異，但匹羅卡品敏感組和耐藥組的苔蘚纖維發芽均較杏仁核模型明顯加重[11]。但關于苔蘚纖維發芽是否促進癲癇發生，不同學者對此持不同意見。
5 角膜點燃模型
6 Hz模型通過角膜電刺激造模，于上世紀50年代提出，由于該模型在癲癇發作形式和腦電圖模式上與精神運動性癲癇在臨床發生是的表現相似，Toman 等[29]將其作為精神運動性癲癇發作模型。近10年來，6 Hz模型已更多地應用于ASMs篩選[30]。6 Hz模型小鼠有異常的行為表型，小鼠極度活躍，不會產生類似焦慮的行為，但快感缺失，有社交障礙，學習和記憶能力也受到嚴重損害。因此，6 Hz模型可被用來研究癲癇的嚴重并發癥[31]，其致癇機制的文獻在近5年比較多。6 Hz模型制作簡單，周期短，點燃后腦內異常癇性放電持續時間長。與化學點燃模型相比，電點燃可避免外來物質的相互作用對后續實驗的影響，并且有助于發作閾值的測定。但是，6 Hz模型作為一種急性模型，不能很好的模擬耐藥癲癇形成過程中的神經網絡和神經細胞的改變[32]。慢性癲癇發作的模型也往往是高度勞動強度和資源密集型的，因此不適合于早期評估大規模化學庫的中等至高等通量藥物發現。
60 Hz角膜點燃模型（Corneally kindled model，CKM）是一種中等通量的繼發性局灶性驚厥模型，在技術上可行且危害小[33]。該模型經常用于前線藥物評估，盡管最小的藥物抵抗但表現出與海馬點燃的大鼠相一致的藥理學變化[34-35]。2015年美國國家神經疾病和卒中研究所癲癇治療篩查計劃甚至將60 Hz CKM優先用于初步鑒定抗驚厥效果并可反復評估[36-37]。此外，60 Hz CKM表現出行為共存病[36,38]和病理生理學改變[39]，例如記憶缺陷和星形膠質細胞增生。近4年有Koneval Z等[40]建立了耐拉莫三嗪60 Hz角膜快速點燃小鼠模型，于角膜刺激30 min前給予拉莫三嗪，每天兩次直至點燃，判斷標準為引發持續5級發作。然后隔一天刺激一次，而其他小鼠仍然2次/d直至點燃。該種拉莫三嗪耐藥的角膜點燃模型也對卡馬西平、瑞替加濱和丙戊酸耐藥。
6 6Hz改良角膜點燃模型
該模型由浙江中醫藥大學陸美海等[13]優化，是相對于其他小鼠品系的改良，采用8周齡C57BL/6J小鼠在電驚厥儀刺激下行角膜點燃（44 mA，0.2 ms，3 s，6 Hz）, 連續3周，2次/d，兩次間隔>4 h，可見顳葉膠質細胞增生的病理改變，該研究發現該模型對3種ASMs（苯妥英鈉、丙戊酸鈉、拉莫三嗪）和2種中藥方劑（柴胡加龍骨牡蠣湯、天麻鉤藤飲）存在一定耐藥性。但中藥風引湯卻可以降低改良的6 Hz模型的發作級別和大發作概率。可見耐藥癲癇模型仍然存在可控制發作的藥物。
7 抗苯妥英鈉杏仁核點燃模型
Goddard等[41]學者提出了最原始的杏仁核點燃模型，在點燃模型中發現，局灶性癲癇發作階段對ASMs的反應遠低于繼發的全身癲癇發作，跟臨床上表現一致。后來有學者發現，被完全點燃的200多只大鼠的平均數據顯示對苯妥英鈉的敏感性分為三種：16%對苯妥英鈉（或其前藥福苯妥英鈉）有一致的抗癲癇反應、23%無抗癲癇反應、61%有不同的反應[42-43]。其中無抗癲癇反應的一組被認為是代表了臨床上藥物難治性癲癇。L?scher等[44]曾發現除左乙拉西坦外，所有被檢測的ASMs在苯妥英鈉無反應者中顯著降低或根本無效，這表明點燃的Wistar大鼠的苯妥英鈉耐藥可擴展到其他ASMs。T?llner等[45]證明耐苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠中丙戊酸鹽抗癲癇反應與其對黑質網狀結構（Substantia Nigra Pars Reticulata，SNr）GABA能神經元放電頻率和模式的影響存在相關性。黑質網狀結構是一個主要的基底神經節輸出結構，涉及癲癇的傳播，癲癇控制，和癲癇誘導的神經可塑性。這些數據證明了SNr參與了藥物抵抗性癲癇，并強調了基底神經節作為新的治療選擇的靶結構的相關性。
8 抗苯巴比妥杏仁核點燃模型
該種模型通過電刺激基底外側杏仁核，約在1個月后產生慢性自發性癲癇模型[46-47]，在此模型上進行視頻腦電監測，給予最大耐受劑量的PB，歷經基線期（給藥前2周），干預期（2周），洗脫期（2周），再根據給藥前后癲癇發作頻率差異判斷大鼠對PB是否反應，發作持續時間和頻率減少<50%可以認為對PB耐藥。在Brandt等[47-49]的三項獨立的前瞻性研究中，約40%的大鼠對PB的治療具有耐藥性，證明了該模型的重現性。其中一項研究表明對PB耐藥的大鼠有83%的概率也對苯妥英鈉耐藥。也有研究表明，PB-無應答者的平均發作頻率顯著高于應答者[50]，這與臨床經驗一致，即癲癇早期發作頻率是預測難治性的主要危險因素之一[51-52]。然而，對治療的抗藥性也發生在與應答者在發作頻率上無差異的大鼠身上，這表明僅疾病嚴重程度不足以解釋ASMs耐藥性[52]。除了平均發作頻率的差異外，Gastens等[53]還發現PB-無應答者在行為和認知改變方面與應答者不同。此外，大多數（90%）的PB-無反應答者表現出海馬損傷，而這種損傷僅在7%的應答者中確定，因此海馬神經元丟失，特別是在齒狀回中，是PB耐藥大鼠的一個特征[19-20]。同樣，L?scher等[54]在大鼠模型中的這些觀察與臨床經驗是一致的，因為精神疾病和海馬硬化癥是ASMs抵抗的預測因子。除了海馬損傷外，PB-無應答者與應答者相比，在癲癇灶中外排轉運體P-gp的腦表達增加[18]。 此外，GABAA受體的亞基表達和結合特性在無應答者中發生了改變[19-20]，這可能與PB耐藥有關，因為這種藥物主要作用于GABAA受體[55]。由此可見，PB耐藥大鼠模型對于新藥的篩選或有目標的耐藥機制假設驗證具有較好地適應性。
9 抗拉莫三嗪杏仁核點燃模型
抗拉莫三嗪杏仁核點燃模型是通過在杏仁核電刺激前給予低劑量的拉莫三嗪，從而產生對拉莫三嗪甚至其他ASMs的藥物抵抗。此種模型被美國用到癲癇治療篩查方案中。2019年Metcalf等[21]用這種模型測試了一系列ASMs，最后得出五種鈉通道阻滯劑（醋酸艾司利卡西平、拉科酰胺、拉莫三嗪、苯妥英鈉和盧非酰胺）在本模型中要么無效，要么不耐受的劑量下有效。相反，針對GABA受體（氯巴占、氯硝西泮、PB）或GABA攝取蛋白（噻加賓）的藥物對驚厥發作具有劑量依賴性的療效。作用于調節Ca2+通道的藥物表現出差異活性：乙琥胺無效，而加巴噴丁則中等有效。依佐加濱和丙戊酸鹽也是高度有效的，而托吡酯和左乙拉西坦在試驗劑量下無效。
該模型使用的是SD大鼠，每天接受腹腔注射拉莫三嗪（5 mg/kg，0.04 mL/10g）。在拉莫三嗪給藥后1 h，動物通過拴系電極（塑料）連接到Biopac MP100系統，給予閾下電刺激200 μA，50 Hz，2 s（5 d/周，3～4周），記錄基線和刺激后腦電圖（Electroencephalogram，EEG）。直到大鼠發生4分及以上發作連續4次或5次即可認為全面點燃。兩天后，給予大鼠拉莫三嗪（30 mg/kg，靜脈注射）進行耐藥篩選。在電刺激前給予ASMs，根據癲癇發作分數和后發放電位持續時間與之前比較有無顯著性差異來判斷耐藥與否。在參與實驗的大鼠行為發作按Racine量表評分[56-57]，行為發作評分為0~2的動物被認為是“受保護的”[58-60]。
10 小結與展望
綜上，以上模型都存在一個共性—所有模型的耐藥表現為至少對兩種ASMs抵抗，其中對鈉離子通道阻滯劑耐藥有高重復率。病理改變以P-gp的高表達具有高重復率。6 Hz點燃模型和MP23模型為造模和監測相對簡單的急性癲癇發作模型，其余為成功率相對低的高強度勞動和資金密集型的慢性癲癇發作模型。雖然如今存在這么多可供選擇的耐藥癲癇動物模型，但是以上任何一種動物模型，除了疾病的某方面都不能完全復制人體的疾病過程。在今后的科研過程中，從各類模型中根據現有條件和需求選擇合適的、能夠說明問題的模型是一門學問。盡管新藥的開發達到了20多種，但癲癇耐藥率幾乎一直持續在30%左右，有待改善，這就不得不值得反思，致力于耐藥機制的研究和新藥的開發，需要思考臨床前研究有無缺陷，其中動物模型的使用和結果對于填補臨床轉化的空白至關重要。此外，模型的選擇亦或構建是關鍵，可以為今后的耐藥機制和新藥開發提供有效借鑒。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
癲癇是神經系統常見的慢性疾病之一, 其以異常放電的腦神經元的引起的短暫大腦功能障礙為特征, 全世界約有多達7 000 萬人受其影響[1]。雖然常規抗癲癇發作藥物（Anti-seizure medications，ASMs）可以控制大部分患者的癲癇發作，但仍有大約30%的患者對藥物不耐受[2-3]。不耐受患者中僅少于1%會選擇手術治療，絕大多數依然期待藥物治療[4]。耐藥癲癇會增加患者的身心負擔而且還可能導致患者認知功能受損甚至猝死[5-6]。耐藥癲癇模型的開發應該跟疾病的病理過程息息相關，以此更好的模擬疾病的發生發展過程，進而為干預疾病打下正確的現實基礎。根據患者對ASMs的動態反應，國外有學者認為耐藥癲癇動物模型可以被定義為反復的驚厥發作對單用藥物治療不反應或反應弱，同時用到兩種及以上最大可耐受劑量的ASMs[7]。癲癇耐藥是一個亟待解決的問題，選擇正確的動物模型有助于研究的進一步展開。多種耐藥癲癇模型如表1[8-21]所示，并給予補充說明如下。
表1
多種耐藥癲癇模型的對照表
1 3-巰基丙酸模型
3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MP）模型最先被Enrique等[8]學者建立報道，旨在建立一個耐藥篩選模型，連續23天，每天一次腹腔注射給藥，通過給予MP抑制抑制性神經遞質γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）的合成，導致瑞士白化小鼠興奮性癇性發作的原理來實現。該模型簡稱為MP23模型，具有簡易的優勢，具有潛在的推廣應用價值。該模型在構建過程中第19天，小鼠的癇性發作分數為4.33±0.02，第23天變為5.66±0.02（P<0.05）。該模型于第24天檢測耐藥性，發現對苯妥英鈉有極高的耐藥性為100%，對苯巴比妥耐藥率為80%。在造模過程中總的死亡率為20%。該模型報道小鼠的耐藥特性在造模完成后至少7天內保持穩定。在具有耐藥特性的小鼠取腦區組織免疫組織化學染色發現P糖蛋白（P-gp；Mdr1）的高表達。在大腦皮層、海馬和紋狀體都可以見P糖蛋白的表達升高。P糖蛋白屬于ATP依賴的外排轉運體超家族中的一種膜蛋白，如今有研究證實了某些ASMs是作為P糖蛋白的底物而存在的[22]，也有研究表明[23]，血腦屏障上ATP依賴的外排轉運體的底物經靜脈給藥于大鼠時，可見腦組織間液和腦脊液里藥物濃度比血漿低，也有實驗證明對于P糖蛋白的底物藥物，在 Mdr1a(-/-) 大鼠腦脊液的藥物濃度比野生型大鼠的高[24]。這些結果表明，耐藥癲癇中P糖蛋白的表達上調可能加重了藥物抵抗。
2 海馬海人酸模型
海馬海人酸模型是通過單次在立體定位儀下海馬內注射海人酸，Baraban等[9,25]報道，大多數小鼠在注射后可誘發癲癇持續狀態，之后發生高度頻繁的腦電圖性癲癇發作和較少的驚厥發作。Riban等[9]在2002年報道了該模型的從海馬記錄的腦電圖癇性發作對主要的ASMs（如卡馬西平、苯妥英和丙戊酸鹽）具有抗藥性，而地西泮可以抑制這些局灶性腦電圖癇性發作。由于該模型為自發性慢性癲癇模型，再加上海馬內放電的高復發，ASMs極易地在ASMs注射后1～2 h內進行測試，也可在慢性治療期間進行測試，因此Guillemain等[26]在2012年提議該模型適合作為難以治療的局灶性癲癇發作的模型。
近年來，海馬內測海人酸模型在NMRI、瑞士、C57BL/6或FVB/N小鼠均有研究，Klein等[27]在2015年構建了這個模型，并檢查了FVB/N癲癇小鼠對ASMs的個體反應，在ASMs注射后2 h內監測視頻腦電，發現局灶性非驚厥性癲癇發作對卡馬西平和苯妥英有抗藥性，而丙戊酸鹽和左乙拉西坦具有中度、苯巴比妥和地西泮具有顯著的抗癲癇作用。而參與測試的這6種ASMs似乎都抑制了全身性抽搐發作。
3 鋰-匹羅卡品模型
該模型給予SD大鼠腹腔注射匹羅卡品讓其出現Ⅳ級及以上癲癇持續發作90 min后用10 mg/kg地西泮終止發作，將 14 d 后有自發性癲癇發作的大鼠視為造模成功，在其右側杏仁核植入電極監測腦電圖[28]。模型制作成功后記錄大鼠癲性發作頻率、持續時間和發作級別。2 周后開始行耐藥篩選，同時腹腔注射苯巴比妥（Phenobarbital，PB）[18]，30 mg/kg，2 次/d，給藥過程共持續2周并記錄癲癇發作次數和腦電圖較之前的變化，用PB后癲癇發作持續時間和發作頻率減少>50% 的為藥物敏感的大鼠，反之則為耐PB的大鼠。后面繼續用卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）進行類似篩選，判斷方法同上，對PB和CBZ均耐藥者納入耐藥組。
按許蘭等[11]的建立方法，60只SD大鼠參與造模，44只完成造模過程，癲癇發作29只，最終篩選出符合耐藥條件的12只，耐藥率12/29=41%。此種模型的病理改變如表1所述，同時具有模型穩定的特點。
也有學者用鋰-匹羅卡品制作耐苯妥英鈉的SD大鼠耐藥癲癇模型[10]，監測視頻腦電，46～60 d為基線期，61～75 d為篩選期，篩選期間給予苯妥英鈉（2次/d），76～90 d為苯妥英鈉洗脫期。根據苯妥英鈉給藥前后癲癇頻次變化篩選出苯妥英鈉耐藥模型（篩選期發作頻次較基線期降低<50%），余為苯妥英鈉不耐藥模型鼠。
4 杏仁核點燃模型
杏仁核點燃模型被唐太峰等[12]探索過，每日予SD大鼠杏仁核1次電刺激，連續3次4～5級全面發作視為點燃成功，于第二天記錄后發放電位閾值（After discharge threshold，ADT），即引起大鼠全面發作所需的最小電流強度。再進行耐藥篩選，當給予ASMs后，ADT值與未用藥時相比增加不超過20%視為耐藥癲癇鼠。1次/周，先用苯妥英鈉篩選，篩選期3周，再用同樣方法用PB篩選，最終滿足對兩種藥物耐藥即表示此模型的造模成功。
該模型的建立需要立體定位儀，BL-420F生物機能系統等設備，在唐太峰等學者的研究中，該模型成功點燃需要3～30 d，在點燃過程中，除去死亡和電極脫落的數量，點燃成功率為24/47（51%），最終通過耐藥篩選出7只（7/24=29%）耐藥癲癇模型。該模型具有穩定的優點，又符合臨床上對耐藥癲癇的定義，能較好地模擬癲癇的病理改變。有學者就把杏仁核點燃模型和鋰-匹羅卡品模型兩種耐藥癲癇模型的大鼠海馬區的病理改變做了一次比較，發現兩者在海馬神經元壞死方面無明顯差異，但匹羅卡品敏感組和耐藥組的苔蘚纖維發芽均較杏仁核模型明顯加重[11]。但關于苔蘚纖維發芽是否促進癲癇發生，不同學者對此持不同意見。
5 角膜點燃模型
6 Hz模型通過角膜電刺激造模，于上世紀50年代提出，由于該模型在癲癇發作形式和腦電圖模式上與精神運動性癲癇在臨床發生是的表現相似，Toman 等[29]將其作為精神運動性癲癇發作模型。近10年來，6 Hz模型已更多地應用于ASMs篩選[30]。6 Hz模型小鼠有異常的行為表型，小鼠極度活躍，不會產生類似焦慮的行為，但快感缺失，有社交障礙，學習和記憶能力也受到嚴重損害。因此，6 Hz模型可被用來研究癲癇的嚴重并發癥[31]，其致癇機制的文獻在近5年比較多。6 Hz模型制作簡單，周期短，點燃后腦內異常癇性放電持續時間長。與化學點燃模型相比，電點燃可避免外來物質的相互作用對后續實驗的影響，并且有助于發作閾值的測定。但是，6 Hz模型作為一種急性模型，不能很好的模擬耐藥癲癇形成過程中的神經網絡和神經細胞的改變[32]。慢性癲癇發作的模型也往往是高度勞動強度和資源密集型的，因此不適合于早期評估大規模化學庫的中等至高等通量藥物發現。
60 Hz角膜點燃模型（Corneally kindled model，CKM）是一種中等通量的繼發性局灶性驚厥模型，在技術上可行且危害小[33]。該模型經常用于前線藥物評估，盡管最小的藥物抵抗但表現出與海馬點燃的大鼠相一致的藥理學變化[34-35]。2015年美國國家神經疾病和卒中研究所癲癇治療篩查計劃甚至將60 Hz CKM優先用于初步鑒定抗驚厥效果并可反復評估[36-37]。此外，60 Hz CKM表現出行為共存病[36,38]和病理生理學改變[39]，例如記憶缺陷和星形膠質細胞增生。近4年有Koneval Z等[40]建立了耐拉莫三嗪60 Hz角膜快速點燃小鼠模型，于角膜刺激30 min前給予拉莫三嗪，每天兩次直至點燃，判斷標準為引發持續5級發作。然后隔一天刺激一次，而其他小鼠仍然2次/d直至點燃。該種拉莫三嗪耐藥的角膜點燃模型也對卡馬西平、瑞替加濱和丙戊酸耐藥。
6 6Hz改良角膜點燃模型
該模型由浙江中醫藥大學陸美海等[13]優化，是相對于其他小鼠品系的改良，采用8周齡C57BL/6J小鼠在電驚厥儀刺激下行角膜點燃（44 mA，0.2 ms，3 s，6 Hz）, 連續3周，2次/d，兩次間隔>4 h，可見顳葉膠質細胞增生的病理改變，該研究發現該模型對3種ASMs（苯妥英鈉、丙戊酸鈉、拉莫三嗪）和2種中藥方劑（柴胡加龍骨牡蠣湯、天麻鉤藤飲）存在一定耐藥性。但中藥風引湯卻可以降低改良的6 Hz模型的發作級別和大發作概率。可見耐藥癲癇模型仍然存在可控制發作的藥物。
7 抗苯妥英鈉杏仁核點燃模型
Goddard等[41]學者提出了最原始的杏仁核點燃模型，在點燃模型中發現，局灶性癲癇發作階段對ASMs的反應遠低于繼發的全身癲癇發作，跟臨床上表現一致。后來有學者發現，被完全點燃的200多只大鼠的平均數據顯示對苯妥英鈉的敏感性分為三種：16%對苯妥英鈉（或其前藥福苯妥英鈉）有一致的抗癲癇反應、23%無抗癲癇反應、61%有不同的反應[42-43]。其中無抗癲癇反應的一組被認為是代表了臨床上藥物難治性癲癇。L?scher等[44]曾發現除左乙拉西坦外，所有被檢測的ASMs在苯妥英鈉無反應者中顯著降低或根本無效，這表明點燃的Wistar大鼠的苯妥英鈉耐藥可擴展到其他ASMs。T?llner等[45]證明耐苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠中丙戊酸鹽抗癲癇反應與其對黑質網狀結構（Substantia Nigra Pars Reticulata，SNr）GABA能神經元放電頻率和模式的影響存在相關性。黑質網狀結構是一個主要的基底神經節輸出結構，涉及癲癇的傳播，癲癇控制，和癲癇誘導的神經可塑性。這些數據證明了SNr參與了藥物抵抗性癲癇，并強調了基底神經節作為新的治療選擇的靶結構的相關性。
8 抗苯巴比妥杏仁核點燃模型
該種模型通過電刺激基底外側杏仁核，約在1個月后產生慢性自發性癲癇模型[46-47]，在此模型上進行視頻腦電監測，給予最大耐受劑量的PB，歷經基線期（給藥前2周），干預期（2周），洗脫期（2周），再根據給藥前后癲癇發作頻率差異判斷大鼠對PB是否反應，發作持續時間和頻率減少<50%可以認為對PB耐藥。在Brandt等[47-49]的三項獨立的前瞻性研究中，約40%的大鼠對PB的治療具有耐藥性，證明了該模型的重現性。其中一項研究表明對PB耐藥的大鼠有83%的概率也對苯妥英鈉耐藥。也有研究表明，PB-無應答者的平均發作頻率顯著高于應答者[50]，這與臨床經驗一致，即癲癇早期發作頻率是預測難治性的主要危險因素之一[51-52]。然而，對治療的抗藥性也發生在與應答者在發作頻率上無差異的大鼠身上，這表明僅疾病嚴重程度不足以解釋ASMs耐藥性[52]。除了平均發作頻率的差異外，Gastens等[53]還發現PB-無應答者在行為和認知改變方面與應答者不同。此外，大多數（90%）的PB-無反應答者表現出海馬損傷，而這種損傷僅在7%的應答者中確定，因此海馬神經元丟失，特別是在齒狀回中，是PB耐藥大鼠的一個特征[19-20]。同樣，L?scher等[54]在大鼠模型中的這些觀察與臨床經驗是一致的，因為精神疾病和海馬硬化癥是ASMs抵抗的預測因子。除了海馬損傷外，PB-無應答者與應答者相比，在癲癇灶中外排轉運體P-gp的腦表達增加[18]。 此外，GABAA受體的亞基表達和結合特性在無應答者中發生了改變[19-20]，這可能與PB耐藥有關，因為這種藥物主要作用于GABAA受體[55]。由此可見，PB耐藥大鼠模型對于新藥的篩選或有目標的耐藥機制假設驗證具有較好地適應性。
9 抗拉莫三嗪杏仁核點燃模型
抗拉莫三嗪杏仁核點燃模型是通過在杏仁核電刺激前給予低劑量的拉莫三嗪，從而產生對拉莫三嗪甚至其他ASMs的藥物抵抗。此種模型被美國用到癲癇治療篩查方案中。2019年Metcalf等[21]用這種模型測試了一系列ASMs，最后得出五種鈉通道阻滯劑（醋酸艾司利卡西平、拉科酰胺、拉莫三嗪、苯妥英鈉和盧非酰胺）在本模型中要么無效，要么不耐受的劑量下有效。相反，針對GABA受體（氯巴占、氯硝西泮、PB）或GABA攝取蛋白（噻加賓）的藥物對驚厥發作具有劑量依賴性的療效。作用于調節Ca2+通道的藥物表現出差異活性：乙琥胺無效，而加巴噴丁則中等有效。依佐加濱和丙戊酸鹽也是高度有效的，而托吡酯和左乙拉西坦在試驗劑量下無效。
該模型使用的是SD大鼠，每天接受腹腔注射拉莫三嗪（5 mg/kg，0.04 mL/10g）。在拉莫三嗪給藥后1 h，動物通過拴系電極（塑料）連接到Biopac MP100系統，給予閾下電刺激200 μA，50 Hz，2 s（5 d/周，3～4周），記錄基線和刺激后腦電圖（Electroencephalogram，EEG）。直到大鼠發生4分及以上發作連續4次或5次即可認為全面點燃。兩天后，給予大鼠拉莫三嗪（30 mg/kg，靜脈注射）進行耐藥篩選。在電刺激前給予ASMs，根據癲癇發作分數和后發放電位持續時間與之前比較有無顯著性差異來判斷耐藥與否。在參與實驗的大鼠行為發作按Racine量表評分[56-57]，行為發作評分為0~2的動物被認為是“受保護的”[58-60]。
10 小結與展望
綜上，以上模型都存在一個共性—所有模型的耐藥表現為至少對兩種ASMs抵抗，其中對鈉離子通道阻滯劑耐藥有高重復率。病理改變以P-gp的高表達具有高重復率。6 Hz點燃模型和MP23模型為造模和監測相對簡單的急性癲癇發作模型，其余為成功率相對低的高強度勞動和資金密集型的慢性癲癇發作模型。雖然如今存在這么多可供選擇的耐藥癲癇動物模型，但是以上任何一種動物模型，除了疾病的某方面都不能完全復制人體的疾病過程。在今后的科研過程中，從各類模型中根據現有條件和需求選擇合適的、能夠說明問題的模型是一門學問。盡管新藥的開發達到了20多種，但癲癇耐藥率幾乎一直持續在30%左右，有待改善，這就不得不值得反思，致力于耐藥機制的研究和新藥的開發，需要思考臨床前研究有無缺陷，其中動物模型的使用和結果對于填補臨床轉化的空白至關重要。此外，模型的選擇亦或構建是關鍵，可以為今后的耐藥機制和新藥開發提供有效借鑒。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
