癲癇是一種神經系統慢性疾病，給家庭和社會帶來沉重的經濟及照護負擔，其發病機制復雜，且約1/3的癲癇患者對藥物治療不敏感，發現一種可以診斷及治療的分子標志物勢在必行。近年來人們對環狀RNA（circular RNA，circRNA）的研究越來越多，其作為非編碼RNA的重要成員，可作為調控工具、生物標志物、治療靶點，分別為癲癇的病理生理研究、診斷、治療提供新的指導和方向。本綜述結合國內外相關報道，旨在闡述circRNA相關功能、特性及其與癲癇相關性，為進一步研究circRNA與癲癇提供理論依據。
引用本文： 張舒雅, 孫洪英. 癲癇中環狀RNA的研究現狀. 癲癇雜志, 2022, 8(2): 155-158. doi: 10.7507/2096-0247.202111014 復制
癲癇是顱內神經元高同步異常放電所致的神經系統功能障礙性疾病，影響全球7 000多萬人，且80%以上在中低收入國家[ 1]。其發病機制復雜，涉及神經遞質學、異常網絡、離子通道、遺傳、免疫等學說。盡管越來越多的研究探索了癲癇的發病機制，但確定的癲癇致病因素和發病機制仍然缺乏[2]。
環狀RNA（Circular RNAs，circRNA）是一種非編碼RNA，由線性轉錄本通過反向剪接產生，可作為蛋白樣調控因子、轉錄因子和微小核糖核酸（MicroRNAs，miRNAs）海綿發揮作用[3]。隨著高通量測序和生物信息學工具的發展，科學家發現circRNA是人類轉錄組的一個普遍特征，在許多其他動物中無處不在[4]。circRNA的獨特結構讓其具有比線性核糖核酸更長的半衰期和更強的核糖核酸酶（Ribonuclease，RNAse）抗性[5]，這使得它們有望成為診斷和治療的生物標志物及靶點。大量研究揭示了它們獨特的表達特征和在多種疾病中的重要生物學作用，如惡性腫瘤[6]、心血管疾病[7]、神經系統疾病[8]和自身免疫性疾病[9]。
1 circRNA 概述
1.1 circRNA結構
circRNA是一種不同于線性RNA的新型非編碼RNA，起源于前體- mRNA轉錄本的反向剪接，沒有3' 尾端（polo A結構）和5' '端帽子結構的，通過共價鍵連接形成閉環結構[10]。
1.2 circRNA特點
circRNA通常被認為是豐富、穩定、保守和特異性表達的分子，存在于真核生物中。
1.2.1 豐富性
circRNA的豐富性一直是人們關注的焦點。Salzman等[11]通過RNA測序在癌細胞和正常細胞中發現大量環形轉錄副本，10%以上的人類基因可以轉錄產生circRNA,該數據與典型的線性轉錄副本基本相當。Jeck等[10]利用高通量測序方法發現，在人類成纖維細胞中超過25 000種環狀RNA，比它們相關的線性mRNA高出>10倍。
1.2.2 穩定性
對于理想的生物標志物來說，穩定5' 端帽子結構的共價環，circRNA可以逃避去腺苷化和去帽化。此外，circRNA對性是測試結果可靠性和可重復性的關鍵屬性。作為一個缺乏3' 多聚腺苷酸尾和核糖核酸外切酶（Ribonuclease R ，RNase R，3’-5’核糖核酸外切酶）具有高度抗性，RNAseR是一種消化幾乎所有的線性RNA的核酸外切酶。circRNAs在細胞中的平均半衰期超過48 h[10]，比mRNAs的平均10 h長得多[12]。
除了血液，circRNA也可以在唾液和精漿等其他體液中檢測到[13]。盡管唾液中的核酸外切酶活性很高，circRNA可以通過摻入大分子或封裝在唾液中的外泌體中防止降解[14]。研究發現，在室溫下，circRNA在采集24 h后的無細胞的精液內幾乎不會降解[15]。這表明circRNA可以作為男性生殖疾病的良好生物標志物。綜上，這些數據表明環狀RNA極具穩定性，更有潛力作為生物標志物。
1.2.3 保守性
作為RNA家族的新成員，circRNA的保守性仍有爭議。一些研究聲稱circRNAs是進化上非常保守的分子[10]，而另一些研究認為它們是物種特異性[16]。我們總結了一些可能與它們的保守程度相關的因素：circRNA的類型、表達水平、起源組織和物種間的進化距離。保守性的差異還來自許多其他混雜因素，包括檢查的不同組織類型或使用的不同生物信息學方法。然而，不管在什么情況下，在人類和嚙齒類動物中確實存在相當數量的精確位于同源位置的circRNA[12]。對于這些circRNA，嚙齒動物可以作為實驗研究的合適模式生物。此外，這些在漫長的進化過程中一直保持保守的circRNA可能具有重要的功能，因此具有更大的研究價值。
1.2.4 特異性
circRNA具有作為各種疾病特定的生物標志物參與特定細胞類型或特定病理條件下的生物過程的特異性。研究表明，circRNA的類型和豐度在不同組織和細胞中及其不同發育階段均有所不同[11]。經確定，人類成人中11.9%的circRNA、人類胎兒中10.4%的circRNA和小鼠中34.3%的circRNA是組織特異性的[17]。
1.3 circRNA功能
1.3.1 miRNA 分子海綿
一些circRNA包含miRNA響應元件，并可以與miRNA作為miRNA海綿相互作用[3]，阻止mi RAN在3 '非翻譯區與信使RNA（Messenger RNA，mRNA)相互作用。最近收集的證據表明，circRNA參與了miRNA表達水平的微調控。circRNAs通過與miRNAs競爭結合，從而干擾了miRNA對靶mRNA的抑制功能，進而調控靶基因的表達[18]。此外，circRNAs-miRNAs的相互作用是僅用于隔離miRNAs還是超出了這一功能，目前仍不清楚。
1.3.2 調控蛋白結合
部分circ RNA 可與蛋白質相互作用，參與基因的表達調控。如正常情況下，細胞周期蛋白依賴性激酶 2（Cyclin dependent kinase 2，CDK2）與細胞周期蛋白結合推動細胞周期進程，而 circ-Foxo3 可與 CDK2、p21 結合形成 circ-Foxo3-p21-CDK2 三 元復合物，阻礙 CDK2 的功能，從而阻滯了細胞周期運行[19]。Abdelmohsen 等[8]研究發現， circ PABPN1 可抑制 RNA 結合蛋白 HUR 與核內 poly(A)結合蛋白 1（PABPN1）mRNA 的 結合，降低 PABPN1 mRNA 表達水平。
1.3.3 調控基因轉錄
雖然大多數circRNA可以在細胞質中找到，但這些物種的一部分被運輸到細胞核中，在某些情況下，circRNA在細胞核中通過增強其親本基因的表達，發揮功能。已有研究表明，外顯子-內含子型circRNA和內含子型circRNA的成員與轉錄機制相互作用，并調節全范圍的基因表達[20]。
1.3.4 編碼功能
根據我們的傳統觀點，5’端和3’端是真核細胞翻譯起始的基本要素。由于缺少5’端和3’端，circRNA一度被認為是非編碼核糖核酸。最近，越來越多的證據表明，circRNA可以與多聚體相關聯，其中一些包含起始密碼子AUG和具有適當長度的公認的開放閱讀框，這表明circRNA具有意想不到的蛋白質編碼潛力[21]。
2 癲癇發病機制
癲癇發病機制復雜，癲癇的發生發展與神經遞質學、異常網絡、離子通道、遺傳、免疫等關系密切，大致為以下三種學說。
2.1 神經遞質學說
前期已有許多研究證明癲癇的發生與腦部抑制性和興奮性神經遞質的失衡有關。大量證據支持抑制性神經遞質γ-氨基丁酸和興奮性神經遞質谷氨酸信號異常在癲癇發病機制中起重要作用,同時也有乙酰膽堿、P物質、一氧化氮、大麻素和腺苷等神經化學物質的參與[22]。
2.2 異常網絡學說
有研究表明，癲癇是一種網絡障礙疾病，研究者運用靜息狀態連接圖理論分析顳葉癲癇神經網絡的功能變化，證明癲癇患者組和健康對照組的網絡差異是有區別的[23]。網絡異常到底是癲癇的原因還是結果，或者存在其他關系有待進一步研究證明。
2.3 離子通道學說
離子通道是體內一切電活動的結構基礎，癲癇是腦部神經元高同步異常放電所致，二者之間關系密切。選擇性允許離子通過是離子通道最重要的功能，目前發現的與癲癇有關的離子通道有鉀離子通道、鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道等。癲癇的發生可能是一條離子通道作用，也可能是多條離子通道相互作用的結果，通過電解質分布和轉運的異常最終導致離子通道功能紊亂，從而使神經元異常放電[24]。
3 circRNA與癲癇
circRNA是具有潛在調控特性的早期非編碼RNA。circRNA在所有組織中都有表達，但在中樞神經系統中更為豐富，尤其在神經元突觸處高度活躍，circRNA在保持大腦健康和神經精神疾病發生發展中發揮著突出作用[25]。最近的研究表明，circRNA是由幾個神經元特異性基因產生的，表明它們可能參與了大腦發育和突觸可塑性[20]。circRNA紊亂可能與急性中樞神經系統損傷后的神經退行性疾病和繼發性腦損傷有關。
在神經系統疾病中，circRNA與miRNA 相互作用，通過circRNA-miRNA-mRNA軸作為miRNA海綿調節基因表達。雖然大多數circRNA的表達水平通常很低，但一些circRNA表現出細胞類型特異性和組織特異性的表達，具有高拷貝數和轉錄數（>10倍）[26]。研究發現，circRNA在腦組織中更豐富[26]，尤其是突觸部分，包括神經磷脂和突觸小體[27]。這些發現提示circRNA在神經元功能中發揮重要作用。組織學結果證實，邊緣結構的突觸重組似乎逐步增強皮質的過度興奮性，并可能導致癲癇發作[28]。然而，circRNA在癲癇中的作用在很大程度上仍不清楚。
文獻中有一些例子說明了circRNA與癲癇的發生發展有意義：① 如circUBQLN1通過充當miR-155的海綿誘導SOX7的表達來抑制癲癇的發生。circUBQLN1/miR-155/SOX7信號網絡有助于理解癲癇的病理機制。以circUBQLN1為治療靶點可能會改善癲癇的治療[29]；② 也有研究監測到，在TLE血清標本和無Mg2+誘導的人海馬神經元中，circ_0003170和CCL2的表達增加，而miR-421的表達降低。circ_0003170通過調控miR-421/CCL2軸，觸發神經元損傷，包括細胞周期阻滯、凋亡和氧化應激[30]；③ circ_ANKMY2通過miR-106b-5p/FOXP1軸調控TLE的進展，為circ_ANKMY2作為TLE治療的靶點提供了證據[31]。
4 小結
circRNA在其生物合成和分子功能方面的研究得到了極大的發展。然而，還有更多生物學功能有待進一步調查研究，其與癲癇的發生及發展也有待更多的研究和探討。靶基因、miRNA和circRNA之間的三方相互作用如何協調以促進人類疾病的發展需要更全面的研究。circRNA表達或降解在特定疾病背景下的調控是另一個需要進一步研究的重要問題。此外，circRNA的類蛋白特性為調節分子間相互作用開辟了全新的途徑。如何預測circRNA的三級結構及其潛在的相互作用則需要更系統的全基因組調查和分析。綜上，circRNA作為一種新型的調控分子將成為癲癇的預防、診斷及治療的新靶點。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
癲癇是顱內神經元高同步異常放電所致的神經系統功能障礙性疾病，影響全球7 000多萬人，且80%以上在中低收入國家[ 1]。其發病機制復雜，涉及神經遞質學、異常網絡、離子通道、遺傳、免疫等學說。盡管越來越多的研究探索了癲癇的發病機制，但確定的癲癇致病因素和發病機制仍然缺乏[2]。
環狀RNA（Circular RNAs，circRNA）是一種非編碼RNA，由線性轉錄本通過反向剪接產生，可作為蛋白樣調控因子、轉錄因子和微小核糖核酸（MicroRNAs，miRNAs）海綿發揮作用[3]。隨著高通量測序和生物信息學工具的發展，科學家發現circRNA是人類轉錄組的一個普遍特征，在許多其他動物中無處不在[4]。circRNA的獨特結構讓其具有比線性核糖核酸更長的半衰期和更強的核糖核酸酶（Ribonuclease，RNAse）抗性[5]，這使得它們有望成為診斷和治療的生物標志物及靶點。大量研究揭示了它們獨特的表達特征和在多種疾病中的重要生物學作用，如惡性腫瘤[6]、心血管疾病[7]、神經系統疾病[8]和自身免疫性疾病[9]。
1 circRNA 概述
1.1 circRNA結構
circRNA是一種不同于線性RNA的新型非編碼RNA，起源于前體- mRNA轉錄本的反向剪接，沒有3' 尾端（polo A結構）和5' '端帽子結構的，通過共價鍵連接形成閉環結構[10]。
1.2 circRNA特點
circRNA通常被認為是豐富、穩定、保守和特異性表達的分子，存在于真核生物中。
1.2.1 豐富性
circRNA的豐富性一直是人們關注的焦點。Salzman等[11]通過RNA測序在癌細胞和正常細胞中發現大量環形轉錄副本，10%以上的人類基因可以轉錄產生circRNA,該數據與典型的線性轉錄副本基本相當。Jeck等[10]利用高通量測序方法發現，在人類成纖維細胞中超過25 000種環狀RNA，比它們相關的線性mRNA高出>10倍。
1.2.2 穩定性
對于理想的生物標志物來說，穩定5' 端帽子結構的共價環，circRNA可以逃避去腺苷化和去帽化。此外，circRNA對性是測試結果可靠性和可重復性的關鍵屬性。作為一個缺乏3' 多聚腺苷酸尾和核糖核酸外切酶（Ribonuclease R ，RNase R，3’-5’核糖核酸外切酶）具有高度抗性，RNAseR是一種消化幾乎所有的線性RNA的核酸外切酶。circRNAs在細胞中的平均半衰期超過48 h[10]，比mRNAs的平均10 h長得多[12]。
除了血液，circRNA也可以在唾液和精漿等其他體液中檢測到[13]。盡管唾液中的核酸外切酶活性很高，circRNA可以通過摻入大分子或封裝在唾液中的外泌體中防止降解[14]。研究發現，在室溫下，circRNA在采集24 h后的無細胞的精液內幾乎不會降解[15]。這表明circRNA可以作為男性生殖疾病的良好生物標志物。綜上，這些數據表明環狀RNA極具穩定性，更有潛力作為生物標志物。
1.2.3 保守性
作為RNA家族的新成員，circRNA的保守性仍有爭議。一些研究聲稱circRNAs是進化上非常保守的分子[10]，而另一些研究認為它們是物種特異性[16]。我們總結了一些可能與它們的保守程度相關的因素：circRNA的類型、表達水平、起源組織和物種間的進化距離。保守性的差異還來自許多其他混雜因素，包括檢查的不同組織類型或使用的不同生物信息學方法。然而，不管在什么情況下，在人類和嚙齒類動物中確實存在相當數量的精確位于同源位置的circRNA[12]。對于這些circRNA，嚙齒動物可以作為實驗研究的合適模式生物。此外，這些在漫長的進化過程中一直保持保守的circRNA可能具有重要的功能，因此具有更大的研究價值。
1.2.4 特異性
circRNA具有作為各種疾病特定的生物標志物參與特定細胞類型或特定病理條件下的生物過程的特異性。研究表明，circRNA的類型和豐度在不同組織和細胞中及其不同發育階段均有所不同[11]。經確定，人類成人中11.9%的circRNA、人類胎兒中10.4%的circRNA和小鼠中34.3%的circRNA是組織特異性的[17]。
1.3 circRNA功能
1.3.1 miRNA 分子海綿
一些circRNA包含miRNA響應元件，并可以與miRNA作為miRNA海綿相互作用[3]，阻止mi RAN在3 '非翻譯區與信使RNA（Messenger RNA，mRNA)相互作用。最近收集的證據表明，circRNA參與了miRNA表達水平的微調控。circRNAs通過與miRNAs競爭結合，從而干擾了miRNA對靶mRNA的抑制功能，進而調控靶基因的表達[18]。此外，circRNAs-miRNAs的相互作用是僅用于隔離miRNAs還是超出了這一功能，目前仍不清楚。
1.3.2 調控蛋白結合
部分circ RNA 可與蛋白質相互作用，參與基因的表達調控。如正常情況下，細胞周期蛋白依賴性激酶 2（Cyclin dependent kinase 2，CDK2）與細胞周期蛋白結合推動細胞周期進程，而 circ-Foxo3 可與 CDK2、p21 結合形成 circ-Foxo3-p21-CDK2 三 元復合物，阻礙 CDK2 的功能，從而阻滯了細胞周期運行[19]。Abdelmohsen 等[8]研究發現， circ PABPN1 可抑制 RNA 結合蛋白 HUR 與核內 poly(A)結合蛋白 1（PABPN1）mRNA 的 結合，降低 PABPN1 mRNA 表達水平。
1.3.3 調控基因轉錄
雖然大多數circRNA可以在細胞質中找到，但這些物種的一部分被運輸到細胞核中，在某些情況下，circRNA在細胞核中通過增強其親本基因的表達，發揮功能。已有研究表明，外顯子-內含子型circRNA和內含子型circRNA的成員與轉錄機制相互作用，并調節全范圍的基因表達[20]。
1.3.4 編碼功能
根據我們的傳統觀點，5’端和3’端是真核細胞翻譯起始的基本要素。由于缺少5’端和3’端，circRNA一度被認為是非編碼核糖核酸。最近，越來越多的證據表明，circRNA可以與多聚體相關聯，其中一些包含起始密碼子AUG和具有適當長度的公認的開放閱讀框，這表明circRNA具有意想不到的蛋白質編碼潛力[21]。
2 癲癇發病機制
癲癇發病機制復雜，癲癇的發生發展與神經遞質學、異常網絡、離子通道、遺傳、免疫等關系密切，大致為以下三種學說。
2.1 神經遞質學說
前期已有許多研究證明癲癇的發生與腦部抑制性和興奮性神經遞質的失衡有關。大量證據支持抑制性神經遞質γ-氨基丁酸和興奮性神經遞質谷氨酸信號異常在癲癇發病機制中起重要作用,同時也有乙酰膽堿、P物質、一氧化氮、大麻素和腺苷等神經化學物質的參與[22]。
2.2 異常網絡學說
有研究表明，癲癇是一種網絡障礙疾病，研究者運用靜息狀態連接圖理論分析顳葉癲癇神經網絡的功能變化，證明癲癇患者組和健康對照組的網絡差異是有區別的[23]。網絡異常到底是癲癇的原因還是結果，或者存在其他關系有待進一步研究證明。
2.3 離子通道學說
離子通道是體內一切電活動的結構基礎，癲癇是腦部神經元高同步異常放電所致，二者之間關系密切。選擇性允許離子通過是離子通道最重要的功能，目前發現的與癲癇有關的離子通道有鉀離子通道、鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道等。癲癇的發生可能是一條離子通道作用，也可能是多條離子通道相互作用的結果，通過電解質分布和轉運的異常最終導致離子通道功能紊亂，從而使神經元異常放電[24]。
3 circRNA與癲癇
circRNA是具有潛在調控特性的早期非編碼RNA。circRNA在所有組織中都有表達，但在中樞神經系統中更為豐富，尤其在神經元突觸處高度活躍，circRNA在保持大腦健康和神經精神疾病發生發展中發揮著突出作用[25]。最近的研究表明，circRNA是由幾個神經元特異性基因產生的，表明它們可能參與了大腦發育和突觸可塑性[20]。circRNA紊亂可能與急性中樞神經系統損傷后的神經退行性疾病和繼發性腦損傷有關。
在神經系統疾病中，circRNA與miRNA 相互作用，通過circRNA-miRNA-mRNA軸作為miRNA海綿調節基因表達。雖然大多數circRNA的表達水平通常很低，但一些circRNA表現出細胞類型特異性和組織特異性的表達，具有高拷貝數和轉錄數（>10倍）[26]。研究發現，circRNA在腦組織中更豐富[26]，尤其是突觸部分，包括神經磷脂和突觸小體[27]。這些發現提示circRNA在神經元功能中發揮重要作用。組織學結果證實，邊緣結構的突觸重組似乎逐步增強皮質的過度興奮性，并可能導致癲癇發作[28]。然而，circRNA在癲癇中的作用在很大程度上仍不清楚。
文獻中有一些例子說明了circRNA與癲癇的發生發展有意義：① 如circUBQLN1通過充當miR-155的海綿誘導SOX7的表達來抑制癲癇的發生。circUBQLN1/miR-155/SOX7信號網絡有助于理解癲癇的病理機制。以circUBQLN1為治療靶點可能會改善癲癇的治療[29]；② 也有研究監測到，在TLE血清標本和無Mg2+誘導的人海馬神經元中，circ_0003170和CCL2的表達增加，而miR-421的表達降低。circ_0003170通過調控miR-421/CCL2軸，觸發神經元損傷，包括細胞周期阻滯、凋亡和氧化應激[30]；③ circ_ANKMY2通過miR-106b-5p/FOXP1軸調控TLE的進展，為circ_ANKMY2作為TLE治療的靶點提供了證據[31]。
4 小結
circRNA在其生物合成和分子功能方面的研究得到了極大的發展。然而，還有更多生物學功能有待進一步調查研究，其與癲癇的發生及發展也有待更多的研究和探討。靶基因、miRNA和circRNA之間的三方相互作用如何協調以促進人類疾病的發展需要更全面的研究。circRNA表達或降解在特定疾病背景下的調控是另一個需要進一步研究的重要問題。此外，circRNA的類蛋白特性為調節分子間相互作用開辟了全新的途徑。如何預測circRNA的三級結構及其潛在的相互作用則需要更系統的全基因組調查和分析。綜上，circRNA作為一種新型的調控分子將成為癲癇的預防、診斷及治療的新靶點。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。