引用本文： 郭韜, 武江, 陳堯, 劉倩薇, 蘭艷芹. 嗎啡毒性對家貓腦皮層電活動及線粒體影響的研究. 癲癇雜志, 2020, 6(1): 12-15. doi: 10.7507/2096-0247.20200003 復制
嗎啡藥物依賴產生強迫性用藥癥狀和持續性渴求狀態，目前被認為其本質是一種慢性復發性腦病。嗎啡對中樞神經有嚴重的毒性損傷作用，但機制仍不明確。腦電圖（EEG）是一項經典的記錄腦容積導體綜合電變化的技術，與腦細胞代謝密切相關，能反應神經元功能變化的動態信息。線粒體是真核細胞內重要的細胞器，是生成三磷酸腺苷（ATP）的場所。由于細胞內、外環境因素的改變，均可引起線粒體結構、功能異常，導致神經中樞能量供應障礙。所以，線粒體超微結構改變可作為嗎啡依賴造成的腦功能受損的評判指標[1, 2]。
通過動物模擬嗎啡暴露造成家貓腦組織損傷的病理、生理過程，進一步分析線粒體超微結構改變在皮層異常放電中的作用，探討嗎啡暴露造成的腦功能損害的可能機制，為臨床合理治療嗎啡依賴提供病理學及電生理依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
實驗動物選用由河北省人民醫院實驗中心提供的成年健康雄性家貓 12 只；體重 2～3 kg。該實驗獲得河北省人民醫院（動物實驗）倫理委員會批準。
1.2 分組與造模
按照隨機數字辦法將其分為急性嗎啡暴露組（9 只）和對照組（3 只）。實驗藥品應用鹽酸嗎啡注射液與鹽酸納絡酮注射液。嗎啡急性暴露貓模型制作以及判定急性嗎啡暴露組貓模型是否建立成功的詳細過程參見文獻[3]。
1.3 腦電圖監測及病理學檢查
兩組動物分別于造模成功 3 周后取材。取材時 MS 4 000U 電生理監測儀進行皮層 EEG 監測。兩組動物分別在皮層 EEG 監測完成后行腦組織取材。
2 結果
2.1 腦電圖改變
對照組 EEG 表現為：基本節律 8～13 Hz 的中低波幅 α 波，少量 β 波。各腦區波形規整，調幅、調節好，左右對稱（圖 1）。
圖1
對照組腦電圖
Figure1.
EEG of the control group
嗎啡暴露組 EEG 表現為：額區腦電顯示正常背景消失，頻率加快，波形不規整，出現棘波、棘慢波，還可見單發高幅及超高幅棘波或成簇的棘波發放；頂區多為低幅快節律尖波或棘波及棘慢波；顳區病理波表現為低波幅，低頻率發放，慢波明顯增多，尤以中、低波幅 θ 波為主，可見連續發放；枕區生理性正常 α 波數量減少，波幅減低，甚至 α 失節律，無法辨認。α 波調幅調節變差，α 波慢化（懶波），低、中波幅 θ 波、δ 波增多（圖 2a～d）。
圖2
嗎啡暴露組腦電圖
a. 額葉成簇棘波發放；b. 頂葉少量棘波、慢波發放；c. 顳葉波幅較低，慢波明顯增多；d. 枕葉α波減少，波幅減低，δ波增多
Figure2. EEG of morphine exposed groupa. tufted spikes in frontal lobe; b. a few spikes and slow waves in parietal lobe; c. the amplitude of temporal lobe wave is low, and the slow wave is obviously increased; d.occipital lobe α wave decreased, amplitude decreased and δ wave increased
2.2 線粒體病理改變
2.2.1 嗎啡暴露組
電鏡下暴露組家貓大腦皮質神經元多呈凋亡狀態。神經元胞體內胞漿、胞核電子密度增加，內質網腫脹擴張、線粒體腫脹、空泡樣變性。亦可見神經元變性、壞死，表現為線粒體瘠消失，粗面內質網擴張，細胞器減少，排列混亂，核周間隙擴張，核膜模糊不清，染色質邊集（圖 3 a）。各腦區神經元超微病理學改變類型、病變程度相同。
圖3
嗎啡暴露組腦組織電鏡
a. 神經元凋亡,核電子密度增加，核周隙擴張（×5K）；b. 神經元內線粒體腫脹，內質網擴張（×10K）；c. 線粒體互相融合巨大線粒體（×6K）；d. 線粒體嵴結構模糊，排列紊亂，基質電子密度明顯降低（×10K）；e. 線粒體局部腫脹變形，內見結晶狀包涵體（×12K）
Figure3. Electron microscopy of Morphine exposed groupThe electron microscopy showed that the number, morphology, internal membrane structure and the inclusion body in the matrix of neurons changed in various aspects
神經細胞線粒體超微結構的改變包括數量、形態、結構的改變及包涵物的形成，分述如下：① 數量：多數神經元線粒體數量明顯增多，但分布不均勻（圖 3 b），部分顯示線粒體數量減少或改變不明顯；② 形態：線粒體有明顯的形態改變，彌漫腫脹呈球形甚至不規則形，并可見線粒體互相融合而成的巨大線粒體（圖 3 c），少數出現線粒體體積變小，內腔皺縮，嵴萎縮，基質電子密度增高；③ 結構：多數線粒體嵴結構模糊，排列紊亂，有的嵴呈多囊狀，有的嵴呈同心圓樣排列，中央區空化，線粒體基質電子密度明顯降低（圖 3 d），少數線粒體發生退變, 表現為雙層膜間隙不清，其內充滿電子致密物或雙層膜消失，只殘留有一層膜性結構，呈空泡樣改變，僅存殘跡，甚至外膜斷裂、內部結構溶解的現象；④ 包涵體：基質內可見類糖原顆粒、結晶狀包涵體，部分可觀察到小泡樣包涵體（圖 3 e）。
2.2.2 對照組
對照組的腦組織神經元電鏡顯示細胞核電子密度低，細胞質內粗面內質網及其他細胞器豐富，排列整齊，形態正常。細胞核核膜無皺縮，染色質密度正常，線粒體嵴清晰、無腫脹（圖 4）。
圖4
對照組腦組織電鏡
細胞核、細胞質、細胞器結構完整，排列整齊（×6K）
Figure4. Electron microscopy of the control groupThe EEG and electron microscopy of the control group was normal
3 討論
藥物通過多種途徑和機制直接和/或間接地作用于線粒體而引起線粒體結構改變和功能紊亂稱為線粒體毒性[4]。
本組實驗證實，與嗎啡暴露組家貓 EEG 廣泛異常相對應，神經元線粒體超微結構無論在數量、形態、內部膜結構還是基質內包涵體各方面均發生改變，特別是線粒體腫脹、內膜、嵴膜排列紊亂、消失及空泡化表現的尤為明顯，表明嗎啡具有強烈的線粒體毒性。
線粒體內膜、嵴膜的結構與線粒體的功能密切相關，是進行電子傳遞和氧化磷酸化的部位；線粒體內膜上還有許多特異性離子通道和非選擇性的孔結構，如線粒體 ATP 敏感的鉀通道、線粒體鈣離子敏感鉀通道、鈣離子單向轉運體等；另外，腺苷酸轉位酶也位于線粒體內膜上，將線粒體內合成的 ATP 轉運到胞漿內，把胞漿內的腺苷二磷酸（ADP）轉入線粒體內進行氧化磷酸化，維持線粒體和胞漿能量平衡。嗎啡還可誘導腦細胞線粒體呼吸鏈的 Ndufa12、Ndufab1、Ndnfb2等基因下調，干擾能量物質 ATP 的產生[4]。線粒體結構破壞必然伴隨著功能紊亂，線粒體功能障礙又可進一步導致自由基產生增多，過多的氧自由基可引起生物膜結構蛋白質和脂質過氧化，從而造成線粒體膜損傷，造成整個細胞能量的產生障礙，最終可能迅速引起細胞壞死或凋亡。該過程導致腦細胞供能減少，神經細胞鈉鉀泵活動減弱，維持神經傳遞的生物電不能良好的建立，致使神經遞質的合成、釋放以及信息的傳遞延遲，大腦的電生理功能異常。結合本實驗，嗎啡可引起實驗家貓腦電廣泛異常，主要體現在正常腦電背景消失，正常生理波減少變形，頻率加快，雙側對稱變差，調幅調節變差和病理波大量出現兩方面。各腦區 EEG 顯示額區正常 α 背景逐漸消失，頻率加快，波形不整，與正常額區 EEG 對比反差較大，而額區電生理活動與精神狀態、定向力等功能密切相關，額區生理波減少反映了功能受損。腦功能正常時，枕區 α 波頻率多在 8～13 Hz，調幅調節良好；而嗎啡依賴貓隨嗎啡劑量遞增，枕區 α 波數量逐漸減少，調幅調節逐漸變差，形態異常，直至難以辨認。頂區可見少量棘尖波及棘慢波；顳區病理波波幅較低，發放頻率亦較低，慢波明顯增多，以低、中波幅 θ 波為主，有時連續發放。這些改變與嗎啡貓出現精神不振，呆滯等癥狀密切相關。嗎啡線粒體毒性或許就是嗎啡致各腦區皮層正常腦電紊亂的始動因素及病理學基礎。
嗎啡造成線粒體損傷、細胞能量代謝障礙改變了中樞和外周鈣離子通道的數目和開放狀態，導致神經細胞膜中的鈣通道增多。同時使神經元細胞膜上鈉、鉀離子通道結構受損，出現異常神經元電活動以及 NG108-15、SH-SY5Y 等神經細胞內鈣離子動態平衡的失調，可導致神經元放電節律發生改變[5]。過量的鈣內流在細胞內形成高濃度游離鈣，并激活鈣依賴蛋白酶及磷脂酶，分解維持正常細胞功能所必備的蛋白質、磷脂酞乙醇胺和磷脂酞膽鹼，神經細胞壞死、疤痕形成，出現異常放電成為致癇灶[6]。這可能是嗎啡造成神經元異常放電的電生理基礎。
本組嗎啡暴露組 EEG 表現為病理性尖波、棘波、棘慢波及慢波間斷出現、增多，有時可呈連續性發放。顳、頂區病理波主要以低幅慢波、棘波為主。額區變化更為明顯，可見高幅及超高幅棘波及超高幅連續棘波發放。這可作為實驗過程中發現嗎啡依賴貓出現發作性強直陣攣的 EEG 基礎。這從實驗上提供了線粒體超微結構損傷導致癲癇灶形成、棘波發放的佐證。
綜上，嗎啡線粒體毒性，引起呼吸功能和能量代謝功能障礙可作為腦皮層神經元生物電活動紊亂、異常放電顯著的始發機制。嗎啡依賴的機制十分復雜，深入分析線粒體超微結構異常對神經元電活動改變的作用，針對性研究其損壞機制與保護方法，將為嗎啡戒癮和脫癮后復吸的治療、預防提供新的研究思路。
嗎啡藥物依賴產生強迫性用藥癥狀和持續性渴求狀態，目前被認為其本質是一種慢性復發性腦病。嗎啡對中樞神經有嚴重的毒性損傷作用，但機制仍不明確。腦電圖（EEG）是一項經典的記錄腦容積導體綜合電變化的技術，與腦細胞代謝密切相關，能反應神經元功能變化的動態信息。線粒體是真核細胞內重要的細胞器，是生成三磷酸腺苷（ATP）的場所。由于細胞內、外環境因素的改變，均可引起線粒體結構、功能異常，導致神經中樞能量供應障礙。所以，線粒體超微結構改變可作為嗎啡依賴造成的腦功能受損的評判指標[1, 2]。
通過動物模擬嗎啡暴露造成家貓腦組織損傷的病理、生理過程，進一步分析線粒體超微結構改變在皮層異常放電中的作用，探討嗎啡暴露造成的腦功能損害的可能機制，為臨床合理治療嗎啡依賴提供病理學及電生理依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
實驗動物選用由河北省人民醫院實驗中心提供的成年健康雄性家貓 12 只；體重 2～3 kg。該實驗獲得河北省人民醫院（動物實驗）倫理委員會批準。
1.2 分組與造模
按照隨機數字辦法將其分為急性嗎啡暴露組（9 只）和對照組（3 只）。實驗藥品應用鹽酸嗎啡注射液與鹽酸納絡酮注射液。嗎啡急性暴露貓模型制作以及判定急性嗎啡暴露組貓模型是否建立成功的詳細過程參見文獻[3]。
1.3 腦電圖監測及病理學檢查
兩組動物分別于造模成功 3 周后取材。取材時 MS 4 000U 電生理監測儀進行皮層 EEG 監測。兩組動物分別在皮層 EEG 監測完成后行腦組織取材。
2 結果
2.1 腦電圖改變
對照組 EEG 表現為：基本節律 8～13 Hz 的中低波幅 α 波，少量 β 波。各腦區波形規整，調幅、調節好，左右對稱（圖 1）。
圖1
對照組腦電圖
Figure1.
EEG of the control group
嗎啡暴露組 EEG 表現為：額區腦電顯示正常背景消失，頻率加快，波形不規整，出現棘波、棘慢波，還可見單發高幅及超高幅棘波或成簇的棘波發放；頂區多為低幅快節律尖波或棘波及棘慢波；顳區病理波表現為低波幅，低頻率發放，慢波明顯增多，尤以中、低波幅 θ 波為主，可見連續發放；枕區生理性正常 α 波數量減少，波幅減低，甚至 α 失節律，無法辨認。α 波調幅調節變差，α 波慢化（懶波），低、中波幅 θ 波、δ 波增多（圖 2a～d）。
圖2
嗎啡暴露組腦電圖
a. 額葉成簇棘波發放；b. 頂葉少量棘波、慢波發放；c. 顳葉波幅較低，慢波明顯增多；d. 枕葉α波減少，波幅減低，δ波增多
Figure2. EEG of morphine exposed groupa. tufted spikes in frontal lobe; b. a few spikes and slow waves in parietal lobe; c. the amplitude of temporal lobe wave is low, and the slow wave is obviously increased; d.occipital lobe α wave decreased, amplitude decreased and δ wave increased
2.2 線粒體病理改變
2.2.1 嗎啡暴露組
電鏡下暴露組家貓大腦皮質神經元多呈凋亡狀態。神經元胞體內胞漿、胞核電子密度增加，內質網腫脹擴張、線粒體腫脹、空泡樣變性。亦可見神經元變性、壞死，表現為線粒體瘠消失，粗面內質網擴張，細胞器減少，排列混亂，核周間隙擴張，核膜模糊不清，染色質邊集（圖 3 a）。各腦區神經元超微病理學改變類型、病變程度相同。
圖3
嗎啡暴露組腦組織電鏡
a. 神經元凋亡,核電子密度增加，核周隙擴張（×5K）；b. 神經元內線粒體腫脹，內質網擴張（×10K）；c. 線粒體互相融合巨大線粒體（×6K）；d. 線粒體嵴結構模糊，排列紊亂，基質電子密度明顯降低（×10K）；e. 線粒體局部腫脹變形，內見結晶狀包涵體（×12K）
Figure3. Electron microscopy of Morphine exposed groupThe electron microscopy showed that the number, morphology, internal membrane structure and the inclusion body in the matrix of neurons changed in various aspects
神經細胞線粒體超微結構的改變包括數量、形態、結構的改變及包涵物的形成，分述如下：① 數量：多數神經元線粒體數量明顯增多，但分布不均勻（圖 3 b），部分顯示線粒體數量減少或改變不明顯；② 形態：線粒體有明顯的形態改變，彌漫腫脹呈球形甚至不規則形，并可見線粒體互相融合而成的巨大線粒體（圖 3 c），少數出現線粒體體積變小，內腔皺縮，嵴萎縮，基質電子密度增高；③ 結構：多數線粒體嵴結構模糊，排列紊亂，有的嵴呈多囊狀，有的嵴呈同心圓樣排列，中央區空化，線粒體基質電子密度明顯降低（圖 3 d），少數線粒體發生退變, 表現為雙層膜間隙不清，其內充滿電子致密物或雙層膜消失，只殘留有一層膜性結構，呈空泡樣改變，僅存殘跡，甚至外膜斷裂、內部結構溶解的現象；④ 包涵體：基質內可見類糖原顆粒、結晶狀包涵體，部分可觀察到小泡樣包涵體（圖 3 e）。
2.2.2 對照組
對照組的腦組織神經元電鏡顯示細胞核電子密度低，細胞質內粗面內質網及其他細胞器豐富，排列整齊，形態正常。細胞核核膜無皺縮，染色質密度正常，線粒體嵴清晰、無腫脹（圖 4）。
圖4
對照組腦組織電鏡
細胞核、細胞質、細胞器結構完整，排列整齊（×6K）
Figure4. Electron microscopy of the control groupThe EEG and electron microscopy of the control group was normal
3 討論
藥物通過多種途徑和機制直接和/或間接地作用于線粒體而引起線粒體結構改變和功能紊亂稱為線粒體毒性[4]。
本組實驗證實，與嗎啡暴露組家貓 EEG 廣泛異常相對應，神經元線粒體超微結構無論在數量、形態、內部膜結構還是基質內包涵體各方面均發生改變，特別是線粒體腫脹、內膜、嵴膜排列紊亂、消失及空泡化表現的尤為明顯，表明嗎啡具有強烈的線粒體毒性。
線粒體內膜、嵴膜的結構與線粒體的功能密切相關，是進行電子傳遞和氧化磷酸化的部位；線粒體內膜上還有許多特異性離子通道和非選擇性的孔結構，如線粒體 ATP 敏感的鉀通道、線粒體鈣離子敏感鉀通道、鈣離子單向轉運體等；另外，腺苷酸轉位酶也位于線粒體內膜上，將線粒體內合成的 ATP 轉運到胞漿內，把胞漿內的腺苷二磷酸（ADP）轉入線粒體內進行氧化磷酸化，維持線粒體和胞漿能量平衡。嗎啡還可誘導腦細胞線粒體呼吸鏈的 Ndufa12、Ndufab1、Ndnfb2等基因下調，干擾能量物質 ATP 的產生[4]。線粒體結構破壞必然伴隨著功能紊亂，線粒體功能障礙又可進一步導致自由基產生增多，過多的氧自由基可引起生物膜結構蛋白質和脂質過氧化，從而造成線粒體膜損傷，造成整個細胞能量的產生障礙，最終可能迅速引起細胞壞死或凋亡。該過程導致腦細胞供能減少，神經細胞鈉鉀泵活動減弱，維持神經傳遞的生物電不能良好的建立，致使神經遞質的合成、釋放以及信息的傳遞延遲，大腦的電生理功能異常。結合本實驗，嗎啡可引起實驗家貓腦電廣泛異常，主要體現在正常腦電背景消失，正常生理波減少變形，頻率加快，雙側對稱變差，調幅調節變差和病理波大量出現兩方面。各腦區 EEG 顯示額區正常 α 背景逐漸消失，頻率加快，波形不整，與正常額區 EEG 對比反差較大，而額區電生理活動與精神狀態、定向力等功能密切相關，額區生理波減少反映了功能受損。腦功能正常時，枕區 α 波頻率多在 8～13 Hz，調幅調節良好；而嗎啡依賴貓隨嗎啡劑量遞增，枕區 α 波數量逐漸減少，調幅調節逐漸變差，形態異常，直至難以辨認。頂區可見少量棘尖波及棘慢波；顳區病理波波幅較低，發放頻率亦較低，慢波明顯增多，以低、中波幅 θ 波為主，有時連續發放。這些改變與嗎啡貓出現精神不振，呆滯等癥狀密切相關。嗎啡線粒體毒性或許就是嗎啡致各腦區皮層正常腦電紊亂的始動因素及病理學基礎。
嗎啡造成線粒體損傷、細胞能量代謝障礙改變了中樞和外周鈣離子通道的數目和開放狀態，導致神經細胞膜中的鈣通道增多。同時使神經元細胞膜上鈉、鉀離子通道結構受損，出現異常神經元電活動以及 NG108-15、SH-SY5Y 等神經細胞內鈣離子動態平衡的失調，可導致神經元放電節律發生改變[5]。過量的鈣內流在細胞內形成高濃度游離鈣，并激活鈣依賴蛋白酶及磷脂酶，分解維持正常細胞功能所必備的蛋白質、磷脂酞乙醇胺和磷脂酞膽鹼，神經細胞壞死、疤痕形成，出現異常放電成為致癇灶[6]。這可能是嗎啡造成神經元異常放電的電生理基礎。
本組嗎啡暴露組 EEG 表現為病理性尖波、棘波、棘慢波及慢波間斷出現、增多，有時可呈連續性發放。顳、頂區病理波主要以低幅慢波、棘波為主。額區變化更為明顯，可見高幅及超高幅棘波及超高幅連續棘波發放。這可作為實驗過程中發現嗎啡依賴貓出現發作性強直陣攣的 EEG 基礎。這從實驗上提供了線粒體超微結構損傷導致癲癇灶形成、棘波發放的佐證。
綜上，嗎啡線粒體毒性，引起呼吸功能和能量代謝功能障礙可作為腦皮層神經元生物電活動紊亂、異常放電顯著的始發機制。嗎啡依賴的機制十分復雜，深入分析線粒體超微結構異常對神經元電活動改變的作用，針對性研究其損壞機制與保護方法，將為嗎啡戒癮和脫癮后復吸的治療、預防提供新的研究思路。
