引用本文： 苑斌, 卜美玲, 田佳鈺, 張蕾, 孫永安. 天漿牛黃散對匹羅卡品大鼠癲癇模型的影響. 癲癇雜志, 2019, 5(3): 187-191. doi: 10.7507/2096-0247.20190033 復制
癲癇是一種常見的神經系統慢性疾病，在我國每年發病率約 23/10 萬左右[1]。癲癇具有病因多樣性、反復發作、癥狀復雜等特點，根據不同的臨床表現大致分為全面強直-陣攣發作、單純部分發作、復雜部分發作、失神發作、癲癇持續狀態等類型。目前治療以口服抗癲癇藥物（AEDs）為主，長期服用 AEDs 將產生藥物不良反應。
天漿牛黃散是由天漿子、人工牛黃、郁金、白帆、天竺黃、朱砂組成。天漿子和牛黃為君藥，是最有特色的成分，具有熄風止痙、解毒消腫的功效，起到至關重要的作用。
丙戊酸鈉為各大指南推薦的單藥治療癲癇的一線用藥，療效確切[2]。我們以天漿牛黃散藥方為基礎，比較其與丙戊酸鈉對匹羅卡品大鼠癲癇模型的影響，為天漿牛黃散的開發和擴大應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 藥品和儀器
天漿牛黃散自行配制：每份以天漿子 30 顆、人工牛黃 5 g、郁金 30 g、白帆 15 g、天竺黃 20 g、朱砂 5 g 的比例稱取，研磨成粉末，配制成 0.1 g/mL 的溶液。
氯化鋰、匹羅卡品（杭州大陽化工有限公司）；生理鹽水、東莨菪堿為本實驗室配制；水合氯醛（北京市旭東化廠）；多聚甲醛（濟南翱翔化工有限公司）；無水乙醇、二甲苯（山東茂軍化工科技有限公司）；放大器、腦電圖（EEG）記錄儀（北京大陽公司）；Morris 水迷宮；光電顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司）。
1.2 實驗動物及造模方法
健康雄性成年 SD 大鼠，體重 150～200 g，購自武漢大學實驗動物中心。給予自由進食及飲水，維持 12 h 光照/黑夜晝夜節律。該實驗獲得荷澤醫學專科學校附屬醫院醫學倫理委員會批準。
采用氯化鋰-匹羅卡品制作慢性癲癇大鼠模型[3]。首先按照 127.17 mg/kg 的劑量對大鼠進行氯化鋰腹腔注射，18 h 后按照 1 mg/kg 的劑量對其腹腔注射東莨菪堿（0.25 mg/kg），30 min 后按照 10 mg/kg 的劑量腹腔注射匹羅卡品（濃度 7.5 g/L）；重復 5 次，若 5 次之后仍未成功，則換用另一只大鼠重新制作，共成功造模實驗大鼠 30 只。
造模成功檢測標準：大鼠發作情況按照 Racine 評價標準進行評估[4]。0 級為大鼠表現正常，無異常發生；Ⅰ 級為大鼠耳朵和面部均發生輕微抽搐；Ⅱ 級為大鼠出現輕微的肌陣攣現象；Ⅲ 級為大鼠肌陣攣現象加重，尾巴強直，無法正常走路；Ⅳ 級為肌陣攣現象非常顯著；Ⅴ 級為大鼠全身出現強直的狀態、陣攣現象嚴重，部分大鼠出現跌倒；Ⅵ 級為大鼠出現癲癇持續狀態（Status epilepticus，SE），即連續癲癇發作狀態在 30 min 以上；Ⅶ 級為大鼠死亡。大鼠出現 Ⅳ 級以上的癥狀并逐漸平復之后，對其進行細致觀察，并行 EEG 檢測，如果出現癇樣放電的現象，則評定造模成功。
1.3 實驗分組
SD 大鼠 40 只，隨機分為 4 組（n=10）；各組均為每日三次灌胃，共 3 周。
空白對照組（A 組）給予生理鹽水 1 mL/kg/次的劑量灌胃。實驗組 3 組造模后大鼠安定 1 h，分別以天漿牛黃散治療組（B 組）給予天漿牛黃散 1 mL/kg/次灌胃治療；丙戊酸鈉組（C 組）給予丙戊酸鈉 5 mg/kg/次灌胃治療；實驗對照組（D 組）給予生理鹽水 1 mL/kg/次灌胃。
1.4 觀察指標
1.4.1 癲癇發作情況
對大鼠實行 24 h 視頻監測，分別于第 7、14、21 d 觀察各組大鼠的癲癇自發性發作次數和持續時間。
1.4.2 腦電圖監測放電次數
連接放大器及 EEG 記錄儀，分別于第 7、14、21 d 檢測大鼠每分鐘平均放電次數，每只大鼠記錄 30 min。
1.4.3 認知能力測評
分別于第 7、14、21 d 使用 Morris 水迷宮測試和穿梭箱試驗測定大鼠的認知能力[5]。記錄逃避潛伏期、主動回避次數、主動回避潛伏期。
1.4.4 組織學觀察大鼠海馬 CA1 區神經元細胞數
第 22 d 每組隨機選取 5 只大鼠用 100 g/L 的水合三氯乙醛（10 mL/kg）深度麻醉，心室灌注固定完后斷頭取腦，置入 40 g/L 多聚甲醛，4℃ 固定 72 h。將組織塊脫水石蠟包埋，在大腦視交叉與視乳頭之間冠狀取 3 mm 厚組織塊[6]，斷面見白色纖維狀物，即為海馬，在石蠟切片機上連續冠狀切片，厚度為 5 μm，切片放入 40℃ 的蒸餾水中展開，然后用涂布 100 g/L 多聚賴氨酸的清潔載玻片撈出，晾干后 46℃ 烘烤 2 h 備用。
常規 HE 染色：將切片置于光電顯微鏡下對各組大鼠海馬 CA1 相同部位進行神經元細胞計數[7,8]。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20. 0 軟件對實驗數據進行統計分析。計量數據采用均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析；以P 值<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
40 只 SD 大鼠造模過程中，均未發生感染或死亡，完成實驗。
2.1 大鼠癲癇發作情況
分別于第 7、14、21 d 檢測大鼠癲癇自發性發作次數和持續時間，B 組與 C 組比較均無統計學差異（P>0.05），D 組與 B、C 組比較，發作次數較多、持續時間且較長（P<0.05），見表 1～3。
表1
各實驗組第 7、14、21 天大鼠癲癇自發性發作次數和發作持續時間（
）
Table1.
Number of spontaneous seizures and duration of seizures in rats on days 7, 14, and 21 of each experimental group (
)
表3
各組大鼠第 7 天的認知能力測評（
）
Table3.
Evaluation of cognitive ability on the 7th day of each group of rats (
)
2.2 腦電圖監測大鼠放電次數
第 7、14、21 d 監測各實驗組大鼠每分鐘平均放電次數，B 組與C 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；D 組與B、C 組比較，放電次數明顯較多（P<0.05），見表 2。
表2
各實驗組第 7、14、21 天大鼠每分鐘平均放電次數（
）
Table2.
Average number of discharges per minute for rats on days 7, 14, and 21 of each experimental group (
)
2.3 大鼠認知能力測評
第 7、14、21 d 監測大鼠認知能力，A、B與C 組比較差異無統計學意義（P>0.05），D 組與A、B、C 組比較，其認知能力較差（P<0.05），見表 3。
2.4 大鼠海馬 CA1 區神經元組織學
A組海馬 CA1 區神經元呈帶狀分布，細胞結構清晰、完整，胞漿透明，胞核呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，核仁清晰，形態正常，存活細胞數（235.700±11.126）/mm2。B、C 組與D 組變性損傷的神經元失去正常結構，胞體呈三角形，胞質濃縮、深染，核固縮，核仁不明顯，比較有明顯改善（P<0.05）；與A組相比 3 個實驗組大鼠海馬 CA1 區存活細胞顯著降低（P<0.05），見表 4、圖 1。
表4
各實驗組大鼠海馬區 CA1 區存活細胞數（
）
Table4.
Number of viable cells in the hippocampal CA1 region of each experimental group (
)
圖1
各組大鼠腦組織海馬 CA1 區神經元（HE *200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure1. Hippocampas CA1 region neurons in rats brain of four groupsa. group A; b. group B; c. group C; d. group D
3 討論
癲癇是神經系統常見的慢性疾病，臨床具有病程長且反復發作的特點，現階段對于癲癇的治療主要包括內科、外科治療及其他療法，而內科治療是最主要方法[9]，但成人癲癇患者有 25.3% 及兒童癲癇患者中 13.4% 會對 AEDs 產生耐藥，逐漸發展成頑固性癲癇[10]，其治療周期長，用藥的依從性較差，并對認知功能造成不良影響，引起記憶力下降等不良反應。
癲癇俗稱“羊癲風”，屬于中醫“癇證”范疇。《素問·至真要大論》指出“諸暴強直，皆屬于風”。認為其發病為七情失調、先天因素、六淫疫毒、腦竅外傷等，致使臟腑受傷、風痰閉阻、痰火內盛、心腎虧虛，造成神機受累、元神失控。
天漿牛黃散是一種純中藥配方，其組成為：天漿子 30 顆、人工牛黃 5 g、郁金 30 g、白帆 15 g、天竺黃 20 g、朱砂 5 g。方中天漿子、牛黃共為君藥，天漿子氣味甘，平，無毒，主治寒熱結氣，盤毒鬼癥，小兒諸癇（摘自《太平圣惠方》卷八十五）。人工牛黃，味甘，性涼，歸心、肝經，主要功效為清熱解毒，化痰定驚。郁金，味辛苦，性涼，歸肝、心、肺經，功能主治行氣解郁、涼血破瘀、胸腹脅肋諸痛、失心癲狂。天竺黃，味甘，性寒，歸心、肝經，具有清熱豁痰、涼心定驚之功效。朱砂，味甘，性微寒，歸心經，具有重鎮安神、解毒的功效，臨床用于神志不安、心悸怔忡、失眠、驚癇等癥。諸藥合用，共湊寧心安神止驚癇之功效。
天漿牛黃散因其抗癲癇作用顯著，不良反應少，應用于臨床多年，成功治療了很多癲癇患者，為此我們選取大鼠為實驗對象，建立匹羅卡品癲癇模型。匹羅卡品誘導的癲癇模型與人類癲癇發作方式極為相似，是理想的動物癲癇模型[11]。該癲癇模型大鼠海馬神經元會發生凋亡，且以 γ-氨基丁酸能神經元選擇性凋亡為主[12,13]，γ-氨基丁酸能神經遞質的傳導對癲癇發作的神經元異常放電及癲癇模型的認知和學習記憶等有影響作用[14,15]，并在突觸遞質的傳遞及突觸的自身生長中占有重要位置[16]。氯化鋰-匹羅卡品慢性癲癇模型具有制作簡便、重復性好、誘發率高、受外界干擾小、癲癇發作持續時間長等優點，己經被廣泛應用于藥物基礎實驗。本研究成功造模，通過觀察發現天漿牛黃散能減少癲癇發作的次數及持續時間，減少大鼠大腦放電次數，改善認知。我們還研究發現天漿牛黃散能減少實驗大鼠海馬區神經細胞的凋亡，與丙戊酸鈉組大鼠比較，差異無統計學意義，為臨床推廣應用提供了實驗依據。至于其抗癲癇的具體機制，可能與減少神經細胞凋亡有關，尚需進一步深入和大樣本的研究。
癲癇是一種常見的神經系統慢性疾病，在我國每年發病率約 23/10 萬左右[1]。癲癇具有病因多樣性、反復發作、癥狀復雜等特點，根據不同的臨床表現大致分為全面強直-陣攣發作、單純部分發作、復雜部分發作、失神發作、癲癇持續狀態等類型。目前治療以口服抗癲癇藥物（AEDs）為主，長期服用 AEDs 將產生藥物不良反應。
天漿牛黃散是由天漿子、人工牛黃、郁金、白帆、天竺黃、朱砂組成。天漿子和牛黃為君藥，是最有特色的成分，具有熄風止痙、解毒消腫的功效，起到至關重要的作用。
丙戊酸鈉為各大指南推薦的單藥治療癲癇的一線用藥，療效確切[2]。我們以天漿牛黃散藥方為基礎，比較其與丙戊酸鈉對匹羅卡品大鼠癲癇模型的影響，為天漿牛黃散的開發和擴大應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 藥品和儀器
天漿牛黃散自行配制：每份以天漿子 30 顆、人工牛黃 5 g、郁金 30 g、白帆 15 g、天竺黃 20 g、朱砂 5 g 的比例稱取，研磨成粉末，配制成 0.1 g/mL 的溶液。
氯化鋰、匹羅卡品（杭州大陽化工有限公司）；生理鹽水、東莨菪堿為本實驗室配制；水合氯醛（北京市旭東化廠）；多聚甲醛（濟南翱翔化工有限公司）；無水乙醇、二甲苯（山東茂軍化工科技有限公司）；放大器、腦電圖（EEG）記錄儀（北京大陽公司）；Morris 水迷宮；光電顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司）。
1.2 實驗動物及造模方法
健康雄性成年 SD 大鼠，體重 150～200 g，購自武漢大學實驗動物中心。給予自由進食及飲水，維持 12 h 光照/黑夜晝夜節律。該實驗獲得荷澤醫學專科學校附屬醫院醫學倫理委員會批準。
采用氯化鋰-匹羅卡品制作慢性癲癇大鼠模型[3]。首先按照 127.17 mg/kg 的劑量對大鼠進行氯化鋰腹腔注射，18 h 后按照 1 mg/kg 的劑量對其腹腔注射東莨菪堿（0.25 mg/kg），30 min 后按照 10 mg/kg 的劑量腹腔注射匹羅卡品（濃度 7.5 g/L）；重復 5 次，若 5 次之后仍未成功，則換用另一只大鼠重新制作，共成功造模實驗大鼠 30 只。
造模成功檢測標準：大鼠發作情況按照 Racine 評價標準進行評估[4]。0 級為大鼠表現正常，無異常發生；Ⅰ 級為大鼠耳朵和面部均發生輕微抽搐；Ⅱ 級為大鼠出現輕微的肌陣攣現象；Ⅲ 級為大鼠肌陣攣現象加重，尾巴強直，無法正常走路；Ⅳ 級為肌陣攣現象非常顯著；Ⅴ 級為大鼠全身出現強直的狀態、陣攣現象嚴重，部分大鼠出現跌倒；Ⅵ 級為大鼠出現癲癇持續狀態（Status epilepticus，SE），即連續癲癇發作狀態在 30 min 以上；Ⅶ 級為大鼠死亡。大鼠出現 Ⅳ 級以上的癥狀并逐漸平復之后，對其進行細致觀察，并行 EEG 檢測，如果出現癇樣放電的現象，則評定造模成功。
1.3 實驗分組
SD 大鼠 40 只，隨機分為 4 組（n=10）；各組均為每日三次灌胃，共 3 周。
空白對照組（A 組）給予生理鹽水 1 mL/kg/次的劑量灌胃。實驗組 3 組造模后大鼠安定 1 h，分別以天漿牛黃散治療組（B 組）給予天漿牛黃散 1 mL/kg/次灌胃治療；丙戊酸鈉組（C 組）給予丙戊酸鈉 5 mg/kg/次灌胃治療；實驗對照組（D 組）給予生理鹽水 1 mL/kg/次灌胃。
1.4 觀察指標
1.4.1 癲癇發作情況
對大鼠實行 24 h 視頻監測，分別于第 7、14、21 d 觀察各組大鼠的癲癇自發性發作次數和持續時間。
1.4.2 腦電圖監測放電次數
連接放大器及 EEG 記錄儀，分別于第 7、14、21 d 檢測大鼠每分鐘平均放電次數，每只大鼠記錄 30 min。
1.4.3 認知能力測評
分別于第 7、14、21 d 使用 Morris 水迷宮測試和穿梭箱試驗測定大鼠的認知能力[5]。記錄逃避潛伏期、主動回避次數、主動回避潛伏期。
1.4.4 組織學觀察大鼠海馬 CA1 區神經元細胞數
第 22 d 每組隨機選取 5 只大鼠用 100 g/L 的水合三氯乙醛（10 mL/kg）深度麻醉，心室灌注固定完后斷頭取腦，置入 40 g/L 多聚甲醛，4℃ 固定 72 h。將組織塊脫水石蠟包埋，在大腦視交叉與視乳頭之間冠狀取 3 mm 厚組織塊[6]，斷面見白色纖維狀物，即為海馬，在石蠟切片機上連續冠狀切片，厚度為 5 μm，切片放入 40℃ 的蒸餾水中展開，然后用涂布 100 g/L 多聚賴氨酸的清潔載玻片撈出，晾干后 46℃ 烘烤 2 h 備用。
常規 HE 染色：將切片置于光電顯微鏡下對各組大鼠海馬 CA1 相同部位進行神經元細胞計數[7,8]。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20. 0 軟件對實驗數據進行統計分析。計量數據采用均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析；以P 值<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
40 只 SD 大鼠造模過程中，均未發生感染或死亡，完成實驗。
2.1 大鼠癲癇發作情況
分別于第 7、14、21 d 檢測大鼠癲癇自發性發作次數和持續時間，B 組與 C 組比較均無統計學差異（P>0.05），D 組與 B、C 組比較，發作次數較多、持續時間且較長（P<0.05），見表 1～3。
表1
各實驗組第 7、14、21 天大鼠癲癇自發性發作次數和發作持續時間（）
Table1.
Number of spontaneous seizures and duration of seizures in rats on days 7, 14, and 21 of each experimental group ()
表3
各組大鼠第 7 天的認知能力測評（）
Table3.
Evaluation of cognitive ability on the 7th day of each group of rats ()
2.2 腦電圖監測大鼠放電次數
第 7、14、21 d 監測各實驗組大鼠每分鐘平均放電次數，B 組與C 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；D 組與B、C 組比較，放電次數明顯較多（P<0.05），見表 2。
表2
各實驗組第 7、14、21 天大鼠每分鐘平均放電次數（）
Table2.
Average number of discharges per minute for rats on days 7, 14, and 21 of each experimental group ()
2.3 大鼠認知能力測評
第 7、14、21 d 監測大鼠認知能力，A、B與C 組比較差異無統計學意義（P>0.05），D 組與A、B、C 組比較，其認知能力較差（P<0.05），見表 3。
2.4 大鼠海馬 CA1 區神經元組織學
A組海馬 CA1 區神經元呈帶狀分布，細胞結構清晰、完整，胞漿透明，胞核呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，核仁清晰，形態正常，存活細胞數（235.700±11.126）/mm2。B、C 組與D 組變性損傷的神經元失去正常結構，胞體呈三角形，胞質濃縮、深染，核固縮，核仁不明顯，比較有明顯改善（P<0.05）；與A組相比 3 個實驗組大鼠海馬 CA1 區存活細胞顯著降低（P<0.05），見表 4、圖 1。
表4
各實驗組大鼠海馬區 CA1 區存活細胞數（）
Table4.
Number of viable cells in the hippocampal CA1 region of each experimental group ()
圖1
各組大鼠腦組織海馬 CA1 區神經元（HE *200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure1. Hippocampas CA1 region neurons in rats brain of four groupsa. group A; b. group B; c. group C; d. group D
3 討論
癲癇是神經系統常見的慢性疾病，臨床具有病程長且反復發作的特點，現階段對于癲癇的治療主要包括內科、外科治療及其他療法，而內科治療是最主要方法[9]，但成人癲癇患者有 25.3% 及兒童癲癇患者中 13.4% 會對 AEDs 產生耐藥，逐漸發展成頑固性癲癇[10]，其治療周期長，用藥的依從性較差，并對認知功能造成不良影響，引起記憶力下降等不良反應。
癲癇俗稱“羊癲風”，屬于中醫“癇證”范疇。《素問·至真要大論》指出“諸暴強直，皆屬于風”。認為其發病為七情失調、先天因素、六淫疫毒、腦竅外傷等，致使臟腑受傷、風痰閉阻、痰火內盛、心腎虧虛，造成神機受累、元神失控。
天漿牛黃散是一種純中藥配方，其組成為：天漿子 30 顆、人工牛黃 5 g、郁金 30 g、白帆 15 g、天竺黃 20 g、朱砂 5 g。方中天漿子、牛黃共為君藥，天漿子氣味甘，平，無毒，主治寒熱結氣，盤毒鬼癥，小兒諸癇（摘自《太平圣惠方》卷八十五）。人工牛黃，味甘，性涼，歸心、肝經，主要功效為清熱解毒，化痰定驚。郁金，味辛苦，性涼，歸肝、心、肺經，功能主治行氣解郁、涼血破瘀、胸腹脅肋諸痛、失心癲狂。天竺黃，味甘，性寒，歸心、肝經，具有清熱豁痰、涼心定驚之功效。朱砂，味甘，性微寒，歸心經，具有重鎮安神、解毒的功效，臨床用于神志不安、心悸怔忡、失眠、驚癇等癥。諸藥合用，共湊寧心安神止驚癇之功效。
天漿牛黃散因其抗癲癇作用顯著，不良反應少，應用于臨床多年，成功治療了很多癲癇患者，為此我們選取大鼠為實驗對象，建立匹羅卡品癲癇模型。匹羅卡品誘導的癲癇模型與人類癲癇發作方式極為相似，是理想的動物癲癇模型[11]。該癲癇模型大鼠海馬神經元會發生凋亡，且以 γ-氨基丁酸能神經元選擇性凋亡為主[12,13]，γ-氨基丁酸能神經遞質的傳導對癲癇發作的神經元異常放電及癲癇模型的認知和學習記憶等有影響作用[14,15]，并在突觸遞質的傳遞及突觸的自身生長中占有重要位置[16]。氯化鋰-匹羅卡品慢性癲癇模型具有制作簡便、重復性好、誘發率高、受外界干擾小、癲癇發作持續時間長等優點，己經被廣泛應用于藥物基礎實驗。本研究成功造模，通過觀察發現天漿牛黃散能減少癲癇發作的次數及持續時間，減少大鼠大腦放電次數，改善認知。我們還研究發現天漿牛黃散能減少實驗大鼠海馬區神經細胞的凋亡，與丙戊酸鈉組大鼠比較，差異無統計學意義，為臨床推廣應用提供了實驗依據。至于其抗癲癇的具體機制，可能與減少神經細胞凋亡有關，尚需進一步深入和大樣本的研究。
