引用本文： 江嬌美, 陸曉妹, 張明, 趙晶, 冷宇, 吳鵬程, 王芬. 維生素 U 對丙戊酸鈉所致大鼠腎毒性的保護作用. 癲癇雜志, 2018, 4(6): 486-491. doi: 10.7507/2096-0247.20180078 復制
癲癇是神經系統最常見的疾病之一，據統計 2015 年國內癲癇終生患病率 0～4 歲組為 4.57‰，30～34 歲組為 8.43‰，比 1990 年的患病率增加了 259% [1] 。其最有效的治療方法是長期規律地服用抗癲癇藥物（AEDs），但 AEDs 的長期使用及其所帶來的不良反應和毒副作用使臨床醫生及患者均受到很大限制。腎功能不全或腎損傷被報道為一些 AEDs 的常見副作用，如丙戊酸鈉（VPA）能誘導腎小球高濾過、腎小球功能毒性及腎小管功能障礙[2]。同樣在接受 VPA 治療的大鼠實驗中可觀察到血清堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、肌酐（Creatinine，Cr) 及尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN) 等升高[3, 4]。多數研究表明 VPA 誘導的肝腎損傷與其引發氧化應激從而導致過量活性氧簇的產生有關[5]，且活性氧（Reactive oxygen species, ROS）分子是 VPA 毒性的主要介質[6]。VPA 誘導 ROS 產生已經在相關肝毒性、神經毒性、致畸性及腎毒性中被觀察到[7-10]。因此，能夠減少活性氧簇的藥物可能具有保護甚至逆轉 VPA 所致的肝腎毒性。維生素 U（Vitamin U, Vit U) ，又稱為 S-甲基蛋氨酸（S-methyl-L-methionine，SMM），廣泛存在于卷心菜、白菜、甘藍、萵苣等綠葉蔬菜中。研究發現 Vit U 能清除自由基[11]，明顯提高肝細胞的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平[12]。有研究表明 Vit U 可防止 VPA 引起的肝損傷、晶狀體損傷，其中可能的機制同樣是氧化應激的降低[13, 14]。
綜上，我們提出假設，Vit U 可能對 VPA 誘導的腎損傷具有預防和保護作用。基于 VPA、Vit U 的來源廣泛，易于獲得，我們以大鼠為研究對象進行 Vit U 對 VPA 誘導腎損傷的預防和保護實驗，現將方法和結果報道如下，為臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
選取 6.0～6.5 月齡的健康雌性 SD 大鼠 48 只，體重 150～190 g。VPA 及 Vit U 均購自上海源葉生物有限公司，批號：S60377-100 g、S64722-25 g。實驗動物購自南昌大學動科部。所有實驗過程均獲得南昌大學倫理委員會的批準，且按相關動物實驗規定進行。
1.2 方法
于動物室適應性飼養 1 周后稱重，按體重采用完全隨機方法分為 4 組（n=12）。A 組：對照組，B 組：Vit U 組，C 組：VPA 組，D 組：VPA+Vit U 組。A 組未做任何處理，僅通過灌胃給予 0.9% 生理鹽水 10 mL/（kg·d）；B 組通過灌胃給予 Vit U 50 mg/（kg·d）；C 組通過灌胃給予 VPA 300 mg/（kg·d）；D 組給予 Vit U 50 mg/（kg·d），1 h 后給予 VPA 300 mg/（kg·d）。每天固定時間 10 點給藥, 用藥天數為 14、28 d。
1.3 采樣檢測
分別于第 14、28 天禁食過夜，水合氯醛麻醉后動脈采血。于 4 000 r 下離心 10 min（離心半徑為 5.5 cm）后提取上清液。利用全自動生化分析儀（盛世達，BS-620）檢測 Cr、BUN 及 UA。
1.4 腎組織病理學檢查
各組大鼠按（2、4 周，n=6）時間點采集血液后均開腹，取出腎臟，肉眼觀察大體情況是否有異常，沿冠狀面切成兩半，置入裝有 4% 多聚甲醛緩沖液中固定，制蠟塊切片，行 HE 染色后光鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件包進行處理。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用獨方樣本 t 檢驗。取 0.05 作為檢驗水準，以 P 值<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 實驗動物一般情況
實驗大鼠 48 只，進行 1 周時 B 組死亡 1 只，余各組大鼠全部存活致實驗取材。取血清時無血清標本脫失，樣本數 47 份（A 組 12 只，B 組 11 只，C 組 12 只，D 組 12 只）。
2.2 實驗大鼠外周血脂的變化
2 周時，于 A 組相比，B、D 組均無明顯變化，僅 C 組的 TC、TG、LDL 明顯升高；與 C 組相比，D 組的 TC、LDL 均降低。4 周時，與 A 組相比，B、D 組均無明顯變化，僅 C 組 TC、LDL 明顯升高；與 C 組相比，D 組的 TC 降低。見表 1。
表1
各組大鼠血脂水平比較（
，mmol/L)
Table1.
The level of blood lipid in each group (
，mmol/L)
2.3 實驗大鼠腎功能指標的變化
2 周時，各組的 Cr、BUN、UA 均無明顯差異。4 周時，與 A 相比，C 組 Cr、BUN、UA 升高明顯（P<0.01）；與 C 組相比，D 組的 Cr、BUN、UA 降低明顯（P<0.01）。見表 2～4。
表2
各組大鼠血清肌酐水平的比較（
，μmol/L)
Table2.
Comparison of serum creatinine levels in each group(
, μmol/L)
表3
各組大鼠血清尿素水平的比較（
，mmol/L)
Table3.
Comparison of serum urea levels in each group(
, mmol/L)
表4
各組大鼠血清尿酸水平的比較（
，μmol/L)
Table4.
Comparison of serum uric acid levels in each group (
, μmol/L)
2.4 藥物對各組大鼠血清腎損傷指標的影響
4 周時，C 組與其他三組相比血清 Cr、BUN、UA 水平均明顯增加；與 C 組相比， D 組的血清 Cr、BUN、UA 水平均明顯降低，D 組與 A 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1～3。
圖1
各組血清肌酐水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
圖2
各組血清尿素水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
圖3
各組血清尿酸水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
2.5 藥物對各組大鼠腎組織的影響
2 周時 HE 染色光鏡觀察下可見各組大鼠腎組織結構清晰，腎小球結構正常，未見明顯病理學改變。4 周時可見 A 組、B 組及 D 組的大鼠腎組織結構改變不明顯，腎小球結構正常，近曲小管上皮細胞、腎小球等未見明顯變性水腫壞死等。 C 組大鼠腎間質中多見炎性病灶。見圖 4。
圖4
4 周時各組腎組織病理學改變
A、B、D 組的腎臟組織結構均正常，C 組可見明顯炎性病灶 （10×40 倍）
Figure4. The pathological chengas of renal tissue in each group at 4 weekThe histopathological changes of kidneys in group A, B and D were normal at 4 week. There were obvious inflammatory lesions in group C（10×40）
3 討論
VPA 屬于非酶誘導劑，其對血脂代謝的影響具有爭議，對血脂的不同影響均見報道。Vyas 等[15]對相關病例進行系統回顧發現其中 4 例顯示 VPA 治療患者存在 LDL 升高，而多數研究報道顯示 VPA 對 TC 無明顯影響，除 1 例發現 TC 顯著增加以外，有報道顯示 TC 水平顯著降低。本研究結果顯示 VPA 可導致 TC 及 LDL-C 升高，這與我們之前的研究相一致[16]。我們的研究結果可看出 Vit U 具有降血脂作用，這也與其他研究報道一致。Seri 等[17]研究發現口服 Vit U 可明顯降低大鼠及兔子因飲食誘導的高脂血癥，使得血漿總膽固醇、β-脂蛋白、磷脂降低，而對血漿 TG 無明顯影響。有趣的是還有研究發現 Vit U 能顯著改善動物實驗性腎病高脂血癥，能通過增加尿量和減少尿蛋白排泄來改善腎病綜合征[18]。
本實驗研究表明 VPA 可導致腎損傷標記物，血清 Cr、BUN、UA 的水平均增高，即 VPA 誘導腎損傷發生，導致腎小球濾過率降低。這與其他相關動物實驗及臨床報道結果一致[19]。另一方面，我們的研究結果表明 2 周時，VPA 組的腎功能生化指標無明顯變化，而 4 周時，VPA 組的腎功能生化指標明顯升高，表示 VPA 誘導的腎損傷可能與 VPA 暴露時間具有一定的相關性。有實驗研究發現 VPA 會誘導小鼠腎組織出現病理形態學改變，且這種改變的嚴重程度與腎組織暴露于藥物的持續時間有關[20]，這與我們的研究結果一致。此外，即使臨床劑量是適當的，丙戊酸鈉誘導的毒性、過氧化脂質水平的增高和 GSH 的消耗是具有時間依賴性的[21]。VPA 引起的毒副作用可能也與給藥時間點有關，研究顯示接受 VPA 治療的小鼠，其 Cr、BUN 的血漿濃度顯著增高，而這種增長會根據給藥時間的不同而變化，且在黑暗活動的下半部分接受治療的小鼠增高最明顯[22]。
Vit U 是蛋氨酸的主要代謝產物，也可由蛋氨酸和 S-腺苷甲硫氨酸合成。其作用與蛋氨酸相似，是僅次于 GSH 的重要含硫化合物[23]。Vit U 可被迅速吸收且聚集在肝臟和腎臟中，有研究觀察到 Vit U 可明顯降低 GSH 及一氧化氮（NO）的血清水平，通過誘導酶及非酶的氧化防御系統扭轉 AEDs 引起的氧化應激與炎癥標志物的水平達到正常水平[24]。本研究結果也表明 Vit U 能降低 VPA 誘導的 Cr、BUN、UA 升高，提示 Vit U 對 VPA 誘導的腎毒性具有一定的預防和保護作用。故臨床上患者服用 VPA 或許可以通過預防性服用 Vit U 或日常飲食中多添加卷心菜、白菜等富含 Vit U 的綠葉蔬菜以減少藥物的不良反應，進一步提高其生活質量。
近年來關于天然抗氧化劑在生物系統中對 VPA 腎毒性的保護作用日益受到人們關注[25]，我們僅對 VPA 及其毒性作用進行初步研究，因此 Vit U 對抗 VPA 誘導腎毒性的確切機制有待進一步深入探索。
綜上，VPA、Vit U 對大鼠血脂有一定的影響，VPA 可導致 TC、LDL 升高, 而 Vit U 可降低血脂水平；VPA 誘導的腎功能損傷具有時間依賴性，Vit U 可以為 VPA 誘導的腎毒性提供保護，預防 VPA 服用過程中出現的腎損傷。
癲癇是神經系統最常見的疾病之一，據統計 2015 年國內癲癇終生患病率 0～4 歲組為 4.57‰，30～34 歲組為 8.43‰，比 1990 年的患病率增加了 259% [1] 。其最有效的治療方法是長期規律地服用抗癲癇藥物（AEDs），但 AEDs 的長期使用及其所帶來的不良反應和毒副作用使臨床醫生及患者均受到很大限制。腎功能不全或腎損傷被報道為一些 AEDs 的常見副作用，如丙戊酸鈉（VPA）能誘導腎小球高濾過、腎小球功能毒性及腎小管功能障礙[2]。同樣在接受 VPA 治療的大鼠實驗中可觀察到血清堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、肌酐（Creatinine，Cr) 及尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN) 等升高[3, 4]。多數研究表明 VPA 誘導的肝腎損傷與其引發氧化應激從而導致過量活性氧簇的產生有關[5]，且活性氧（Reactive oxygen species, ROS）分子是 VPA 毒性的主要介質[6]。VPA 誘導 ROS 產生已經在相關肝毒性、神經毒性、致畸性及腎毒性中被觀察到[7-10]。因此，能夠減少活性氧簇的藥物可能具有保護甚至逆轉 VPA 所致的肝腎毒性。維生素 U（Vitamin U, Vit U) ，又稱為 S-甲基蛋氨酸（S-methyl-L-methionine，SMM），廣泛存在于卷心菜、白菜、甘藍、萵苣等綠葉蔬菜中。研究發現 Vit U 能清除自由基[11]，明顯提高肝細胞的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平[12]。有研究表明 Vit U 可防止 VPA 引起的肝損傷、晶狀體損傷，其中可能的機制同樣是氧化應激的降低[13, 14]。
綜上，我們提出假設，Vit U 可能對 VPA 誘導的腎損傷具有預防和保護作用。基于 VPA、Vit U 的來源廣泛，易于獲得，我們以大鼠為研究對象進行 Vit U 對 VPA 誘導腎損傷的預防和保護實驗，現將方法和結果報道如下，為臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
選取 6.0～6.5 月齡的健康雌性 SD 大鼠 48 只，體重 150～190 g。VPA 及 Vit U 均購自上海源葉生物有限公司，批號：S60377-100 g、S64722-25 g。實驗動物購自南昌大學動科部。所有實驗過程均獲得南昌大學倫理委員會的批準，且按相關動物實驗規定進行。
1.2 方法
于動物室適應性飼養 1 周后稱重，按體重采用完全隨機方法分為 4 組（n=12）。A 組：對照組，B 組：Vit U 組，C 組：VPA 組，D 組：VPA+Vit U 組。A 組未做任何處理，僅通過灌胃給予 0.9% 生理鹽水 10 mL/（kg·d）；B 組通過灌胃給予 Vit U 50 mg/（kg·d）；C 組通過灌胃給予 VPA 300 mg/（kg·d）；D 組給予 Vit U 50 mg/（kg·d），1 h 后給予 VPA 300 mg/（kg·d）。每天固定時間 10 點給藥, 用藥天數為 14、28 d。
1.3 采樣檢測
分別于第 14、28 天禁食過夜，水合氯醛麻醉后動脈采血。于 4 000 r 下離心 10 min（離心半徑為 5.5 cm）后提取上清液。利用全自動生化分析儀（盛世達，BS-620）檢測 Cr、BUN 及 UA。
1.4 腎組織病理學檢查
各組大鼠按（2、4 周，n=6）時間點采集血液后均開腹，取出腎臟，肉眼觀察大體情況是否有異常，沿冠狀面切成兩半，置入裝有 4% 多聚甲醛緩沖液中固定，制蠟塊切片，行 HE 染色后光鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件包進行處理。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用獨方樣本 t 檢驗。取 0.05 作為檢驗水準，以 P 值<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 實驗動物一般情況
實驗大鼠 48 只，進行 1 周時 B 組死亡 1 只，余各組大鼠全部存活致實驗取材。取血清時無血清標本脫失，樣本數 47 份（A 組 12 只，B 組 11 只，C 組 12 只，D 組 12 只）。
2.2 實驗大鼠外周血脂的變化
2 周時，于 A 組相比，B、D 組均無明顯變化，僅 C 組的 TC、TG、LDL 明顯升高；與 C 組相比，D 組的 TC、LDL 均降低。4 周時，與 A 組相比，B、D 組均無明顯變化，僅 C 組 TC、LDL 明顯升高；與 C 組相比，D 組的 TC 降低。見表 1。
表1
各組大鼠血脂水平比較（
，mmol/L)
Table1.
The level of blood lipid in each group (
，mmol/L)
2.3 實驗大鼠腎功能指標的變化
2 周時，各組的 Cr、BUN、UA 均無明顯差異。4 周時，與 A 相比，C 組 Cr、BUN、UA 升高明顯（P<0.01）；與 C 組相比，D 組的 Cr、BUN、UA 降低明顯（P<0.01）。見表 2～4。
表2
各組大鼠血清肌酐水平的比較（
，μmol/L)
Table2.
Comparison of serum creatinine levels in each group(
, μmol/L)
表3
各組大鼠血清尿素水平的比較（
，mmol/L)
Table3.
Comparison of serum urea levels in each group(
, mmol/L)
表4
各組大鼠血清尿酸水平的比較（
，μmol/L)
Table4.
Comparison of serum uric acid levels in each group (
, μmol/L)
2.4 藥物對各組大鼠血清腎損傷指標的影響
4 周時，C 組與其他三組相比血清 Cr、BUN、UA 水平均明顯增加；與 C 組相比， D 組的血清 Cr、BUN、UA 水平均明顯降低，D 組與 A 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1～3。
圖1
各組血清肌酐水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
圖2
各組血清尿素水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
圖3
各組血清尿酸水平比較
**與 A 組相比
** compared with group A,
2.5 藥物對各組大鼠腎組織的影響
2 周時 HE 染色光鏡觀察下可見各組大鼠腎組織結構清晰，腎小球結構正常，未見明顯病理學改變。4 周時可見 A 組、B 組及 D 組的大鼠腎組織結構改變不明顯，腎小球結構正常，近曲小管上皮細胞、腎小球等未見明顯變性水腫壞死等。 C 組大鼠腎間質中多見炎性病灶。見圖 4。
圖4
4 周時各組腎組織病理學改變
A、B、D 組的腎臟組織結構均正常，C 組可見明顯炎性病灶 （10×40 倍）
Figure4. The pathological chengas of renal tissue in each group at 4 weekThe histopathological changes of kidneys in group A, B and D were normal at 4 week. There were obvious inflammatory lesions in group C（10×40）
3 討論
VPA 屬于非酶誘導劑，其對血脂代謝的影響具有爭議，對血脂的不同影響均見報道。Vyas 等[15]對相關病例進行系統回顧發現其中 4 例顯示 VPA 治療患者存在 LDL 升高，而多數研究報道顯示 VPA 對 TC 無明顯影響，除 1 例發現 TC 顯著增加以外，有報道顯示 TC 水平顯著降低。本研究結果顯示 VPA 可導致 TC 及 LDL-C 升高，這與我們之前的研究相一致[16]。我們的研究結果可看出 Vit U 具有降血脂作用，這也與其他研究報道一致。Seri 等[17]研究發現口服 Vit U 可明顯降低大鼠及兔子因飲食誘導的高脂血癥，使得血漿總膽固醇、β-脂蛋白、磷脂降低，而對血漿 TG 無明顯影響。有趣的是還有研究發現 Vit U 能顯著改善動物實驗性腎病高脂血癥，能通過增加尿量和減少尿蛋白排泄來改善腎病綜合征[18]。
本實驗研究表明 VPA 可導致腎損傷標記物，血清 Cr、BUN、UA 的水平均增高，即 VPA 誘導腎損傷發生，導致腎小球濾過率降低。這與其他相關動物實驗及臨床報道結果一致[19]。另一方面，我們的研究結果表明 2 周時，VPA 組的腎功能生化指標無明顯變化，而 4 周時，VPA 組的腎功能生化指標明顯升高，表示 VPA 誘導的腎損傷可能與 VPA 暴露時間具有一定的相關性。有實驗研究發現 VPA 會誘導小鼠腎組織出現病理形態學改變，且這種改變的嚴重程度與腎組織暴露于藥物的持續時間有關[20]，這與我們的研究結果一致。此外，即使臨床劑量是適當的，丙戊酸鈉誘導的毒性、過氧化脂質水平的增高和 GSH 的消耗是具有時間依賴性的[21]。VPA 引起的毒副作用可能也與給藥時間點有關，研究顯示接受 VPA 治療的小鼠，其 Cr、BUN 的血漿濃度顯著增高，而這種增長會根據給藥時間的不同而變化，且在黑暗活動的下半部分接受治療的小鼠增高最明顯[22]。
Vit U 是蛋氨酸的主要代謝產物，也可由蛋氨酸和 S-腺苷甲硫氨酸合成。其作用與蛋氨酸相似，是僅次于 GSH 的重要含硫化合物[23]。Vit U 可被迅速吸收且聚集在肝臟和腎臟中，有研究觀察到 Vit U 可明顯降低 GSH 及一氧化氮（NO）的血清水平，通過誘導酶及非酶的氧化防御系統扭轉 AEDs 引起的氧化應激與炎癥標志物的水平達到正常水平[24]。本研究結果也表明 Vit U 能降低 VPA 誘導的 Cr、BUN、UA 升高，提示 Vit U 對 VPA 誘導的腎毒性具有一定的預防和保護作用。故臨床上患者服用 VPA 或許可以通過預防性服用 Vit U 或日常飲食中多添加卷心菜、白菜等富含 Vit U 的綠葉蔬菜以減少藥物的不良反應，進一步提高其生活質量。
近年來關于天然抗氧化劑在生物系統中對 VPA 腎毒性的保護作用日益受到人們關注[25]，我們僅對 VPA 及其毒性作用進行初步研究，因此 Vit U 對抗 VPA 誘導腎毒性的確切機制有待進一步深入探索。
綜上，VPA、Vit U 對大鼠血脂有一定的影響，VPA 可導致 TC、LDL 升高, 而 Vit U 可降低血脂水平；VPA 誘導的腎功能損傷具有時間依賴性，Vit U 可以為 VPA 誘導的腎毒性提供保護，預防 VPA 服用過程中出現的腎損傷。
