內側顳葉癲癇（mesial temporal lobe epilepsy, mTLE）是一種嚴重的以反復癲癇發作為特征的神經系統疾病。mTLE 通常伴有海馬神經元變性導致的海馬硬化（Hippocampal sclerosis，HS）, 它是與 mTLE 患者耐藥性相關的最常見的形態學改變。對 mTLE+HS 的認識不足使其治療復雜化。mTLE+HS 的潛在病理機制可能涉及異常的基因表達調控，包括涉及微小 RNA（microRNA, miRNA）的轉錄后網絡。 miRNA 表達調控在包括癲癇的多種疾病中都有報道。但是，mTLE+HS 的 miRNA 譜暫未被完全了解，需要進一步解決。在此，為了揭示 miRNA 的異常表達，我們關注了 33 例 mTLE+HS 患者和 9 具對照者尸檢的海馬 miRNA 分析。研究中，通過聯合兩種不同的 miRNA 分析方法，以及下一代測序技術和 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應，我們顯著降低了技術相關的偏移（最常見的是 miRNA 分析數據的假陽性）。這些方法結合起來明確并驗證了 20 例癲癇患者海馬中 miRNA 的表達改變。在 mTLE+HS 患者中，有 19 例 miRNA 上調，1 例下調。其中 9 種 miRNA 以往沒有報道與癲癇有聯系，19 例異常表達的 miRNA 可能調節與癲癇相關的靶點和通路（例如：鉀離子通道，γ-氨基丁酸，神經營養因子信號傳導和軸突導向）。研究通過明確 miRNA 在 mTLE+HS 中表達，擴展了當前對 mTLE+HS 中 miRNA 介導的基因表達調控的認知，包括 9 個新發現的 miRNA 異常表達及其可能的靶點。 這些發現進一步提升了基于 microRNA 的生物標志物或療法的可能性。
引用本文： PetraBencurova, JiriBaloun, KaterinaMusilova, 張樂 譯, 慕潔 審. 微小 RNA 和伴海馬硬化的內側顳葉癲癇：人類海馬全微小 RNA 組譜. 癲癇雜志, 2018, 4(2): 162-173. doi: 10.7507/2096-0247.20180030 復制
要點
? 在最大的內側顳葉癲癇+海馬硬化患者群體中分析微小RNA譜
? 聯合了先進的微小RNA分析技術（下一代測序技術和微小RNA特異性實時定量聚合酶鏈式反應）
? 新發現了內側顳葉癲癇+海馬硬化患者中微小RNA的9種異常表達
? 對異常表達的微小RNA的mRNA靶點的預測，揭示了與癲癇相關的主要通路
顳葉癲癇（Temporal lobe epilepsy，TLE）是一種以源于顳葉皮質結構的、反復癲癇發作為特征的神經系統疾病。TLE 是一種常見的癲癇類型，占所有確診癲癇患者的 1/3。TLE 可以分為幾種亞型，包括最常見的內側顳葉癲癇（mesial Temporal lobe epilepsy，mTLE）。mTLE 通常與海馬硬化（Hippocampal sclerosis，HS）的發生以及對多種抗癲癇藥物（AEDs）耐藥的高風險相關。由于尚未完全了解 mTLE+HS 的潛在病理機制，其治療非常復雜。探究 mTLE+HS 中病理改變的標記物，如異常的微小 RNA（microRNA，miRNA）譜，可能可以更好地了解 mTLE+HS 的生物學過程，并可能潛在地運用于基于 miRNA 的治療。
miRNA 是對于絕大多數 mRNA 的轉錄后調控至關重要的小內源性非編碼 RNA。miRNA 的生物發生是一個保守的過程，通過與靶 mRNA 互補結合，產生 21～25 個核苷酸長度的產物來調控基因的表達。由于 miRNA 的調節功能，它們的動態平衡對于人腦正常發育和功能是必不可少的，它們的不平衡可能會導致各種神經病理現象。自 2010 年以來，許多關于癲癇的研究已經提供了可信的證據，表明 miRNA 在該疾病的發病機制中起一定作用。然而，大多數此類研究使用的是癲癇動物模型，只有相對較少的研究人員探討了人腦組織中的 miRNA 表達譜。
本研究描述了 mTLE+HS 患者海馬中檢測到的 33 個典型的 miRNA 表達模式，并與對照組的海馬進行比較。據我們所知，這項對 miRNA 表達的研究是迄今為止在最大范圍 mTLE+HS 患者人群上進行的。本研究采用了高端技術組合，即下一代測序（Next generation sequencing，NGS）和 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miRNA-specific quantitative real-time polymerase chain reaction，miQPCR），以獲得高度精確，特異性和對未包含在商業分析板中的 miRNA 的訪問。本研究揭示了兩種方法在腦組織 miRNA 分析中的相關性，并發現了 mTLE+HS 中新異常表達的 miRNA 及其預測的靶點（基因和生物通路）。
1 資料與方法
1.1 患者一般資料
對 2007 年–2016 年期間于捷克共和國布爾諾的圣安妮大學附屬醫院行前內側顳葉切除術患者的海馬組織進行分析。其中包括 19 例左側 mTLE（女 10，男 9）和 14 例右側 mTLE（女 6，男 8）。所有患者均因為藥物難治性轉診至布爾諾癲癇中心神經內科，并且根據國際抗癲癇聯盟（ILAE）標準（ILAE 分類和術語委員會，1989），符合 mTLE+HS 的診斷標準。所有患者磁共振成像（MRI）掃描［包括 T1、T2 和液體衰減反轉恢復序列（軸向和冠狀切片）］的結果由兩名醫師（放射科醫師和癲癇醫師）分別進行判讀，且都判讀為與腦電圖（EEG）提示的致癇灶同側的單側 HS。無患者 MRI 發現其他腦部結構病變或曾接受過顱內手術。手術平均年齡為 38.4（17～59）歲，平均病程為 22.7（1～58）年。石蠟包埋的對照海馬組織從圣安妮大學醫院法醫部的 9 例無海馬異常的尸檢病例中獲得。對照組的平均死亡年齡為 58（30～77）歲。原文鏈接表 S1 列出了患者和尸檢對照的詳細概況。所有患者都已經同意將其組織用于科學目的的研究，并且在本研究中簽署知情同意書。獲得海馬對照組織的所有程序均符合捷克共和國的立法和倫理標準，并符合 1964 年赫爾辛基宣言（2013 年修訂版）。術后的腦組織石蠟包埋，保存在圣安妮大學附屬醫院的病理解剖學第一系。該研究得到了圣安妮大學醫院倫理委員會（批準號：9G/2015-KS）的批準。
1.2 組織處理
手術切除和尸檢組織進行了相同的處理; 10%的中性福爾馬林緩沖液固定，嚴格檢查，精心定位，并測量其比例。將海馬標本沿著前后軸切成 2～3 mm 厚的組織切片。代表性組織常規處理并石蠟包埋。福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin fixed paraffin-embedded，FFPE）的組織切片用蘇木精-伊紅染色并用光學顯微鏡評估。HS 組織中神經元減少和膠質增生是通過神經元細胞核和膠質纖維酸性蛋白免疫組織化學證實。我們應用 ILAE 的 HS 分類標準。選擇顯示存在海馬復合物的石蠟包埋組織切片用于 miRNA 分析。
1.3 總 RNA 分離
使用高純度 miRNA 分離試劑盒（Roche）根據制造商的方案從 FFPE 組織切片中分離總 RNA。為了增加獲得的 RNA 產量，使用過夜蛋白酶 K 消化。從所有標本中成功提取 RNA，并使用 NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific）進行定量。使用 1.1 μg 提取的總 RNA 制備 miRNA 文庫，并在 NextSeq 500（Illumina）上測序；剩余的 RNA 進行特異性逆轉錄用于 miQPCR 分析。
1.4 下一代測序庫準備和測序
用于測序的文庫來自從 16 例隨機選擇的在 2007 年–2012 年期間接受切除術的 mTLE+HS 患者和 8 具尸檢的對照組中獲得的 1.1 μg 總 RNA，這些總 RNA 具有足夠的濃度和分離質量。根據制造商的方案使用 NEXTflex Small RNASeq 試劑盒 V2（Bioo Scientific）制備文庫。在測序之前，對每個文庫用 6%聚丙烯酰胺凝膠進行大小選擇。將 cDNA 片段在 90V 下在凝膠上分離 1 h，用溴化乙錠染色，并使用紫外透照儀顯色。長度為 150 bp 的、代表具有銜接子和條形碼序列的成熟 miRNA 片段被切下并洗脫到 PH=8.5 的 10mM Tris-HCl 緩沖液中。過濾除去凝膠殘余物后，使用 NanoDrop ND-1000 對文庫進行定量，并根據制造商的方案用于 NextSeq 500 上的測序。
1.5 下一代測序數據處理和微小 RNA 的差異表達分析
下一代測序數據處理方面，基于計數的 miRNA 表達數據由 FASTQ 文件中的 Chimira 工具產生。所有的序列都進行了適配器修整，并映射到 miRBase V21，每一個序列最多允許有兩個錯配。進一步的分析使用 R/Bioconductor 軟件包進行。差異表達分析通過兩種方法進行。首先，通過 DESeq2 方法分析原始讀數。其次，通過在 edgeR 軟件包內添加歸一化因子，并通過 limma 軟件包中的 voom 函數進一步進行樣本間標準化，以將讀數預標準化。這些軟件包主要在估計色散參數和它們遵循的標準化類型方面有所不同。DESeq2 基于所提供數據計算的均值-方差關系的分散性評估，而 edgeR 推定所有基因的共同離差。應用線性模型擬合和 eBayes 方法，篩選患者和對照樣本之間差異表達的 miRNA。簡而言之，eBayes 函數使用單個基因的線性擬合來構建分層貝葉斯模型，以估計它們的差異表達概率。它使用數據定義的全局先驗將樣本差異縮小到一個共同的值，從而提高統計的效力和準確性。使用 Benjamini-Hochberg 方法對獲得的概率值進行多重檢驗校正。將原始數據和 miRNA 文庫的注釋序列上傳到 GEO 數據庫（編號 GSE99455）。
1.6 用微小 RNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應行微小 RNA 表達分析
應用 miRNA 特異性逆轉錄方法，然后按照 Benes 等所述的 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）進行，以特異性擴增在分離 RNA 中表達的 miRNA。引物通過人工設計或從 miQPCR 引物列表中下載，根據 MIQE 指南對我們的樣品進行驗證和優化。原文鏈接表 S2 總結了經驗證的引物序列。自動移液系統 Tecan Freedom EVO 150（瑞士 Tecan）用于在 384 孔板中制備 miQPCR 反應。使用 SensiFast HI-ROX 試劑盒（Bioline）在 QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific）上進行所選 miRNA 的表達分析。擴增的方案是 95℃5 min，接著 45 個循環的 95℃10 s，60～65℃10 s 和 72℃10 s。使用由 QuantStudio 12K Flex 軟件執行的基線閾值算法來定義單個 miRNA 的循環閾值（Cycle threshold，Ct）。Ct 值范圍為 20～32，Ct 值>32 被認為是背景噪音。33 例 mTLE+HS 患者和 9 具尸檢對照組織中的 miRNA 表達水平用四種技術重復測定。所研究的 miRNA 的相對轉錄使用以往由 Livak 和 Schmittgen 描述的 2–ΔΔCT 方法從 Ct 值計算。使用內源性對照（RNU6B）進行標準化。用沒有多重比較校正的 Mann-Whitney U 檢驗方法來比較患者和對照組之間的 miRNA 水平。以P 值<0.05 為差異有統計學意義。
1.7 計算機上的微小 RNA 靶點預測
靶點搜索工具（http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi）用于生成由新明確的在 mTLE+HS 中有差異表達的 miRNA 調控的靶向基因列表。通過 DIANA-miRPath 軟件的聯合算法建立顯著富集異常表達的 miRNA 靶向基因的途徑。DIANA-miRPath 執行 miRNA 途徑分析，能提供準確的數據統計，同時能夠適應先進的傳遞途徑。miRPath 可以利用由 DIANA-microT-CDS 算法提供的預測的 miRNA 靶點和/或來自 DIANA-TarBase V6.0.18 的實驗驗證的 miRNA 相互作用。
2 結果
2.1 海馬組織全微小 RNA 組表達譜
本研究利用 NGS 揭示了 16 例 mTLE+HS 患者和 8 具尸檢對照的 miRNA 表達譜（每個樣本覆蓋的未處理讀數的中位數為 1 080 萬個）。在針對 miRBase V21 進行的適配器修整和 miRNA 的映射之后，miRNA 占總讀數的 12%（每個樣本平均 150 萬個 miRNA 讀取）。NGS 平臺確定了 1 962 個 miRNA 種類，其中有 422 個 miRNA 存在，所有樣品的覆蓋度>500 個。使用 PHRED-like 評分評估測序讀數的質量，其顯示 98.5%的讀值>30，代表非常好的測序質量。不明確的堿基含量占總堿基的比例<0.01%。
通過聚類分析評估樣品，并使用差異表達分析在 mTLE+HS 中搜索具有表達改變的 miRNA。首先，使用 Spearman 相關性進行單向聚類分析，以驗證患者和對照樣本的正確區分，我們觀察到 4 例患者的文庫與對照交集在一起。出于這個原因，進一步分析這些有問題的庫讀取分布，沒有發現分散的讀取分布，從而證實它們適用于以下分析。缺乏明確的區分表明極少數 miRNA 在這些患者和對照之間差異表達，并且 miRNA 以非常低的水平表達。接下來，使用兩個差異表達分析，即 DESeq2 和 edgeR，來明確在 mTLE+HS 中具有表達改變的 miRNA。兩種統計方法在明確差異表達的 miRNA 方面是一致的；然而，DESeq2（67 個 miRNAs 的 P<0.01，40 個 miRNAs 的P=0.01～0.05）比 edgeR（32 個 miRNAs 的 P<0.01，15 個 miRNAs 的P=0.01～0.05）鑒定出更多候選 miRNA。差異表達分析顯示 mTLE+HS 中性別特異性的 miRNA 的表達水平沒有改變。這個分析顯示年齡和 miRNA 表達之間沒有相關性。只有年齡>60 歲的對照組的 miR-7110-3p 上調（P=0.028），并在后續分析中剔除（數據未顯示）。重要的是，本研究數據中的 miRNA 在對照樣本的尸檢延遲期間表現出穩定的分布。本研究未觀察到任何尸檢延遲相關的 miRNA 水平降低，表明樣本中 miRNA 的水平保持高度穩定，并且尸檢延遲對對照樣本中的 miRNA 表達沒有影響。本研究對成年雄性大鼠進行了額外的分析，解釋了 0～32 h 的尸檢延遲周期的 miRNA 穩定性，并觀察到隨著尸檢延遲時間的增加，miRNA 水平沒有降低。對神經元特異性和神經元富集的 miRNA 的分析顯示，患者和對照樣本中海馬的細胞組成沒有顯著差別。
2.2 通過微小 RNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應驗證微小 RNA 組測序
用于 miRNA 測序的 NGS 平臺（miRNASeq）具有幾個技術缺點，可能導致技術相關偏倚。這些包括數據檢測的假陽性，可能主要是由低目標讀數或映射錯誤引起的。本研究通過比較相同人群 miRNA 表達譜的 miRNA-Seq 分析結果和 miQPCR 分析結果［用于 miRNA 量化的實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法］，以減少假陽性。使用 miQPCR 來評估根據 NGS 表達數據和文獻選擇的子集中的 miRNA 表達。根據以下標準選擇 39 個 miRNAs：① 所有樣品的總讀數>500；② DESeq2 中P<0.01 的；③ 表達差異倍數>1.4（圖 1）。研究還增加了 3 個在 edgeR 分析中有顯著性，但在 DESeq2 中沒有顯著性的 miRNAs；在 DESeq2 分析中，有 8 個 miRNAs 為 P=0.01～0.05，預測與癲癇相關的靶點；還有 11 個以往與癲癇相關的 miRNAs，但在本研究的 miRNA-Seq 分析中無顯著性。因此，選擇用于進一步分析的 miRNAs 總數為 61。
圖1
熱圖顯示選定的 miRNAs 的表達和聚類分析的可視化結果
熱圖顯示了 39 個 miRNAs 的表達，這些 miRNAs 根據它們在伴海馬硬化（mTLE+HS）中改變的轉錄進行選擇，通過 miRNA 測序明確。每行代表 1 個 miRNA，每列代表 1 個來自患者和對照的樣本。表達被計算為標準化讀數與對照組標準化讀數中位數之間的差異。數值繼之被轉換為常用對數值。紅色和藍色分別表示高于和低于對照表達的中位數。此外，熱圖描繪了基于差異表達分析計算的雙向有序 miRNA 和樣本聚類分析的結果。miRNA 聚類樹狀圖展示在左側，并顯示了具有相似表達調節的聚簇 miRNAs。樣本聚類樹狀圖展示在頂部，并對對照組和患者樣本分組展示
在技術驗證步驟中，為選定的 miRNA 優化了 miQPCR 引物（遵循 MIQE 指南）。4 種引物的驗證是不可能的，因為它們具有高的鳥嘌呤-胞嘧啶含量，并且它們與其他豐富的 miRNA 有相似的序列。此外，miRNA 由于其高 Ct 值（>34），超過了 qRT-PCR 的可靠范圍而被排除。本研究共驗證 30 個 miRNAs 的表達譜（表 1），包括從文獻中選擇的“無顯著性”的 miRNAs.
表1
在內側顳葉癲癇+海馬硬化中差異表達微小 RNAs
為了評估 NGS 和 miQPCR 平臺之間的一致性，研究比較了兩個平臺評估的各個樣品中 miRNA 的差異倍數，并且還將它們的整體表達水平可視化（圖 2a）。測量的 miRNA 低濃度接近 miQPCR 方法的檢測極限，可能導致儀器誤差，影響 Ct 值和一些測量中的差異倍數。雖然這些測量結果超出了最佳趨勢，但兩個平臺的圖形差異倍數比較總體上呈現了良好的相關性（圖 2b）。
圖2
下一代測序（NGS）和 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）平臺之間的測量結果和 miRNA 差異倍數的一致性
通過 DESeq2 分析 miRNA 測序（miRNA-Seq）倍數變化。miQPCR 倍數變化的計算基于用 2–ΔΔCt 方法比較的相對表達水平。RNU6B 作為 miQPCR 的內源性對照。差異倍數被轉換成它們的 log2 值。a. 所有樣品中 miRNA-Seq 平臺和 miQPCR 之間測量的差異倍數的比較。該圖也顯示了整體表達水平（E），由氣泡大小體現（較大的氣泡代表較高的表達水平）。全局表達水平計算為用于構建 MA 圖的 log2 強度的平均值，其通常用于使微陣列數據可視化。在該可視化中，強度用標準化讀數代替，并且總體表達水平被定義為 E = 1/2log2（RG），其中 R 是參考樣品（S17）的標準化讀數（miRNA），并且 G 是分析的樣品中的標準化讀數（miRNA）；b. miRNA-Seq 和 miQPCR 平臺之間的 miRNA 差異倍數的比較通過選擇 miRNAs 用于技術驗證。圖中的虛線表示選擇用于技術驗證分析的 miRNAs 的線性相關性
為了證實所有用于技術驗證的 miRNAs 的表達模式（選自 miRNA-Seq 和文獻），本研究對驗證隊列的另外 17 例 mTLE+HS 患者腦組織樣本（表 1）進行了 miQPCR 表達分析。這一分析驗證了 26 個 miRNAs 的表達，而經 miRNA-Seq 明確并經技術驗證證實存在表達改變的 miR-184，miR-6131 和 miR-19b-3p 在驗證隊列中未被證實。相反，miR-134-5p 僅在驗證隊列中有表達水平改變，但在 miRNA-Seq 中無表達的改變，有文獻報道 miR-193a-5p，miR-320e 和 miR-490-3p 在 miQPCR 檢測中有 1.7 倍及以上差異倍數的患者均有升高（P<0.01）。
2.3 在內側顳葉癲癇+海馬硬化海馬中微小 RNA 差異表達
綜上所述，經過嚴格分析已經證實了 26 種 miRNA 的表達趨勢。在 mTLE+HS 中 20 個 miRNAs 呈現出改變的表達模式，19 個在海馬中上調，1 個下調（表 1）。通過 NGS 和 miQPCR 都觀察到，在 9 個與癲癇新相關的 miRNAs 中，有 1.8 倍或更高的表達差異倍數（圖 3）。在選自文獻的 6 種 miRNA 中，未檢測到患者和對照之間表達的顯著變化（除了 miR-132-p 和 miR-301a-3p，其僅在 DESeq2 中有顯著性）。
圖3
通過 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）新鑒定的具有表達改變的 miRNAs 的相對表達分析
相對表達使用 miQPCR 平臺在對照（Control），技術驗證隊列（Cohort 1）和驗證隊列（Cohort 2）中確定，并且每個點代表每個樣品 4 個技術重復的平均值。紅線表示相對表達的中位數。使用 Mann-Whitney U 檢驗方法比較對照與技術驗證隊列或驗證隊列不同表達水平的差異顯著性，并且在組上方顯示
2.4 微小 RNA 靶點預測和通路分析
使用 miRNA 靶點搜索工具（mirDB），研究產生了新明確的在 mTLE+HS 中具有表達水平改變的潛在 miRNA 靶基因列表。表 2 呈現了與神經元功能相關的目標分數>90 的靶點基因庫（在癲癇中具有潛在影響）。
表2
新明確的表達改變的微小 RNA 的基因靶點
本研究使用 DIANA-miRPath V3 工具來識別異常表達的 miRNA 和受影響途徑的潛在靶點。該軟件發現了數十個可能受到 mTLE+HS 中 miRNA 表達改變所影響的途徑。大多數受影響的基因與分子信號傳導（Wnt-，ErbB-，p53，mTOR，PI3-Akt，MAPK-等）和癌癥（肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑素瘤）相關通路有關。此外，以前與癲癇和神經元功能或大腦發育有關的幾種途徑［軸突誘導，神經營養因子信號傳導途徑，γ-氨基丁酸（GABA）能突觸，鞘脂信號傳導途徑和 SNARE 在囊泡運輸中的相互作用］被認為是 9 個或更多差異表達 miRNAs 的靶點（P<0.05）；見表 3。
表3
可能受內側顳葉癲癇+海馬硬化中表達改變的 miRNAs 調控的癲癇相關通路和涉及的基因
3 討論
這項研究建立在越來越多的證據基礎上表明，miRNAs 從根本上與癲癇的病理生理及促進癲癇發作有關。這項研究的獨特之處在于使用 NGS 在至今為止最大的隊列人群（n=33）中對全人類海馬 miRNA 組學進行全面評估分析，以明確 miRNA 可能與 mTLE+HS 的病理學相關。采用技術上獨立的平臺（NGS 和 miQPCR）來鑒定和量化 miRNA，從而發現新的在 mTLE+HS 中具有表達改變的 miRNAs。在癲癇中廣泛研究的多種 miRNA（如：miR-146a，miR-132-3p，miR-132-5p，miR-134-5p）在本研究的患者中卻沒有表現出表達水平的變化，這意味著 mTLE+HS 中獨特的 miRNA 海馬表達譜，如之前 Kan 等研究所示。盡管這些 miRNA 在 mTLE+HS 中未被檢測到差異表達，但在我們的研究中，mTLE+HS 患者中表達改變的 miRNA 與已發表的關于這些 miRNA 在癲癇中的數據一致。利用計算機分析探索了潛在的 mRNA 靶點和受發現 miRNA 影響的生物學途徑，發現了幾個候選點，其異常表達可能參與了 mTLE+HS 病理。我們研究還調查了 miRNA-Seq 和 miQPCR 結果在評估癲癇腦組織中 miRNA 的一致性。
測序無引物偏倚或需要物種注釋，可以完整評估所有 miRNA。文獻指出了 miRNA 測序中的缺點，并建議通過其他方法驗證獲得的結果。為此，我們研究將 miRNA-Seq 結果與 miQPCR 進行比較，miQPCR 是一種利用 qRT-PCR 定量 miRNA 的創新方法。這些方法之間的差異表達分析的交叉比較報道的測量值差異倍數變化范圍在 1.4 倍以內。這些測量方法用于 miRNA，而沒有表達改變或代表生物學變異。樣本中拷貝數較低的 miRNAs 也會引起變異，這可能會增加儀器誤差。另外，樣品中的低 miRNA 濃度可能影響 miQPCR 測量結果，導致低于 NGS 分析的差異倍數。
總體而言，以往已有關于 qRT-PCR 和 miRNA 測序平臺之間的不一致性的研究。雖然一般認為，對于高質量的標本，平臺內變異性通常是最小的，但跨平臺比較不一定完全相關。這兩個平臺之間的不完全一致可能是由于 NGS 管道中包含的前置放大步驟所引入的靈敏度不同，這在 miQPCR 中是不存在的。前置放大和更寬松的映射參數（每次讀取允許兩個不匹配）可能引入了導致 miRNA 檢測假陽性的偏差。此外，差異倍數比較（圖 2b）顯示兩種方法之間只有很少的差異，而有很強的總體相關性。應用兩種不同的 miRNA 分析方法來提高分析的選擇性和結果的可靠性。
除了對 24 例患者進行 NGS 分析并在技術驗證中進行證實之外，還在另外 17 例 mTLE+HS 患者樣本進行了驗證。該驗證隊列證實了與技術驗證中證實的表達模式相同的 26 種 miRNAs。miR-129-1-3p，miR-129-2-3p，miR-193b-3p，miR-195-5p，miR-374b 5p 和 miR-451a 的上調與以往對 mTLE+HS 的癲癇患者或其他亞型癲癇患者進行的研究一致。本研究還發現了至今為止僅在嚙齒動物模型的研究中有相同上調結果的 miRNA（miR-142-3p，miR-142-5p，miR-144-5p，miR 150-5p 和 miR-874-3p）。本研究的列表包括與其他神經病理相關的 miRNA，如：阿爾茨海默病（miR-142-3p，miR-142-5p 和 miR-191-5p），帕金森病（miR-339-5p），中風（miR-1275）和腦損傷（miR-144-5p）。此外，本研究還明確了幾種以往前未曾報道與神經疾病相關的 miRNA（miR-1260a，miR-1260b，miR-4443，miR-4454，miR-4792 和 miR-6087），但是它們在癌癥，胚胎細胞等中有調節改變。此外，以往檢測到 miRNA 451a 在神經元中特異性地富集；miR-142-3p，miR-142-5p 和 miR-150-5p 在小膠質細胞中富集和 miR-193 在星形膠質細胞中富集。所有前面提到的 miRNA 都可能成為新療法的靶點，或者可能影響 mTLE+HS 形成的途徑。計算機分析表明這些 miRNA 存在于各種途徑和疾病中; 然而，它們在 mTLE+HS 中的因果關系尚不清楚，需要通過其他的功能分析來證實。
6 個在 mTLE+HS 樣品中兩種方法檢測均無異常調節的 miRNAs（miR-146a-5p、miR-132-5p、miR-16-5p、miR-301a-3p、miR-138-2-3p 和 miR-138-5p），在以往關于癲癇的報道中有差異表達。不同技術方法（如樣品制備）、樣品類型（如組織）、研究的物種（如嚙齒動物）和不同研究中探究的癲癇亞型不同可能導致 miRNA 譜的變化。在這項研究中，海馬樣品被儲存為 FFPE 塊，這樣便于處理，節約長期存儲的成本，并且更方便獲取使用。石蠟包埋過程會切段 mRNA，然而，此樣品處理不會影響 miRNA 的質量和數量。本研究專注于特定的癲癇亞型，mTLE+HS，與非硬化或周圍腦組織相比，它改變了細胞組成，并導致了 miRNA 譜的改變。此外，已知模式生物與人類的表達譜略有不同，因此嚙齒動物癲癇模型中的 miRNA 水平可能與癲癇患者中所明確的不同。在大多數已發表的研究中，通過預定的分析測定方法（TaqMan 分析、Exiqon 分析、微陣列等）分析 miRNA 譜，其受到所選引物/探針的限制并易于曲解 miRNA 異構體。所有 miRNA 分析平臺（NGS、qRT-PCR、微陣列等）對檢測和量化參與疾病的所有 miRNA 的能力有限。因此，在 miRNA-Seq 和 miQPCR 分析中觀察到的差異強調了用其他定量方法來驗證每個平臺的結果的必要性，因為，每個平臺的局限性會導致假陽性或假陰性檢測結果。盡管有技術上的優勢，但理論上，一些 miRNA 可能僅在特定的海馬亞區有低倍數變化的失調，而可能被其他亞區未改變的表達所掩蓋。這種 miRNA 在本研究的分析中將認為是無顯著性的。
由于基因的表達依賴于細胞中存在的 miRNA 的微妙平衡，特定 miRNA 的異常升高或下調可能影響基因和通路，導致病理學改變。本研究應用了組合分析和預測軟件，即 miRDB 和 miRPath，揭示了一系列 mTLE+HS 中改變的 miRNA 靶向的預測基因和通路。
miRDB 明確了一系列潛在的 miRNA 靶點，這些 miRNA 靶點是在 mTLE+HS 患者中新發現的具有表達改變的 miRNAs（表 2）。這 9 個 miRNAs 中有 4 個可能抑制鉀離子通道，以及它們的亞基和相互作用蛋白的基因表達，從而支持現行的癲癇起源的鉀離子假說。miRPath 軟件顯示，表達改變的 20 個 miRNAs 中的 11 個可能影響 GABA 通路，GABA 通路是另一個廣泛接受的與癲癇起源和發作相關的假說。GABA 能突觸通路代表了哺乳動物中樞神經系統中最豐富的抑制性神經傳遞，并且曾在多項研究中認為與癲癇相關（DiNuzzo 等人綜述）。miRPath 軟件還明確了可能受差異表達的 miRNA 影響的幾十種通路（例如信號傳導，癌癥等）。表 3 包含了以往與神經元功能和癲癇相關的通路子集。軸突引導是形成神經元網絡的關鍵階段，并在影響細胞骨架組織的多種因素（如：軸突生長誘向因子，軸突導向因子）中引導軸突。靶向軸突的不準確性可能導致新形成的神經元連接嚴重功能障礙，例如軸突導向因子 3A 的下調促進癲癇海馬的苔蘚纖維出芽。與軸突引導密切相關的是神經營養因子信號傳導，其使用營養因子家族（神經營養因子）來控制神經細胞的分化，生存和重塑，并可能影響興奮性。在囊泡運輸中鞘脂信號和 SNARE 相互作用促進對于包括神經元網絡發育和維持在內的不同生物事件所必需的細胞內運輸過程，并且它們的不平衡可能導致嚴重的神經障礙（例如精神分裂癥、阿爾茨海默病、癲癇）。以往已有所有上述通路和 mTLE+HS 和/或其他癲癇亞型間聯系的研究。然而，這些計算機分析結果需要進一步通過細胞培養和動物模型的功能實驗來證實。
總之，本研究使用 miRNA-Seq 和 miQPCR 平臺評估了來自 mTLE+HS 患者（n=33）和尸檢對照（n=9）的海馬組織中的 miRNA 組成。據我們所知，本研究的 miRNA 譜分析是在迄今為止最大的 mTLE+HS 患者隊列中進行的。研究對單個樣品進行測序，并明確了>100 個患者中表達改變的 miRNAs。對兩組患者的驗證分析發現了在以往研究中發表的 11 個 miRNAs 的上調，并發現通常與癲癇相關的 6 個 miRNAs 在 mTLE+HS 中無表達異常。本研究發現了 9 個可能與 mTLE+HS 相關的 miRNAs，這些 miRNAs 以往尚未報道與與癲癇相關。此外，這些 miRNAs 的計算機分析顯示它們可以靶向與神經元粘附，離子通道或突觸囊泡運輸相關的基因和通路，且它們的破壞可能涉及 mTLE+HS 或其他癲癇亞型的誘導。雖然我們研究的重點是 HS 患者，但對 HS 和無 HS 患者進行前瞻性比較分析可能會提供對癲癇病理學的新觀點。
最后，對異常表達的 miRNA 及其相關靶點的進一步研究可能會提高對癲癇的理解和治療。
要點
? 在最大的內側顳葉癲癇+海馬硬化患者群體中分析微小RNA譜
? 聯合了先進的微小RNA分析技術（下一代測序技術和微小RNA特異性實時定量聚合酶鏈式反應）
? 新發現了內側顳葉癲癇+海馬硬化患者中微小RNA的9種異常表達
? 對異常表達的微小RNA的mRNA靶點的預測，揭示了與癲癇相關的主要通路
顳葉癲癇（Temporal lobe epilepsy，TLE）是一種以源于顳葉皮質結構的、反復癲癇發作為特征的神經系統疾病。TLE 是一種常見的癲癇類型，占所有確診癲癇患者的 1/3。TLE 可以分為幾種亞型，包括最常見的內側顳葉癲癇（mesial Temporal lobe epilepsy，mTLE）。mTLE 通常與海馬硬化（Hippocampal sclerosis，HS）的發生以及對多種抗癲癇藥物（AEDs）耐藥的高風險相關。由于尚未完全了解 mTLE+HS 的潛在病理機制，其治療非常復雜。探究 mTLE+HS 中病理改變的標記物，如異常的微小 RNA（microRNA，miRNA）譜，可能可以更好地了解 mTLE+HS 的生物學過程，并可能潛在地運用于基于 miRNA 的治療。
miRNA 是對于絕大多數 mRNA 的轉錄后調控至關重要的小內源性非編碼 RNA。miRNA 的生物發生是一個保守的過程，通過與靶 mRNA 互補結合，產生 21～25 個核苷酸長度的產物來調控基因的表達。由于 miRNA 的調節功能，它們的動態平衡對于人腦正常發育和功能是必不可少的，它們的不平衡可能會導致各種神經病理現象。自 2010 年以來，許多關于癲癇的研究已經提供了可信的證據，表明 miRNA 在該疾病的發病機制中起一定作用。然而，大多數此類研究使用的是癲癇動物模型，只有相對較少的研究人員探討了人腦組織中的 miRNA 表達譜。
本研究描述了 mTLE+HS 患者海馬中檢測到的 33 個典型的 miRNA 表達模式，并與對照組的海馬進行比較。據我們所知，這項對 miRNA 表達的研究是迄今為止在最大范圍 mTLE+HS 患者人群上進行的。本研究采用了高端技術組合，即下一代測序（Next generation sequencing，NGS）和 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miRNA-specific quantitative real-time polymerase chain reaction，miQPCR），以獲得高度精確，特異性和對未包含在商業分析板中的 miRNA 的訪問。本研究揭示了兩種方法在腦組織 miRNA 分析中的相關性，并發現了 mTLE+HS 中新異常表達的 miRNA 及其預測的靶點（基因和生物通路）。
1 資料與方法
1.1 患者一般資料
對 2007 年–2016 年期間于捷克共和國布爾諾的圣安妮大學附屬醫院行前內側顳葉切除術患者的海馬組織進行分析。其中包括 19 例左側 mTLE（女 10，男 9）和 14 例右側 mTLE（女 6，男 8）。所有患者均因為藥物難治性轉診至布爾諾癲癇中心神經內科，并且根據國際抗癲癇聯盟（ILAE）標準（ILAE 分類和術語委員會，1989），符合 mTLE+HS 的診斷標準。所有患者磁共振成像（MRI）掃描［包括 T1、T2 和液體衰減反轉恢復序列（軸向和冠狀切片）］的結果由兩名醫師（放射科醫師和癲癇醫師）分別進行判讀，且都判讀為與腦電圖（EEG）提示的致癇灶同側的單側 HS。無患者 MRI 發現其他腦部結構病變或曾接受過顱內手術。手術平均年齡為 38.4（17～59）歲，平均病程為 22.7（1～58）年。石蠟包埋的對照海馬組織從圣安妮大學醫院法醫部的 9 例無海馬異常的尸檢病例中獲得。對照組的平均死亡年齡為 58（30～77）歲。原文鏈接表 S1 列出了患者和尸檢對照的詳細概況。所有患者都已經同意將其組織用于科學目的的研究，并且在本研究中簽署知情同意書。獲得海馬對照組織的所有程序均符合捷克共和國的立法和倫理標準，并符合 1964 年赫爾辛基宣言（2013 年修訂版）。術后的腦組織石蠟包埋，保存在圣安妮大學附屬醫院的病理解剖學第一系。該研究得到了圣安妮大學醫院倫理委員會（批準號：9G/2015-KS）的批準。
1.2 組織處理
手術切除和尸檢組織進行了相同的處理; 10%的中性福爾馬林緩沖液固定，嚴格檢查，精心定位，并測量其比例。將海馬標本沿著前后軸切成 2～3 mm 厚的組織切片。代表性組織常規處理并石蠟包埋。福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin fixed paraffin-embedded，FFPE）的組織切片用蘇木精-伊紅染色并用光學顯微鏡評估。HS 組織中神經元減少和膠質增生是通過神經元細胞核和膠質纖維酸性蛋白免疫組織化學證實。我們應用 ILAE 的 HS 分類標準。選擇顯示存在海馬復合物的石蠟包埋組織切片用于 miRNA 分析。
1.3 總 RNA 分離
使用高純度 miRNA 分離試劑盒（Roche）根據制造商的方案從 FFPE 組織切片中分離總 RNA。為了增加獲得的 RNA 產量，使用過夜蛋白酶 K 消化。從所有標本中成功提取 RNA，并使用 NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific）進行定量。使用 1.1 μg 提取的總 RNA 制備 miRNA 文庫，并在 NextSeq 500（Illumina）上測序；剩余的 RNA 進行特異性逆轉錄用于 miQPCR 分析。
1.4 下一代測序庫準備和測序
用于測序的文庫來自從 16 例隨機選擇的在 2007 年–2012 年期間接受切除術的 mTLE+HS 患者和 8 具尸檢的對照組中獲得的 1.1 μg 總 RNA，這些總 RNA 具有足夠的濃度和分離質量。根據制造商的方案使用 NEXTflex Small RNASeq 試劑盒 V2（Bioo Scientific）制備文庫。在測序之前，對每個文庫用 6%聚丙烯酰胺凝膠進行大小選擇。將 cDNA 片段在 90V 下在凝膠上分離 1 h，用溴化乙錠染色，并使用紫外透照儀顯色。長度為 150 bp 的、代表具有銜接子和條形碼序列的成熟 miRNA 片段被切下并洗脫到 PH=8.5 的 10mM Tris-HCl 緩沖液中。過濾除去凝膠殘余物后，使用 NanoDrop ND-1000 對文庫進行定量，并根據制造商的方案用于 NextSeq 500 上的測序。
1.5 下一代測序數據處理和微小 RNA 的差異表達分析
下一代測序數據處理方面，基于計數的 miRNA 表達數據由 FASTQ 文件中的 Chimira 工具產生。所有的序列都進行了適配器修整，并映射到 miRBase V21，每一個序列最多允許有兩個錯配。進一步的分析使用 R/Bioconductor 軟件包進行。差異表達分析通過兩種方法進行。首先，通過 DESeq2 方法分析原始讀數。其次，通過在 edgeR 軟件包內添加歸一化因子，并通過 limma 軟件包中的 voom 函數進一步進行樣本間標準化，以將讀數預標準化。這些軟件包主要在估計色散參數和它們遵循的標準化類型方面有所不同。DESeq2 基于所提供數據計算的均值-方差關系的分散性評估，而 edgeR 推定所有基因的共同離差。應用線性模型擬合和 eBayes 方法，篩選患者和對照樣本之間差異表達的 miRNA。簡而言之，eBayes 函數使用單個基因的線性擬合來構建分層貝葉斯模型，以估計它們的差異表達概率。它使用數據定義的全局先驗將樣本差異縮小到一個共同的值，從而提高統計的效力和準確性。使用 Benjamini-Hochberg 方法對獲得的概率值進行多重檢驗校正。將原始數據和 miRNA 文庫的注釋序列上傳到 GEO 數據庫（編號 GSE99455）。
1.6 用微小 RNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應行微小 RNA 表達分析
應用 miRNA 特異性逆轉錄方法，然后按照 Benes 等所述的 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）進行，以特異性擴增在分離 RNA 中表達的 miRNA。引物通過人工設計或從 miQPCR 引物列表中下載，根據 MIQE 指南對我們的樣品進行驗證和優化。原文鏈接表 S2 總結了經驗證的引物序列。自動移液系統 Tecan Freedom EVO 150（瑞士 Tecan）用于在 384 孔板中制備 miQPCR 反應。使用 SensiFast HI-ROX 試劑盒（Bioline）在 QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific）上進行所選 miRNA 的表達分析。擴增的方案是 95℃5 min，接著 45 個循環的 95℃10 s，60～65℃10 s 和 72℃10 s。使用由 QuantStudio 12K Flex 軟件執行的基線閾值算法來定義單個 miRNA 的循環閾值（Cycle threshold，Ct）。Ct 值范圍為 20～32，Ct 值>32 被認為是背景噪音。33 例 mTLE+HS 患者和 9 具尸檢對照組織中的 miRNA 表達水平用四種技術重復測定。所研究的 miRNA 的相對轉錄使用以往由 Livak 和 Schmittgen 描述的 2–ΔΔCT 方法從 Ct 值計算。使用內源性對照（RNU6B）進行標準化。用沒有多重比較校正的 Mann-Whitney U 檢驗方法來比較患者和對照組之間的 miRNA 水平。以P 值<0.05 為差異有統計學意義。
1.7 計算機上的微小 RNA 靶點預測
靶點搜索工具（http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi）用于生成由新明確的在 mTLE+HS 中有差異表達的 miRNA 調控的靶向基因列表。通過 DIANA-miRPath 軟件的聯合算法建立顯著富集異常表達的 miRNA 靶向基因的途徑。DIANA-miRPath 執行 miRNA 途徑分析，能提供準確的數據統計，同時能夠適應先進的傳遞途徑。miRPath 可以利用由 DIANA-microT-CDS 算法提供的預測的 miRNA 靶點和/或來自 DIANA-TarBase V6.0.18 的實驗驗證的 miRNA 相互作用。
2 結果
2.1 海馬組織全微小 RNA 組表達譜
本研究利用 NGS 揭示了 16 例 mTLE+HS 患者和 8 具尸檢對照的 miRNA 表達譜（每個樣本覆蓋的未處理讀數的中位數為 1 080 萬個）。在針對 miRBase V21 進行的適配器修整和 miRNA 的映射之后，miRNA 占總讀數的 12%（每個樣本平均 150 萬個 miRNA 讀取）。NGS 平臺確定了 1 962 個 miRNA 種類，其中有 422 個 miRNA 存在，所有樣品的覆蓋度>500 個。使用 PHRED-like 評分評估測序讀數的質量，其顯示 98.5%的讀值>30，代表非常好的測序質量。不明確的堿基含量占總堿基的比例<0.01%。
通過聚類分析評估樣品，并使用差異表達分析在 mTLE+HS 中搜索具有表達改變的 miRNA。首先，使用 Spearman 相關性進行單向聚類分析，以驗證患者和對照樣本的正確區分，我們觀察到 4 例患者的文庫與對照交集在一起。出于這個原因，進一步分析這些有問題的庫讀取分布，沒有發現分散的讀取分布，從而證實它們適用于以下分析。缺乏明確的區分表明極少數 miRNA 在這些患者和對照之間差異表達，并且 miRNA 以非常低的水平表達。接下來，使用兩個差異表達分析，即 DESeq2 和 edgeR，來明確在 mTLE+HS 中具有表達改變的 miRNA。兩種統計方法在明確差異表達的 miRNA 方面是一致的；然而，DESeq2（67 個 miRNAs 的 P<0.01，40 個 miRNAs 的P=0.01～0.05）比 edgeR（32 個 miRNAs 的 P<0.01，15 個 miRNAs 的P=0.01～0.05）鑒定出更多候選 miRNA。差異表達分析顯示 mTLE+HS 中性別特異性的 miRNA 的表達水平沒有改變。這個分析顯示年齡和 miRNA 表達之間沒有相關性。只有年齡>60 歲的對照組的 miR-7110-3p 上調（P=0.028），并在后續分析中剔除（數據未顯示）。重要的是，本研究數據中的 miRNA 在對照樣本的尸檢延遲期間表現出穩定的分布。本研究未觀察到任何尸檢延遲相關的 miRNA 水平降低，表明樣本中 miRNA 的水平保持高度穩定，并且尸檢延遲對對照樣本中的 miRNA 表達沒有影響。本研究對成年雄性大鼠進行了額外的分析，解釋了 0～32 h 的尸檢延遲周期的 miRNA 穩定性，并觀察到隨著尸檢延遲時間的增加，miRNA 水平沒有降低。對神經元特異性和神經元富集的 miRNA 的分析顯示，患者和對照樣本中海馬的細胞組成沒有顯著差別。
2.2 通過微小 RNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應驗證微小 RNA 組測序
用于 miRNA 測序的 NGS 平臺（miRNASeq）具有幾個技術缺點，可能導致技術相關偏倚。這些包括數據檢測的假陽性，可能主要是由低目標讀數或映射錯誤引起的。本研究通過比較相同人群 miRNA 表達譜的 miRNA-Seq 分析結果和 miQPCR 分析結果［用于 miRNA 量化的實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法］，以減少假陽性。使用 miQPCR 來評估根據 NGS 表達數據和文獻選擇的子集中的 miRNA 表達。根據以下標準選擇 39 個 miRNAs：① 所有樣品的總讀數>500；② DESeq2 中P<0.01 的；③ 表達差異倍數>1.4（圖 1）。研究還增加了 3 個在 edgeR 分析中有顯著性，但在 DESeq2 中沒有顯著性的 miRNAs；在 DESeq2 分析中，有 8 個 miRNAs 為 P=0.01～0.05，預測與癲癇相關的靶點；還有 11 個以往與癲癇相關的 miRNAs，但在本研究的 miRNA-Seq 分析中無顯著性。因此，選擇用于進一步分析的 miRNAs 總數為 61。
圖1
熱圖顯示選定的 miRNAs 的表達和聚類分析的可視化結果
熱圖顯示了 39 個 miRNAs 的表達，這些 miRNAs 根據它們在伴海馬硬化（mTLE+HS）中改變的轉錄進行選擇，通過 miRNA 測序明確。每行代表 1 個 miRNA，每列代表 1 個來自患者和對照的樣本。表達被計算為標準化讀數與對照組標準化讀數中位數之間的差異。數值繼之被轉換為常用對數值。紅色和藍色分別表示高于和低于對照表達的中位數。此外，熱圖描繪了基于差異表達分析計算的雙向有序 miRNA 和樣本聚類分析的結果。miRNA 聚類樹狀圖展示在左側，并顯示了具有相似表達調節的聚簇 miRNAs。樣本聚類樹狀圖展示在頂部，并對對照組和患者樣本分組展示
在技術驗證步驟中，為選定的 miRNA 優化了 miQPCR 引物（遵循 MIQE 指南）。4 種引物的驗證是不可能的，因為它們具有高的鳥嘌呤-胞嘧啶含量，并且它們與其他豐富的 miRNA 有相似的序列。此外，miRNA 由于其高 Ct 值（>34），超過了 qRT-PCR 的可靠范圍而被排除。本研究共驗證 30 個 miRNAs 的表達譜（表 1），包括從文獻中選擇的“無顯著性”的 miRNAs.
表1
在內側顳葉癲癇+海馬硬化中差異表達微小 RNAs
為了評估 NGS 和 miQPCR 平臺之間的一致性，研究比較了兩個平臺評估的各個樣品中 miRNA 的差異倍數，并且還將它們的整體表達水平可視化（圖 2a）。測量的 miRNA 低濃度接近 miQPCR 方法的檢測極限，可能導致儀器誤差，影響 Ct 值和一些測量中的差異倍數。雖然這些測量結果超出了最佳趨勢，但兩個平臺的圖形差異倍數比較總體上呈現了良好的相關性（圖 2b）。
圖2
下一代測序（NGS）和 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）平臺之間的測量結果和 miRNA 差異倍數的一致性
通過 DESeq2 分析 miRNA 測序（miRNA-Seq）倍數變化。miQPCR 倍數變化的計算基于用 2–ΔΔCt 方法比較的相對表達水平。RNU6B 作為 miQPCR 的內源性對照。差異倍數被轉換成它們的 log2 值。a. 所有樣品中 miRNA-Seq 平臺和 miQPCR 之間測量的差異倍數的比較。該圖也顯示了整體表達水平（E），由氣泡大小體現（較大的氣泡代表較高的表達水平）。全局表達水平計算為用于構建 MA 圖的 log2 強度的平均值，其通常用于使微陣列數據可視化。在該可視化中，強度用標準化讀數代替，并且總體表達水平被定義為 E = 1/2log2（RG），其中 R 是參考樣品（S17）的標準化讀數（miRNA），并且 G 是分析的樣品中的標準化讀數（miRNA）；b. miRNA-Seq 和 miQPCR 平臺之間的 miRNA 差異倍數的比較通過選擇 miRNAs 用于技術驗證。圖中的虛線表示選擇用于技術驗證分析的 miRNAs 的線性相關性
為了證實所有用于技術驗證的 miRNAs 的表達模式（選自 miRNA-Seq 和文獻），本研究對驗證隊列的另外 17 例 mTLE+HS 患者腦組織樣本（表 1）進行了 miQPCR 表達分析。這一分析驗證了 26 個 miRNAs 的表達，而經 miRNA-Seq 明確并經技術驗證證實存在表達改變的 miR-184，miR-6131 和 miR-19b-3p 在驗證隊列中未被證實。相反，miR-134-5p 僅在驗證隊列中有表達水平改變，但在 miRNA-Seq 中無表達的改變，有文獻報道 miR-193a-5p，miR-320e 和 miR-490-3p 在 miQPCR 檢測中有 1.7 倍及以上差異倍數的患者均有升高（P<0.01）。
2.3 在內側顳葉癲癇+海馬硬化海馬中微小 RNA 差異表達
綜上所述，經過嚴格分析已經證實了 26 種 miRNA 的表達趨勢。在 mTLE+HS 中 20 個 miRNAs 呈現出改變的表達模式，19 個在海馬中上調，1 個下調（表 1）。通過 NGS 和 miQPCR 都觀察到，在 9 個與癲癇新相關的 miRNAs 中，有 1.8 倍或更高的表達差異倍數（圖 3）。在選自文獻的 6 種 miRNA 中，未檢測到患者和對照之間表達的顯著變化（除了 miR-132-p 和 miR-301a-3p，其僅在 DESeq2 中有顯著性）。
圖3
通過 miRNA 特異性實時定量聚合酶鏈式反應（miQPCR）新鑒定的具有表達改變的 miRNAs 的相對表達分析
相對表達使用 miQPCR 平臺在對照（Control），技術驗證隊列（Cohort 1）和驗證隊列（Cohort 2）中確定，并且每個點代表每個樣品 4 個技術重復的平均值。紅線表示相對表達的中位數。使用 Mann-Whitney U 檢驗方法比較對照與技術驗證隊列或驗證隊列不同表達水平的差異顯著性，并且在組上方顯示
2.4 微小 RNA 靶點預測和通路分析
使用 miRNA 靶點搜索工具（mirDB），研究產生了新明確的在 mTLE+HS 中具有表達水平改變的潛在 miRNA 靶基因列表。表 2 呈現了與神經元功能相關的目標分數>90 的靶點基因庫（在癲癇中具有潛在影響）。
表2
新明確的表達改變的微小 RNA 的基因靶點
本研究使用 DIANA-miRPath V3 工具來識別異常表達的 miRNA 和受影響途徑的潛在靶點。該軟件發現了數十個可能受到 mTLE+HS 中 miRNA 表達改變所影響的途徑。大多數受影響的基因與分子信號傳導（Wnt-，ErbB-，p53，mTOR，PI3-Akt，MAPK-等）和癌癥（肺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑素瘤）相關通路有關。此外，以前與癲癇和神經元功能或大腦發育有關的幾種途徑［軸突誘導，神經營養因子信號傳導途徑，γ-氨基丁酸（GABA）能突觸，鞘脂信號傳導途徑和 SNARE 在囊泡運輸中的相互作用］被認為是 9 個或更多差異表達 miRNAs 的靶點（P<0.05）；見表 3。
表3
可能受內側顳葉癲癇+海馬硬化中表達改變的 miRNAs 調控的癲癇相關通路和涉及的基因
3 討論
這項研究建立在越來越多的證據基礎上表明，miRNAs 從根本上與癲癇的病理生理及促進癲癇發作有關。這項研究的獨特之處在于使用 NGS 在至今為止最大的隊列人群（n=33）中對全人類海馬 miRNA 組學進行全面評估分析，以明確 miRNA 可能與 mTLE+HS 的病理學相關。采用技術上獨立的平臺（NGS 和 miQPCR）來鑒定和量化 miRNA，從而發現新的在 mTLE+HS 中具有表達改變的 miRNAs。在癲癇中廣泛研究的多種 miRNA（如：miR-146a，miR-132-3p，miR-132-5p，miR-134-5p）在本研究的患者中卻沒有表現出表達水平的變化，這意味著 mTLE+HS 中獨特的 miRNA 海馬表達譜，如之前 Kan 等研究所示。盡管這些 miRNA 在 mTLE+HS 中未被檢測到差異表達，但在我們的研究中，mTLE+HS 患者中表達改變的 miRNA 與已發表的關于這些 miRNA 在癲癇中的數據一致。利用計算機分析探索了潛在的 mRNA 靶點和受發現 miRNA 影響的生物學途徑，發現了幾個候選點，其異常表達可能參與了 mTLE+HS 病理。我們研究還調查了 miRNA-Seq 和 miQPCR 結果在評估癲癇腦組織中 miRNA 的一致性。
測序無引物偏倚或需要物種注釋，可以完整評估所有 miRNA。文獻指出了 miRNA 測序中的缺點，并建議通過其他方法驗證獲得的結果。為此，我們研究將 miRNA-Seq 結果與 miQPCR 進行比較，miQPCR 是一種利用 qRT-PCR 定量 miRNA 的創新方法。這些方法之間的差異表達分析的交叉比較報道的測量值差異倍數變化范圍在 1.4 倍以內。這些測量方法用于 miRNA，而沒有表達改變或代表生物學變異。樣本中拷貝數較低的 miRNAs 也會引起變異，這可能會增加儀器誤差。另外，樣品中的低 miRNA 濃度可能影響 miQPCR 測量結果，導致低于 NGS 分析的差異倍數。
總體而言，以往已有關于 qRT-PCR 和 miRNA 測序平臺之間的不一致性的研究。雖然一般認為，對于高質量的標本，平臺內變異性通常是最小的，但跨平臺比較不一定完全相關。這兩個平臺之間的不完全一致可能是由于 NGS 管道中包含的前置放大步驟所引入的靈敏度不同，這在 miQPCR 中是不存在的。前置放大和更寬松的映射參數（每次讀取允許兩個不匹配）可能引入了導致 miRNA 檢測假陽性的偏差。此外，差異倍數比較（圖 2b）顯示兩種方法之間只有很少的差異，而有很強的總體相關性。應用兩種不同的 miRNA 分析方法來提高分析的選擇性和結果的可靠性。
除了對 24 例患者進行 NGS 分析并在技術驗證中進行證實之外，還在另外 17 例 mTLE+HS 患者樣本進行了驗證。該驗證隊列證實了與技術驗證中證實的表達模式相同的 26 種 miRNAs。miR-129-1-3p，miR-129-2-3p，miR-193b-3p，miR-195-5p，miR-374b 5p 和 miR-451a 的上調與以往對 mTLE+HS 的癲癇患者或其他亞型癲癇患者進行的研究一致。本研究還發現了至今為止僅在嚙齒動物模型的研究中有相同上調結果的 miRNA（miR-142-3p，miR-142-5p，miR-144-5p，miR 150-5p 和 miR-874-3p）。本研究的列表包括與其他神經病理相關的 miRNA，如：阿爾茨海默病（miR-142-3p，miR-142-5p 和 miR-191-5p），帕金森病（miR-339-5p），中風（miR-1275）和腦損傷（miR-144-5p）。此外，本研究還明確了幾種以往前未曾報道與神經疾病相關的 miRNA（miR-1260a，miR-1260b，miR-4443，miR-4454，miR-4792 和 miR-6087），但是它們在癌癥，胚胎細胞等中有調節改變。此外，以往檢測到 miRNA 451a 在神經元中特異性地富集；miR-142-3p，miR-142-5p 和 miR-150-5p 在小膠質細胞中富集和 miR-193 在星形膠質細胞中富集。所有前面提到的 miRNA 都可能成為新療法的靶點，或者可能影響 mTLE+HS 形成的途徑。計算機分析表明這些 miRNA 存在于各種途徑和疾病中; 然而，它們在 mTLE+HS 中的因果關系尚不清楚，需要通過其他的功能分析來證實。
6 個在 mTLE+HS 樣品中兩種方法檢測均無異常調節的 miRNAs（miR-146a-5p、miR-132-5p、miR-16-5p、miR-301a-3p、miR-138-2-3p 和 miR-138-5p），在以往關于癲癇的報道中有差異表達。不同技術方法（如樣品制備）、樣品類型（如組織）、研究的物種（如嚙齒動物）和不同研究中探究的癲癇亞型不同可能導致 miRNA 譜的變化。在這項研究中，海馬樣品被儲存為 FFPE 塊，這樣便于處理，節約長期存儲的成本，并且更方便獲取使用。石蠟包埋過程會切段 mRNA，然而，此樣品處理不會影響 miRNA 的質量和數量。本研究專注于特定的癲癇亞型，mTLE+HS，與非硬化或周圍腦組織相比，它改變了細胞組成，并導致了 miRNA 譜的改變。此外，已知模式生物與人類的表達譜略有不同，因此嚙齒動物癲癇模型中的 miRNA 水平可能與癲癇患者中所明確的不同。在大多數已發表的研究中，通過預定的分析測定方法（TaqMan 分析、Exiqon 分析、微陣列等）分析 miRNA 譜，其受到所選引物/探針的限制并易于曲解 miRNA 異構體。所有 miRNA 分析平臺（NGS、qRT-PCR、微陣列等）對檢測和量化參與疾病的所有 miRNA 的能力有限。因此，在 miRNA-Seq 和 miQPCR 分析中觀察到的差異強調了用其他定量方法來驗證每個平臺的結果的必要性，因為，每個平臺的局限性會導致假陽性或假陰性檢測結果。盡管有技術上的優勢，但理論上，一些 miRNA 可能僅在特定的海馬亞區有低倍數變化的失調，而可能被其他亞區未改變的表達所掩蓋。這種 miRNA 在本研究的分析中將認為是無顯著性的。
由于基因的表達依賴于細胞中存在的 miRNA 的微妙平衡，特定 miRNA 的異常升高或下調可能影響基因和通路，導致病理學改變。本研究應用了組合分析和預測軟件，即 miRDB 和 miRPath，揭示了一系列 mTLE+HS 中改變的 miRNA 靶向的預測基因和通路。
miRDB 明確了一系列潛在的 miRNA 靶點，這些 miRNA 靶點是在 mTLE+HS 患者中新發現的具有表達改變的 miRNAs（表 2）。這 9 個 miRNAs 中有 4 個可能抑制鉀離子通道，以及它們的亞基和相互作用蛋白的基因表達，從而支持現行的癲癇起源的鉀離子假說。miRPath 軟件顯示，表達改變的 20 個 miRNAs 中的 11 個可能影響 GABA 通路，GABA 通路是另一個廣泛接受的與癲癇起源和發作相關的假說。GABA 能突觸通路代表了哺乳動物中樞神經系統中最豐富的抑制性神經傳遞，并且曾在多項研究中認為與癲癇相關（DiNuzzo 等人綜述）。miRPath 軟件還明確了可能受差異表達的 miRNA 影響的幾十種通路（例如信號傳導，癌癥等）。表 3 包含了以往與神經元功能和癲癇相關的通路子集。軸突引導是形成神經元網絡的關鍵階段，并在影響細胞骨架組織的多種因素（如：軸突生長誘向因子，軸突導向因子）中引導軸突。靶向軸突的不準確性可能導致新形成的神經元連接嚴重功能障礙，例如軸突導向因子 3A 的下調促進癲癇海馬的苔蘚纖維出芽。與軸突引導密切相關的是神經營養因子信號傳導，其使用營養因子家族（神經營養因子）來控制神經細胞的分化，生存和重塑，并可能影響興奮性。在囊泡運輸中鞘脂信號和 SNARE 相互作用促進對于包括神經元網絡發育和維持在內的不同生物事件所必需的細胞內運輸過程，并且它們的不平衡可能導致嚴重的神經障礙（例如精神分裂癥、阿爾茨海默病、癲癇）。以往已有所有上述通路和 mTLE+HS 和/或其他癲癇亞型間聯系的研究。然而，這些計算機分析結果需要進一步通過細胞培養和動物模型的功能實驗來證實。
總之，本研究使用 miRNA-Seq 和 miQPCR 平臺評估了來自 mTLE+HS 患者（n=33）和尸檢對照（n=9）的海馬組織中的 miRNA 組成。據我們所知，本研究的 miRNA 譜分析是在迄今為止最大的 mTLE+HS 患者隊列中進行的。研究對單個樣品進行測序，并明確了>100 個患者中表達改變的 miRNAs。對兩組患者的驗證分析發現了在以往研究中發表的 11 個 miRNAs 的上調，并發現通常與癲癇相關的 6 個 miRNAs 在 mTLE+HS 中無表達異常。本研究發現了 9 個可能與 mTLE+HS 相關的 miRNAs，這些 miRNAs 以往尚未報道與與癲癇相關。此外，這些 miRNAs 的計算機分析顯示它們可以靶向與神經元粘附，離子通道或突觸囊泡運輸相關的基因和通路，且它們的破壞可能涉及 mTLE+HS 或其他癲癇亞型的誘導。雖然我們研究的重點是 HS 患者，但對 HS 和無 HS 患者進行前瞻性比較分析可能會提供對癲癇病理學的新觀點。
最后，對異常表達的 miRNA 及其相關靶點的進一步研究可能會提高對癲癇的理解和治療。
