外周生物標志物具有許多潛在用途，可用于癲癇的治療、預測、預后和藥物安全監視作用。目前為止，雖然多個候選標記物在研究中，但還沒有單一的外周生物標記物已經證明有效。文章中討論的重點領域，包括炎癥、血腦屏障功能障礙、氧化還原改變、代謝、激素和生長因子。
引用本文： WalkerLauren E, JanigroDamir, HeinemannUwe, 江欣玥, 慕潔. WONOEP評價：癲癇的分子和細胞生物標記物. 癲癇雜志, 2017, 3(3): 267-275. doi: 10.7507/2096-0247.20170041 復制
全球有5 000萬人患有癲癇，其中1/3的患者使用任一抗癲癇藥物(AEDs)或聯合用藥，都不能控制癲癇發作，并且不同機制的藥物通常不會減輕患者對AEDs的耐藥性。
目前，癲癇領域缺乏生物標記物來可靠地診斷耐藥性癲癇，標志物即為“在人體組織、細胞或體液等生物介質中可測量的細胞、生化或分子改變”。最近，美國國立衛生研究院(National Institute of Health, NIH)工作組擴大了這一定義，包括“能反映生理過程、致病過程或能客觀測量治療干預的藥理反應”的所有指標。對于癲癇，生物標記物則包括了大腦影像、電生理以及周圍組織和組織液中的分子和細胞標記物，本文則主要研究血液和腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)中的可溶性生物標記物。癲癇患者循環系統中的生物標記物有許多潛在的作用，如幫助判斷癲癇患者在腦損傷或第一次發作后的病情，預測首診后疾病進展以及對AEDs的耐藥性，并通過識別藥物不良反應(Adverse drug reactions，ADRs)來提高藥物安全警戒作用(圖 1)。這些生物標記物與藥物研發的全過程息息相關，包括篩選臨床前安全性指標、早期應用于少數人的藥物開發試驗以及上市后人群安全指標(圖 2)。
圖1
癲癇生物標記物覆蓋范圍廣泛，包括預測、預后和藥物安全監視作用。候選生物標志物可跨越多個領域或僅與受限過程相關
圖2
生物標記物與候選新藥的整個發展過程相關
癲癇發作的生物標記物的發現不僅困難并且昂貴。有些嚴重的致癇損傷如大腦貫穿傷，只有部分個體才會產生癲癇，并且此過程會持續10年以上，因此腦損傷后預防癲癇發作的前瞻性藥物研究很少被開展。已有的藥物實驗(關于苯妥英鈉、苯巴比妥及其組合、卡馬西平、丙戊酸鈉或丙戊酸鎂)，可能由于其試驗對象僅包括最易發癲癇的人群，而缺乏具有高預測能力的生物標記物來增加試驗人數，導致其結果不盡人意。而理想的情形則是，當癲癇確定時能通過識別一組生物標記物來認識整個癲癇發生過程，包括腦損傷后的癲癇發作期(癲癇危險因素的評估)、發作前(發作預測)、發作后(癇性或非癇性的判斷)以及發作間期(耐藥及藥物不良反應的預測)。這將涉及臨床前期模型和患者研究的結合。大規模的影像學技術、臨床神經生理學連同基因組學、蛋白質組學和代謝組學的出現，給了我們更多機會去發現具有預測作用的生物標記物，這將有助于以合理的成本構建有用的臨床試驗。
分子和細胞生物標記物在理想情況下應存在于可得到的標本中，例如血液、組織、CSF、痰或尿液，并且應證明它在較大的動態定量范圍內表現出較低的基線變異性，從而通過性價比高又簡單易行且高產量的技術分析可以容易地檢測和測量其水平變化。在藥物開發的特定情況下，轉化生物標志物是高度受追捧的，并且標志物應當在包括人在內的至少兩種不同物種中起作用。
1 癲癇生物標記物的發展
目前為止癲癇尚無經過驗證的分子或細胞標記物，而事實上對人類外周候選生物標記物的研究也很少。理想情形則是識別一組生物標記物，對損傷后迅速致癇期的發作期及發作間期的整個過程進行評估。由于有微創的優點，外周生物標記物對大腦疾病例如癲癇有很大作用。與大腦炎癥、生長因子、微小RNA、氧化應激和代謝功能障礙等相關的生物標記物也許有助于癲癇的早期診斷，這樣患者就能從抗炎治療中獲益。在由國際抗癲癇國際聯盟(ILAE)神經生物學委員會組織的第八屆關于癲癇神經生物研討會(XIII WONOEP)上提出關于外周癲癇生物標志物的最新知識，涉及到炎癥、血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)功能障礙、氧化還原、代謝、激素和生長等多個領域，本文進行了擴展總結。對于一些超出本文范圍的其他領域、具有較好應用前景的生物標記物，見表 1。
表1
癲癇外周生物標志物的臨床研究
2 炎癥
最近研究顯示，神經系統炎癥可以促使癲癇發作并維持癲癇發作活動，并且周圍炎癥可通過改變離子和谷氨酸穩態而影響癇性放電。因此，炎癥的生物標志物則提示一種潛在手段，來識別有異常炎癥反應的患者，這些炎癥在癲癇發生或維持癲癇狀態中起關鍵作用。此外，免疫調節藥物包括類固醇和靜脈注射免疫球蛋白，已經證明在一些患有常規AEDs難以控制的癲癇腦病的患兒中是有效的。這表明炎癥不僅與癲癇的發生相關，并且涉及耐藥表型的發展。令人吃驚的是，即使患兒的局灶性癲癇實際并不是傳統意義上的炎癥，類固醇卻仍對其有效。同時進行的動物模型實驗表明，類固醇靶點似乎是BBB，靶向炎癥方面也許能為癲癇提出一個嶄新的治療策略，并且能夠顯示靶向結合和治療反應的循環生物標志物，在藥物發現中具有較高價。白細胞介素1β(IL-1β)是腦炎癥的介質，并被其同源抗炎受體拮抗劑(IL-1Ra)抵消，而在患有耐藥的局灶性癲癇的個體中，這兩者的比例是不平衡的，并可促進炎癥的發生。在嚙齒動物體內，以IL-1轉化酶為靶點的藥物作用能特異性阻斷IL-1β的生物合成，從而顯著減少癲癇發作。外周血中的“促炎癥細胞因子譜”由升高的IL-6和低IL-1β/ IL-1Ra比率組成，或許表明持續不緩解的炎癥將導致與神經元興奮性改變相關，隨后的人類癲癇研究檢測了外周血中的促炎細胞因子，也支持以上發現。此外，血清和CSF中高水平IL-1β與中到重度腦損傷后發展癲癇的風險增加相關，并且為C到T基因型為rs1143634的個體，其血清IL-1β顯著降低，而CSF與血清中IL-1β的含量比則升高，這同時影響著癲癇發作的頻率和發生癲癇的概率。
高遷移組盒1(High mobility group box-1，HMGB1) 是最早發現的致癇損傷誘發產生的神經炎癥介質，在臨床癲癇模型中表現出與癇性發作的產生密切相關。在生理狀態下，HMGB1存在于細胞核中，負責轉錄的調節。免疫激活引起細胞質異位，隨后蛋白質序列中關鍵賴氨酸殘基發生乙酰化。不論是感染或無菌性炎癥，免疫細胞均能釋放HMGB1。壞死細胞死亡導致非乙酰化HMGB1的被動釋放。然后，功能活性由半胱氨酸殘基C23、C45和C106的翻譯后氧化還原修飾決定。二硫化物HMGB1在C23和C45之間有一個二硫鍵，通過Toll樣受體-4結合并發出信號，并通過核因子κB(NF-κB)的活化誘導促炎癥和神經調節作用。完全減少的HMGB1駐留在細胞內并且在釋放后作為細胞趨化因子通過與趨化因子CXCL12形成復合物來與CXCR4結合。癲癇的實驗模型表明乙酰化硫化物形式的HMGB1可導致癲癇中有害的炎癥反應。耐藥性癲癇手術中切下的大腦組織證實炎癥介質的存在，表明持續的無法解決的炎癥反應在由腦損傷導致的癥狀性癲癇的病理過程中起到重要作用。對耐藥性局灶癲癇患者的試驗性研究顯示HMGB1亞型可能成為癲癇分類的候選生物標記物。然而HMGB1并不是癲癇特有的，但它確實給了我們找到一種用來在許多疾病中(包括自身免疫及惡性疾病)進行患者亞群分層的敏感而特異的生物標記物的希望。
在許多疾病模型實驗中已經能成功用藥物抑制HMGB1。其干預措施包括使用多克隆和單克隆抗體直接抑制，使用截斷的HMGB1 A-Box的競爭性抑制，隔離并降解HMGB1(重組可溶性血栓形成)，通過抑制NF-κB途徑來阻斷下游HMGB1的釋放(選擇性a7-煙堿型乙酰膽堿受體激動劑)。由于HMGB1缺乏腦特異性，所以并不能明確外周還是中樞神經系統導致癇性發作或早期療效。
3 血腦屏障
從20世紀50年代起，我們就發現動物持續性癲癇后會出現BBB功能失調。Klatzo及其同事首先描述了由神經血管單位紊亂引起的血管性水腫。在某些情況下，BBB的打開可能會引起急性癲癇發作，而通過其他手段的人工打開導致延遲的癲癇發生。由于高血壓危象導致的BBB打開，如子癇和高血壓性腦病可能涉及血清鎂濃度增高。實驗中BBB的開放造成了延遲性發作，BBB開放在許多不同的神經系統疾病中是很常見的，如腦炎、腦膜炎、卒中、阿爾茨海默病以及別的中樞神經系統疾病。毫無疑問，腦血管功能紊亂是會導致癲癇發作的。在包括癲癇在內的中樞神經系統(CNS)疾病中，腦血管損傷在過去的臨床上被認為會導致癲癇，不過最近的研究才證明確實是癲癇發生的主導機制。現在已有研究提出恢復腦血管完整性作為傳統AEDs的補充方法，在人類癲癇的病例中，數據高度提示在發生癲癇發作的病灶區域中BBB選擇性通透性喪失。
此外，幾個試驗組的數據支持癲癇患者BBB中存在一系列以各種方式參與疾病的分子信號。這包括多重耐藥相關的轉運蛋白和酶的表達，以及葡萄糖轉運體——GLUT-136的異常水平。大多數人體數據來源于離體組織的微觀分析，其中一系列藥物擠壓分子10年前就有報道過，由康福德首次觀察后又有幾個試驗組報道毛細血管或血管漏出物。然而在人體樣本中藥物轉運抑制劑的使用并不能控制耐藥性癲癇。BBB的開放及白蛋白的溢出可能也會導致AEDs或細胞外γ-氨基丁酸(GABA)的緩沖作用，從而影響治療效果或模擬GABA藥物作用。
鑒于BBB對于發作性疾病和癲癇的重要性，癲癇病理生理學方面的生物標記物已經被研究和開發是意料之內的。一般而言，有三種方法來研究癲癇中的BBB功能，這與臨床上用于測量其他神經系統疾病中腦血管完整性大致相同。歷史上，第一種使用的方法就是測量血清白蛋白與CSF白蛋白的比率。這種方法的基本原理本質上與臨床上所有BBB檢測方法是一致的。BBB保護大腦不受血流中的有害物質的損傷，同時提供大腦正常運轉所需的營養物質，并嚴格調節細胞和分子從血液中進入大腦的轉運，還隔離開大腦和血液中非滲透性大分子(>500 Da)。因此，當BBB完整時，白蛋白(其全身濃縮10倍)將產生相當恒定的血液與CSF比率。因此，當BBB完整時，濃縮10倍的白蛋白將產生相當恒定的血液與CSF比率。增強磁共振成像(MRI)是一種與其完全不同的檢測模式，但二者原理相似。這里腦和血液之間的“比率”是在不同部位上測量的，注射進血液中的標志物在大腦中分布及代謝情況是可見的。若有滲出則可以被量化，并進行左右半球對比，沒有滲出則表明BBB是完整的。第三種方式則是BBB的血清標記物，這在10年前第一次提出。大腦會生成獨特的蛋白質，并因有完整的BBB而被隔離在中樞神經系統。當BBB開放時，本應在CNS高濃度聚集的蛋白質會順濃度梯度向血液中擴散。具有臨床意義的理想外周標記應該滿足以下條件：① 此蛋白質或分子在正常血清中濃度較低甚至檢測不到；② 存在于大腦和CSF中，并且在腦實質中具有比在血漿中更高的濃度；③ BBB開放時即可外滲；④ 當腦損傷時能進一步被腦細胞釋放，如反應性神經膠質增多。現已對包括S100B、神經特異性烯醇(NSE)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)在內的幾種蛋白質進行了評估，并發現S100B滿足上述所有特點。現在臨床或人體研究中運用的影像學技術雖然能使用造影劑來測量BBB的完整性，但缺少能顯示結構的必要的高分辨率。通過計算CSF-血清白蛋白比率(QA)和增強MRI，對BBB狀態的功能評估被廣泛接受為BBB通透性的黃金標準。最近一篇文章表明血清S100B與QA相關，從而允許間接測量CSF蛋白質，而不再需要脊椎穿刺。研究表明S100B的陰性預測值與增強MRI等價。
對于創傷性腦外傷(TBI)后延遲癲癇發作這一問題，血清S100B是腦震蕩患者最值得研究的標記物。腦震蕩或一般的TBI，隨病情的發展與否，BBB會快速喪失完整性。S100B則已成為檢查BBB通透性的候選外周生物標記物，血清S100B水平增高反映出BBB的損傷，即可因此預測或排除大腦損傷。最重要的是在使用計算機斷層掃描(CT)檢查出TBI符合顱內事件之后，S100B也會增加。有研究將S100B血清水平與基于CT的TBI診斷進行比較，并報告了> 95%的陰性預測值。由于嚴重的顱內事件與癲癇發作的風險增加相關，與那些可能發生創傷后遺癥的患者相比，S100B在低風險的個體中也能證明其有效性。S100B的一種重要特性是對BBB損害或TBI的后遺癥有優異的陰性預測值，相反其他標記物則更傾向于良好的陽性預測值。比如關于泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1) 這一標記物，最近有Meta分析報道，在總共有1 138個TBI病例和1 373名對照的研究中，TBI患者的血清UCH-L1水平與對照相比顯著增加[加權平均差異0.96，95%CI=(0.31-1.61);P = 0.004]。兩項獨立的關于TBI患者體內S100B的Meta分析總結道，低血清S100B水平能準確測TBI后正常的CT結果，并且當沒有局灶性神經功能缺損或顯著的腦外損傷時應考慮在受損3 h內取得S100B樣本。這些研究建議在 < 0.10 ng / mL這一臨界值時省略CT檢查。因此，我們有機會以一種具有高陰性預測值的測試作為床旁監測來避免許多不必要的掃描，另外，基于實驗室的陽性預測值測試則可以診斷TBI后的并發癥。最近的一篇論文詳細描述了TBI中S100B陰性預測值的價值。
4 氧化還原和代謝因子
在局灶性癲癇中，葡萄糖代謝減少長期以來已知發生在通過正電子發射斷層掃描(PET)研究確定的癲癇發作灶的區域中。原因可能在于神經血管耦合改變，腦組織對葡萄糖攝取減少，或線粒體功能的改變，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD(H)]減少和黃素腺嘌呤二核苷酸[FAD(H)]自體熒光信號的半醌形式。在癲癇發作起始階段，NAD(P)H下降后又飚升，而在人體顳葉癲癇組織中所缺乏，這可能歸因于星形膠質細胞分泌的乳酸鹽、乳酸脫氫酶、神經元攝入的葡萄糖或線粒體能量的改變。三羧酸循環的加速很可能不僅由衰減信號如ATP/ADP比值決定，還與鈣離子有關，因為確定的線粒體酶如丙酮酸脫氫酶是鈣依賴性。鈣離子在細胞液中聚集反過來會造成線粒體去極化從而出現低效呼吸和部分氧的還原，最終導致超氧化物(O2 )的穩態水平增加。
O2、過氧化氫(H2O2)和最終鐵催化的羥基自由基(·OH)的穩態水平增加導致線粒體氧化應激，這可以損害近端易受攻擊的靶標如線粒體蛋白、脂質和DNA。一些證據表明這會造成線粒體基因改變。比如復合體1的亞基在細胞間的差異性分布會造成不同類型細胞的脆弱性差異。除了線粒體，發作還能通過戊糖途徑、黃嘌呤氧化酶以及NADPH氧化酶家族導致活性氧(ROS)的產生。此外，小神經膠質細胞由于酸中毒或吞噬一氧化氮酶(NOX)也與發作導致的ROS產生有關。
不管癲癇的腦組織中ROS產生的部位和來源是什么，現在認識到氧化應激和功能紊亂由致癇損傷引起，并造成癲癇發作和并發癥。我們現已在氧化還原生物學領域中開發了許多能指示氧化應激的有用的生物標志物。組織、血漿和尿中的8-羥基-2-脫氧鳥苷(8OHdG)和F2-異前列烷(F2-IsoP)經驗證是對DNA堿基和脂質氧化損傷很重要的生物標志物。在癲癇持續狀態的動物大腦中易受攻擊的部分以及人類癲癇患者中8OHdG和F2-IsoP均增加。一種評估氧化還原不平衡的更常見的方法是測量可相互轉化的氧化還原對，如NAD(P)H / NAD(P)+，半胱氨酸/胱氨酸和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物(GSH / GSSG)。腦成像發現癲癇患者和癲癇持續狀態下動物海馬中GSH的消耗。總體而言，周圍組織的氧化還原反應以及影像學改變或許能作為癲癇的發展、演進及并發癥中有意義的生物標記物。代謝紊亂的血清標記物，如基于質譜分析或其他分析方法的維生素D代謝物，已經在獲得性癲癇的動物模型中得到驗證。這些生物標志物可以提供與癲癇產生相關的疾病進展和(或)耐藥性的重要信息。
5 激素和生長因子
最近的研究表明生物標記物可以用來評估特定表型的易損性。比如，在強烈的壓力(如社交失敗)下，所有動物都有抑郁表現、氧化應激反應和低血清腦源性神經營養因子(BDNF)水平。幾個星期后，沒有一只動物表現出抑郁，但半數仍保持低血清BDNF水平和氧化應激。當處于較小的壓力下，具有持續低血清BDNF水平的動物(稱為易損者)顯示抑郁樣特征，而具有正常BDNF水平(稱為非脆性)的動物不顯示任何表型。因此，原來的壓力事件使一部分動物致敏，如果他們偶然遇到第二次打擊，則易受傷害。血清BDNF水平可用作易損性的預測性生物標志物。最后，注射BDNF模擬物可使易感人群正常化，使其不易受損。將第二次打擊(輕度應激)替換為癲癇發作(紅藻氨酸誘導的癲癇持續狀態)表明，脆弱動物的癲癇持續狀態閾值較低，發展癲癇更快，并且顯示嚴重的認知缺陷以及抑郁。非易損人群在較慢的時間尺度上發展癲癇，并且不顯示強烈的合并癥。因此，血清BDNF水平預示著易感性即人群在損傷后易發生癲癇，以及在伴有自發性發作的慢性期發展合并癥(抑郁癥和認知缺陷)。
值得注意的是這些結果與大量文獻報道的一旦癲癇發展后BDNF的組織水平增加不矛盾。在前一個例子中，BDNF血清水平是在致癇損傷之前評估的。此結果完全符合臨床研究結果，因為并不是所有的個體都會在損傷后發生癲癇和合并癥。除了可能的臨床表現，這項工作還表明，實驗動物并不是生物等效的，因為它們對相同的打擊有不同的反應。還有一個重要的值得考慮的因素，即其他類別的生物標志物的表達可能取決于動物的特定生物組。
West綜合征是一種罕見的癲癇疾病，發病時間通常在2歲之前，其特征是嬰兒痙攣(IS)伴有高度節律失常或間質腦電圖(EEG)改變的高度節律失常。該綜合征根據已知病因分為癥狀性、遺傳性和隱源性組。較新的分類則將IS分為結構代謝性、隱源性和遺傳性組。
IS患兒CSF中的氧化氮代謝物、硝酸鹽和亞硝酸鹽可以區分癥狀性和隱源性，雖然他們無法估計癥狀的持續時間或預測精神發育的預后。
疾病的機制目前尚不清楚，然而，早期生活壓力已被認為是疾病的觸發點。促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)是腦發育早期強烈導致驚厥的神經肽。雖然CRF可劇烈刺激功能低下的垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素(ACTH)，長期升高的腦CRF會使CRF受體不再敏感，最終減少ACTH釋放。當壓力反復出現時，它會影響到胰島素樣生長因子(IGF-1) 的合成，因為IGF需要類固醇持續聚集。IGF是早期腦發育過程中的重要營養因子，缺乏IGF-1將導致突觸損傷，進而引起從認知功能的減少到癲癇腦病的發生。早期的大腦損傷可能會觸發一系列分子和細胞因子的級聯反應。癲癇由三個過程組成：起初的損傷、潛伏期以及周期性發作。大腦早期損傷通常見于出生后幾個月的IS，而潛伏期則可以成為治療的重點。
IS的一線治療包括免疫抑制劑合成ACTH。ACTH在這種疾病中的治療作用是未知的，但它可能下調CRF和其他應激激素的分泌。IGF影響神經發育的整個過程，并且大腦的生長發育對IGF-1水平非常敏感。IGF-1也減少神經炎癥。ACTH、糖皮質激素和生酮飲食都將影響IGF水平，并已被用于治療IS。在有IS癥狀的患兒中已證明，與其他先天性疾病相比，其CSF IGF-1與ACTH濃度均顯著降低。癥狀性IS的特點是有產前、圍產期或產后損傷的病史。出現產前應激的動物中表現出IGF-1減少。在IS的患者中，CSF中低濃度IGF-1與對治療的不良反應和認知低下相關。大腦不能產生刺激IGF-1分泌的類固醇，而IGF-1是突觸存活的必需生長因子，故其可作為表明疾病嚴重性的生物標志物。CSF低IGF-1的患者對治療無反應，IGF-1水平與智力遲鈍持續惡化之間存在關聯。在IS患者中，CSF IGF-1似乎是治療反應、癲癇進展以及后期認知結果的生物標志物。應當注意，盡管我們在這里強調與疾病發病機制相關的激素和BDNF，但在癲癇患者的血清中已經鑒定出許多其他的蛋白質，例如HSP7076和copeptin77 (表 1)，其病理學作用(如果有的話)仍有待確定。
6 結語
癲癇耐藥性是在諸多方面尚未滿足臨床需求的一種治療領域，需要開發個性化治療。一些生物標志物可以預測首次癲癇發作后的疾病發展和耐藥可能性，鑒定這些標志物可能對臨床過程具有顯著影響。我們應當認識到在本綜述中討論的許多生物標志物同時涉及到許多其他疾病(包括非神經疾病)，未來需要研究可以鑒別癲癇與其他疾病的單個或一組生物標志物。新的治療策略需要整合臨床信息，包括EEG和神經成像、新穎的分子和細胞生物標志物以及基因組信息。
鑒別異常炎癥的生物標志物可能在疾病早期對炎癥有助于維持癲癇狀態患者進行潛在分層。解構炎癥在癲癇中發揮的作用有助于產生新的治療策略來阻止癲癇進展到耐藥表型。現在仍處于起步階段，但人們可以想象在這一領域發明新的產品用于藥物和診斷的潛力。
BBB完整性的標記物是確定各種神經疾病或急性事件(中風，TBI)后遺癥的有用工具。目前正在研究這些標記物是如何幫助預測和診斷癲癇病癥的，但從實驗角度來看，這些標記物已經表明BBB在癲癇發作時被破壞，并且BBB的破壞是癲癇發作的原因。此外，當損壞嚴重以致白蛋白進入間質時，可能影響到藥物有效性，因此BBB完整性的標記物可能有助于制定治療決策。
更好的預測比如腦損傷后癲癇發作的工具，有助于開發新的治療策略來預防癲癇，如免疫調節的干預形式。此外，早期預測耐藥性將意味著可以在較早階段對患者進行神經外科手術的評估，從而避免伴隨相關副作用的AEDs多次試驗，要知道這注定會失敗。
摘譯自：Walker LE，Janigro D，Heinemann U，et al. WONOEP appraisal：molecular and cellular biomarkers for epilepsy. Epilepsia，2016，57(9)：1354-1362.
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全球有5 000萬人患有癲癇，其中1/3的患者使用任一抗癲癇藥物(AEDs)或聯合用藥，都不能控制癲癇發作，并且不同機制的藥物通常不會減輕患者對AEDs的耐藥性。
目前，癲癇領域缺乏生物標記物來可靠地診斷耐藥性癲癇，標志物即為“在人體組織、細胞或體液等生物介質中可測量的細胞、生化或分子改變”。最近，美國國立衛生研究院(National Institute of Health, NIH)工作組擴大了這一定義，包括“能反映生理過程、致病過程或能客觀測量治療干預的藥理反應”的所有指標。對于癲癇，生物標記物則包括了大腦影像、電生理以及周圍組織和組織液中的分子和細胞標記物，本文則主要研究血液和腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)中的可溶性生物標記物。癲癇患者循環系統中的生物標記物有許多潛在的作用，如幫助判斷癲癇患者在腦損傷或第一次發作后的病情，預測首診后疾病進展以及對AEDs的耐藥性，并通過識別藥物不良反應(Adverse drug reactions，ADRs)來提高藥物安全警戒作用(圖 1)。這些生物標記物與藥物研發的全過程息息相關，包括篩選臨床前安全性指標、早期應用于少數人的藥物開發試驗以及上市后人群安全指標(圖 2)。
圖1
癲癇生物標記物覆蓋范圍廣泛，包括預測、預后和藥物安全監視作用。候選生物標志物可跨越多個領域或僅與受限過程相關
圖2
生物標記物與候選新藥的整個發展過程相關
癲癇發作的生物標記物的發現不僅困難并且昂貴。有些嚴重的致癇損傷如大腦貫穿傷，只有部分個體才會產生癲癇，并且此過程會持續10年以上，因此腦損傷后預防癲癇發作的前瞻性藥物研究很少被開展。已有的藥物實驗(關于苯妥英鈉、苯巴比妥及其組合、卡馬西平、丙戊酸鈉或丙戊酸鎂)，可能由于其試驗對象僅包括最易發癲癇的人群，而缺乏具有高預測能力的生物標記物來增加試驗人數，導致其結果不盡人意。而理想的情形則是，當癲癇確定時能通過識別一組生物標記物來認識整個癲癇發生過程，包括腦損傷后的癲癇發作期(癲癇危險因素的評估)、發作前(發作預測)、發作后(癇性或非癇性的判斷)以及發作間期(耐藥及藥物不良反應的預測)。這將涉及臨床前期模型和患者研究的結合。大規模的影像學技術、臨床神經生理學連同基因組學、蛋白質組學和代謝組學的出現，給了我們更多機會去發現具有預測作用的生物標記物，這將有助于以合理的成本構建有用的臨床試驗。
分子和細胞生物標記物在理想情況下應存在于可得到的標本中，例如血液、組織、CSF、痰或尿液，并且應證明它在較大的動態定量范圍內表現出較低的基線變異性，從而通過性價比高又簡單易行且高產量的技術分析可以容易地檢測和測量其水平變化。在藥物開發的特定情況下，轉化生物標志物是高度受追捧的，并且標志物應當在包括人在內的至少兩種不同物種中起作用。
1 癲癇生物標記物的發展
目前為止癲癇尚無經過驗證的分子或細胞標記物，而事實上對人類外周候選生物標記物的研究也很少。理想情形則是識別一組生物標記物，對損傷后迅速致癇期的發作期及發作間期的整個過程進行評估。由于有微創的優點，外周生物標記物對大腦疾病例如癲癇有很大作用。與大腦炎癥、生長因子、微小RNA、氧化應激和代謝功能障礙等相關的生物標記物也許有助于癲癇的早期診斷，這樣患者就能從抗炎治療中獲益。在由國際抗癲癇國際聯盟(ILAE)神經生物學委員會組織的第八屆關于癲癇神經生物研討會(XIII WONOEP)上提出關于外周癲癇生物標志物的最新知識，涉及到炎癥、血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)功能障礙、氧化還原、代謝、激素和生長等多個領域，本文進行了擴展總結。對于一些超出本文范圍的其他領域、具有較好應用前景的生物標記物，見表 1。
表1
癲癇外周生物標志物的臨床研究
2 炎癥
最近研究顯示，神經系統炎癥可以促使癲癇發作并維持癲癇發作活動，并且周圍炎癥可通過改變離子和谷氨酸穩態而影響癇性放電。因此，炎癥的生物標志物則提示一種潛在手段，來識別有異常炎癥反應的患者，這些炎癥在癲癇發生或維持癲癇狀態中起關鍵作用。此外，免疫調節藥物包括類固醇和靜脈注射免疫球蛋白，已經證明在一些患有常規AEDs難以控制的癲癇腦病的患兒中是有效的。這表明炎癥不僅與癲癇的發生相關，并且涉及耐藥表型的發展。令人吃驚的是，即使患兒的局灶性癲癇實際并不是傳統意義上的炎癥，類固醇卻仍對其有效。同時進行的動物模型實驗表明，類固醇靶點似乎是BBB，靶向炎癥方面也許能為癲癇提出一個嶄新的治療策略，并且能夠顯示靶向結合和治療反應的循環生物標志物，在藥物發現中具有較高價。白細胞介素1β(IL-1β)是腦炎癥的介質，并被其同源抗炎受體拮抗劑(IL-1Ra)抵消，而在患有耐藥的局灶性癲癇的個體中，這兩者的比例是不平衡的，并可促進炎癥的發生。在嚙齒動物體內，以IL-1轉化酶為靶點的藥物作用能特異性阻斷IL-1β的生物合成，從而顯著減少癲癇發作。外周血中的“促炎癥細胞因子譜”由升高的IL-6和低IL-1β/ IL-1Ra比率組成，或許表明持續不緩解的炎癥將導致與神經元興奮性改變相關，隨后的人類癲癇研究檢測了外周血中的促炎細胞因子，也支持以上發現。此外，血清和CSF中高水平IL-1β與中到重度腦損傷后發展癲癇的風險增加相關，并且為C到T基因型為rs1143634的個體，其血清IL-1β顯著降低，而CSF與血清中IL-1β的含量比則升高，這同時影響著癲癇發作的頻率和發生癲癇的概率。
高遷移組盒1(High mobility group box-1，HMGB1) 是最早發現的致癇損傷誘發產生的神經炎癥介質，在臨床癲癇模型中表現出與癇性發作的產生密切相關。在生理狀態下，HMGB1存在于細胞核中，負責轉錄的調節。免疫激活引起細胞質異位，隨后蛋白質序列中關鍵賴氨酸殘基發生乙酰化。不論是感染或無菌性炎癥，免疫細胞均能釋放HMGB1。壞死細胞死亡導致非乙酰化HMGB1的被動釋放。然后，功能活性由半胱氨酸殘基C23、C45和C106的翻譯后氧化還原修飾決定。二硫化物HMGB1在C23和C45之間有一個二硫鍵，通過Toll樣受體-4結合并發出信號，并通過核因子κB(NF-κB)的活化誘導促炎癥和神經調節作用。完全減少的HMGB1駐留在細胞內并且在釋放后作為細胞趨化因子通過與趨化因子CXCL12形成復合物來與CXCR4結合。癲癇的實驗模型表明乙酰化硫化物形式的HMGB1可導致癲癇中有害的炎癥反應。耐藥性癲癇手術中切下的大腦組織證實炎癥介質的存在，表明持續的無法解決的炎癥反應在由腦損傷導致的癥狀性癲癇的病理過程中起到重要作用。對耐藥性局灶癲癇患者的試驗性研究顯示HMGB1亞型可能成為癲癇分類的候選生物標記物。然而HMGB1并不是癲癇特有的，但它確實給了我們找到一種用來在許多疾病中(包括自身免疫及惡性疾病)進行患者亞群分層的敏感而特異的生物標記物的希望。
在許多疾病模型實驗中已經能成功用藥物抑制HMGB1。其干預措施包括使用多克隆和單克隆抗體直接抑制，使用截斷的HMGB1 A-Box的競爭性抑制，隔離并降解HMGB1(重組可溶性血栓形成)，通過抑制NF-κB途徑來阻斷下游HMGB1的釋放(選擇性a7-煙堿型乙酰膽堿受體激動劑)。由于HMGB1缺乏腦特異性，所以并不能明確外周還是中樞神經系統導致癇性發作或早期療效。
3 血腦屏障
從20世紀50年代起，我們就發現動物持續性癲癇后會出現BBB功能失調。Klatzo及其同事首先描述了由神經血管單位紊亂引起的血管性水腫。在某些情況下，BBB的打開可能會引起急性癲癇發作，而通過其他手段的人工打開導致延遲的癲癇發生。由于高血壓危象導致的BBB打開，如子癇和高血壓性腦病可能涉及血清鎂濃度增高。實驗中BBB的開放造成了延遲性發作，BBB開放在許多不同的神經系統疾病中是很常見的，如腦炎、腦膜炎、卒中、阿爾茨海默病以及別的中樞神經系統疾病。毫無疑問，腦血管功能紊亂是會導致癲癇發作的。在包括癲癇在內的中樞神經系統(CNS)疾病中，腦血管損傷在過去的臨床上被認為會導致癲癇，不過最近的研究才證明確實是癲癇發生的主導機制。現在已有研究提出恢復腦血管完整性作為傳統AEDs的補充方法，在人類癲癇的病例中，數據高度提示在發生癲癇發作的病灶區域中BBB選擇性通透性喪失。
此外，幾個試驗組的數據支持癲癇患者BBB中存在一系列以各種方式參與疾病的分子信號。這包括多重耐藥相關的轉運蛋白和酶的表達，以及葡萄糖轉運體——GLUT-136的異常水平。大多數人體數據來源于離體組織的微觀分析，其中一系列藥物擠壓分子10年前就有報道過，由康福德首次觀察后又有幾個試驗組報道毛細血管或血管漏出物。然而在人體樣本中藥物轉運抑制劑的使用并不能控制耐藥性癲癇。BBB的開放及白蛋白的溢出可能也會導致AEDs或細胞外γ-氨基丁酸(GABA)的緩沖作用，從而影響治療效果或模擬GABA藥物作用。
鑒于BBB對于發作性疾病和癲癇的重要性，癲癇病理生理學方面的生物標記物已經被研究和開發是意料之內的。一般而言，有三種方法來研究癲癇中的BBB功能，這與臨床上用于測量其他神經系統疾病中腦血管完整性大致相同。歷史上，第一種使用的方法就是測量血清白蛋白與CSF白蛋白的比率。這種方法的基本原理本質上與臨床上所有BBB檢測方法是一致的。BBB保護大腦不受血流中的有害物質的損傷，同時提供大腦正常運轉所需的營養物質，并嚴格調節細胞和分子從血液中進入大腦的轉運，還隔離開大腦和血液中非滲透性大分子(>500 Da)。因此，當BBB完整時，白蛋白(其全身濃縮10倍)將產生相當恒定的血液與CSF比率。因此，當BBB完整時，濃縮10倍的白蛋白將產生相當恒定的血液與CSF比率。增強磁共振成像(MRI)是一種與其完全不同的檢測模式，但二者原理相似。這里腦和血液之間的“比率”是在不同部位上測量的，注射進血液中的標志物在大腦中分布及代謝情況是可見的。若有滲出則可以被量化，并進行左右半球對比，沒有滲出則表明BBB是完整的。第三種方式則是BBB的血清標記物，這在10年前第一次提出。大腦會生成獨特的蛋白質，并因有完整的BBB而被隔離在中樞神經系統。當BBB開放時，本應在CNS高濃度聚集的蛋白質會順濃度梯度向血液中擴散。具有臨床意義的理想外周標記應該滿足以下條件：① 此蛋白質或分子在正常血清中濃度較低甚至檢測不到；② 存在于大腦和CSF中，并且在腦實質中具有比在血漿中更高的濃度；③ BBB開放時即可外滲；④ 當腦損傷時能進一步被腦細胞釋放，如反應性神經膠質增多。現已對包括S100B、神經特異性烯醇(NSE)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)在內的幾種蛋白質進行了評估，并發現S100B滿足上述所有特點。現在臨床或人體研究中運用的影像學技術雖然能使用造影劑來測量BBB的完整性，但缺少能顯示結構的必要的高分辨率。通過計算CSF-血清白蛋白比率(QA)和增強MRI，對BBB狀態的功能評估被廣泛接受為BBB通透性的黃金標準。最近一篇文章表明血清S100B與QA相關，從而允許間接測量CSF蛋白質，而不再需要脊椎穿刺。研究表明S100B的陰性預測值與增強MRI等價。
對于創傷性腦外傷(TBI)后延遲癲癇發作這一問題，血清S100B是腦震蕩患者最值得研究的標記物。腦震蕩或一般的TBI，隨病情的發展與否，BBB會快速喪失完整性。S100B則已成為檢查BBB通透性的候選外周生物標記物，血清S100B水平增高反映出BBB的損傷，即可因此預測或排除大腦損傷。最重要的是在使用計算機斷層掃描(CT)檢查出TBI符合顱內事件之后，S100B也會增加。有研究將S100B血清水平與基于CT的TBI診斷進行比較，并報告了> 95%的陰性預測值。由于嚴重的顱內事件與癲癇發作的風險增加相關，與那些可能發生創傷后遺癥的患者相比，S100B在低風險的個體中也能證明其有效性。S100B的一種重要特性是對BBB損害或TBI的后遺癥有優異的陰性預測值，相反其他標記物則更傾向于良好的陽性預測值。比如關于泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1) 這一標記物，最近有Meta分析報道，在總共有1 138個TBI病例和1 373名對照的研究中，TBI患者的血清UCH-L1水平與對照相比顯著增加[加權平均差異0.96，95%CI=(0.31-1.61);P = 0.004]。兩項獨立的關于TBI患者體內S100B的Meta分析總結道，低血清S100B水平能準確測TBI后正常的CT結果，并且當沒有局灶性神經功能缺損或顯著的腦外損傷時應考慮在受損3 h內取得S100B樣本。這些研究建議在 < 0.10 ng / mL這一臨界值時省略CT檢查。因此，我們有機會以一種具有高陰性預測值的測試作為床旁監測來避免許多不必要的掃描，另外，基于實驗室的陽性預測值測試則可以診斷TBI后的并發癥。最近的一篇論文詳細描述了TBI中S100B陰性預測值的價值。
4 氧化還原和代謝因子
在局灶性癲癇中，葡萄糖代謝減少長期以來已知發生在通過正電子發射斷層掃描(PET)研究確定的癲癇發作灶的區域中。原因可能在于神經血管耦合改變，腦組織對葡萄糖攝取減少，或線粒體功能的改變，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD(H)]減少和黃素腺嘌呤二核苷酸[FAD(H)]自體熒光信號的半醌形式。在癲癇發作起始階段，NAD(P)H下降后又飚升，而在人體顳葉癲癇組織中所缺乏，這可能歸因于星形膠質細胞分泌的乳酸鹽、乳酸脫氫酶、神經元攝入的葡萄糖或線粒體能量的改變。三羧酸循環的加速很可能不僅由衰減信號如ATP/ADP比值決定，還與鈣離子有關，因為確定的線粒體酶如丙酮酸脫氫酶是鈣依賴性。鈣離子在細胞液中聚集反過來會造成線粒體去極化從而出現低效呼吸和部分氧的還原，最終導致超氧化物(O2 )的穩態水平增加。
O2、過氧化氫(H2O2)和最終鐵催化的羥基自由基(·OH)的穩態水平增加導致線粒體氧化應激，這可以損害近端易受攻擊的靶標如線粒體蛋白、脂質和DNA。一些證據表明這會造成線粒體基因改變。比如復合體1的亞基在細胞間的差異性分布會造成不同類型細胞的脆弱性差異。除了線粒體，發作還能通過戊糖途徑、黃嘌呤氧化酶以及NADPH氧化酶家族導致活性氧(ROS)的產生。此外，小神經膠質細胞由于酸中毒或吞噬一氧化氮酶(NOX)也與發作導致的ROS產生有關。
不管癲癇的腦組織中ROS產生的部位和來源是什么，現在認識到氧化應激和功能紊亂由致癇損傷引起，并造成癲癇發作和并發癥。我們現已在氧化還原生物學領域中開發了許多能指示氧化應激的有用的生物標志物。組織、血漿和尿中的8-羥基-2-脫氧鳥苷(8OHdG)和F2-異前列烷(F2-IsoP)經驗證是對DNA堿基和脂質氧化損傷很重要的生物標志物。在癲癇持續狀態的動物大腦中易受攻擊的部分以及人類癲癇患者中8OHdG和F2-IsoP均增加。一種評估氧化還原不平衡的更常見的方法是測量可相互轉化的氧化還原對，如NAD(P)H / NAD(P)+，半胱氨酸/胱氨酸和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物(GSH / GSSG)。腦成像發現癲癇患者和癲癇持續狀態下動物海馬中GSH的消耗。總體而言，周圍組織的氧化還原反應以及影像學改變或許能作為癲癇的發展、演進及并發癥中有意義的生物標記物。代謝紊亂的血清標記物，如基于質譜分析或其他分析方法的維生素D代謝物，已經在獲得性癲癇的動物模型中得到驗證。這些生物標志物可以提供與癲癇產生相關的疾病進展和(或)耐藥性的重要信息。
5 激素和生長因子
最近的研究表明生物標記物可以用來評估特定表型的易損性。比如，在強烈的壓力(如社交失敗)下，所有動物都有抑郁表現、氧化應激反應和低血清腦源性神經營養因子(BDNF)水平。幾個星期后，沒有一只動物表現出抑郁，但半數仍保持低血清BDNF水平和氧化應激。當處于較小的壓力下，具有持續低血清BDNF水平的動物(稱為易損者)顯示抑郁樣特征，而具有正常BDNF水平(稱為非脆性)的動物不顯示任何表型。因此，原來的壓力事件使一部分動物致敏，如果他們偶然遇到第二次打擊，則易受傷害。血清BDNF水平可用作易損性的預測性生物標志物。最后，注射BDNF模擬物可使易感人群正常化，使其不易受損。將第二次打擊(輕度應激)替換為癲癇發作(紅藻氨酸誘導的癲癇持續狀態)表明，脆弱動物的癲癇持續狀態閾值較低，發展癲癇更快，并且顯示嚴重的認知缺陷以及抑郁。非易損人群在較慢的時間尺度上發展癲癇，并且不顯示強烈的合并癥。因此，血清BDNF水平預示著易感性即人群在損傷后易發生癲癇，以及在伴有自發性發作的慢性期發展合并癥(抑郁癥和認知缺陷)。
值得注意的是這些結果與大量文獻報道的一旦癲癇發展后BDNF的組織水平增加不矛盾。在前一個例子中，BDNF血清水平是在致癇損傷之前評估的。此結果完全符合臨床研究結果，因為并不是所有的個體都會在損傷后發生癲癇和合并癥。除了可能的臨床表現，這項工作還表明，實驗動物并不是生物等效的，因為它們對相同的打擊有不同的反應。還有一個重要的值得考慮的因素，即其他類別的生物標志物的表達可能取決于動物的特定生物組。
West綜合征是一種罕見的癲癇疾病，發病時間通常在2歲之前，其特征是嬰兒痙攣(IS)伴有高度節律失常或間質腦電圖(EEG)改變的高度節律失常。該綜合征根據已知病因分為癥狀性、遺傳性和隱源性組。較新的分類則將IS分為結構代謝性、隱源性和遺傳性組。
IS患兒CSF中的氧化氮代謝物、硝酸鹽和亞硝酸鹽可以區分癥狀性和隱源性，雖然他們無法估計癥狀的持續時間或預測精神發育的預后。
疾病的機制目前尚不清楚，然而，早期生活壓力已被認為是疾病的觸發點。促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)是腦發育早期強烈導致驚厥的神經肽。雖然CRF可劇烈刺激功能低下的垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素(ACTH)，長期升高的腦CRF會使CRF受體不再敏感，最終減少ACTH釋放。當壓力反復出現時，它會影響到胰島素樣生長因子(IGF-1) 的合成，因為IGF需要類固醇持續聚集。IGF是早期腦發育過程中的重要營養因子，缺乏IGF-1將導致突觸損傷，進而引起從認知功能的減少到癲癇腦病的發生。早期的大腦損傷可能會觸發一系列分子和細胞因子的級聯反應。癲癇由三個過程組成：起初的損傷、潛伏期以及周期性發作。大腦早期損傷通常見于出生后幾個月的IS，而潛伏期則可以成為治療的重點。
IS的一線治療包括免疫抑制劑合成ACTH。ACTH在這種疾病中的治療作用是未知的，但它可能下調CRF和其他應激激素的分泌。IGF影響神經發育的整個過程，并且大腦的生長發育對IGF-1水平非常敏感。IGF-1也減少神經炎癥。ACTH、糖皮質激素和生酮飲食都將影響IGF水平，并已被用于治療IS。在有IS癥狀的患兒中已證明，與其他先天性疾病相比，其CSF IGF-1與ACTH濃度均顯著降低。癥狀性IS的特點是有產前、圍產期或產后損傷的病史。出現產前應激的動物中表現出IGF-1減少。在IS的患者中，CSF中低濃度IGF-1與對治療的不良反應和認知低下相關。大腦不能產生刺激IGF-1分泌的類固醇，而IGF-1是突觸存活的必需生長因子，故其可作為表明疾病嚴重性的生物標志物。CSF低IGF-1的患者對治療無反應，IGF-1水平與智力遲鈍持續惡化之間存在關聯。在IS患者中，CSF IGF-1似乎是治療反應、癲癇進展以及后期認知結果的生物標志物。應當注意，盡管我們在這里強調與疾病發病機制相關的激素和BDNF，但在癲癇患者的血清中已經鑒定出許多其他的蛋白質，例如HSP7076和copeptin77 (表 1)，其病理學作用(如果有的話)仍有待確定。
6 結語
癲癇耐藥性是在諸多方面尚未滿足臨床需求的一種治療領域，需要開發個性化治療。一些生物標志物可以預測首次癲癇發作后的疾病發展和耐藥可能性，鑒定這些標志物可能對臨床過程具有顯著影響。我們應當認識到在本綜述中討論的許多生物標志物同時涉及到許多其他疾病(包括非神經疾病)，未來需要研究可以鑒別癲癇與其他疾病的單個或一組生物標志物。新的治療策略需要整合臨床信息，包括EEG和神經成像、新穎的分子和細胞生物標志物以及基因組信息。
鑒別異常炎癥的生物標志物可能在疾病早期對炎癥有助于維持癲癇狀態患者進行潛在分層。解構炎癥在癲癇中發揮的作用有助于產生新的治療策略來阻止癲癇進展到耐藥表型。現在仍處于起步階段，但人們可以想象在這一領域發明新的產品用于藥物和診斷的潛力。
BBB完整性的標記物是確定各種神經疾病或急性事件(中風，TBI)后遺癥的有用工具。目前正在研究這些標記物是如何幫助預測和診斷癲癇病癥的，但從實驗角度來看，這些標記物已經表明BBB在癲癇發作時被破壞，并且BBB的破壞是癲癇發作的原因。此外，當損壞嚴重以致白蛋白進入間質時，可能影響到藥物有效性，因此BBB完整性的標記物可能有助于制定治療決策。
更好的預測比如腦損傷后癲癇發作的工具，有助于開發新的治療策略來預防癲癇，如免疫調節的干預形式。此外，早期預測耐藥性將意味著可以在較早階段對患者進行神經外科手術的評估，從而避免伴隨相關副作用的AEDs多次試驗，要知道這注定會失敗。
摘譯自：Walker LE，Janigro D，Heinemann U，et al. WONOEP appraisal：molecular and cellular biomarkers for epilepsy. Epilepsia，2016，57(9)：1354-1362.
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