哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在皮質發育不良(Cortical dysplasia, CD)及癲癇動物模型中超活化。在神經元特異性Pten基因敲除(Neuronsubset-specific Pten knockout, NS-Pten KO)小鼠模型中, 盡管在早期癲癇發生過程中抑制mTOR信號通路能夠減少癲癇樣活動, 但mTOR抑制劑在癲癇建立后的作用尚不清楚。文章通過建立伴有嚴重慢性癲癇的NS-Pten KO成年小鼠模型, 探究mTOR抑制劑對其癲癇樣活動和其他神經病理的作用。NS-Pten KO小鼠癲癇樣活動、mTOR信號通路的異常調節和相關神經病理隨年齡增長的變化通過視頻腦電(video-electroencephalography, VEEG), 蛋白免疫印跡和免疫組化檢測。NS-Pten KO小鼠出生后9周開始接受mTOR抑制劑雷帕霉素治療(10 mg/kg i.p, 5d/周)并采用VEEG監測癲癇樣活動。通過蛋白免疫印跡和免疫組化檢測雷帕霉素的作用。試驗發現, 隨著年齡增長, NS-Pten KO小鼠的癲癇樣活動惡化, 同時伴有mTOR復合物1和2(mTOR complex 1 and 2, mTORC1 and mTORC2)調節異常和進展性的星形膠質細胞和小膠質細胞增生。雷帕霉素治療抑制癲癇樣活動, 改善基線腦電活動并提高嚴重癲癇NS-PtenKO小鼠的預后。在分子水平, 雷帕霉素治療降低mTORC1和mTORC2水平并減少星形膠質細胞和小膠質細胞增生。研究表明在NS-Pten KO小鼠中, 雷帕霉素成功治療癲癇有較寬的時間窗。抑制mTOR可能是CD伴慢性癲癇及mTOR信號通路基因調節異常的潛在治療手段。
引用本文： NguyenLH, BrewsterAL, ClarkME, Regnier-GolanovA, SunnenCN, PatilVV, D′ArcangeloG, AndersonAE, 遲瀟灑, 慕潔. mTOR抑制劑抑制皮質發育不良小鼠癲癇發作. 癲癇雜志, 2017, 3(1): 70-79. doi: 10.7507/2096-0247.20170011 復制
皮質發育不良(Cortical dysplasia, CD)是一種皮質發育畸形，目前為兒童難治性癲癇的常見病因。CD與編碼哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路(mammalian target of rapamycin, mTOR)調控蛋白的基因突變有關，包括結節性硬化復合物1(Tuberous sclerosis complex1，TSC1)，結節性硬化復合物2(Tuberous sclerosis complex2，TSC2)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)，蛋白激酶(Protein kinase B，AKT)，mTOR和STE-20相關激酶調節亞基α(STE20-related kinase adaptor alpha, STRADA)，提示mTOR信號通路在CD和相關癲癇表型的病理生理機制中發揮重要作用。
mTOR信號通路調控包括細胞生長、增殖、蛋白分泌、神經元形態和皮質發育等多種重要神經功能，近期逐漸成為癲癇的新型潛在治療靶點。在基因小鼠模型中，mTOR信號通路因缺乏上游調控子同源性磷酸酶-張力蛋白(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)和結節性硬化復合物(Tuberous sclerosis complex，TSC)而過度活化，被證明與皮質畸形和癲癇發生有關。在一些獲得性顳葉癲癇(Temporal lobeepilepsy，TLE)嚙齒動物模型中，mTOR信號通路異常在癲癇發生和維持中發揮重要作用。mTOR已被證實在CD4，TSC和TLE患者腦組織中過度活化。
mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過兩個不同的復合物發揮作用：mTORC1和mTORC2。mTORC1特異性地使mTOR和Raptor結合，是一種雷帕霉素敏感的復合物，通過激活翻譯過程調節蛋白分泌。mTORC2對雷帕霉素不敏感，使mTOR和Rictor結合，參與細胞存活、代謝和肌動蛋白動力。盡管mTORC2對急性雷帕霉素暴露不敏感，但可以被長期雷帕霉素治療抑制。
為了研究mTOR信號通路在癲癇和CD中的作用，我們前期建立了神經元特異性Pten基因敲除(Neuronsubset-specific Pten knockout, NS-Pten KO)小鼠模型，呈現mTOR信號通路過度激活和CD患者特征，包括神經元過度肥大，皮質和海馬組織破壞，異常苔蘚纖維發芽和癲癇。這些異常表現在出生后4~6周明顯并隨著年齡增長惡化。有趣的是，在出生后第4、5周采用mTOR抑制劑雷帕霉素治療能短期抑制癲癇樣活動，神經元過度肥大和苔蘚纖維發芽。雷帕霉素治療2周后停藥4周可長期抑制癲癇樣活動。未接受治療的小鼠癲癇加重且過早死亡。在既往研究中，雷帕霉素治療均在癲癇發生前開始，即癲癇樣活動和病理改變未完全建立前。由此，mTOR抑制劑在大腦神經元回路異常連接和癲癇建立后是否有效這一重要問題仍未被回答。因此在本研究中，我們探究mTOR抑制劑在伴有嚴重慢性癲癇和神經病理的成年NS-Pten KO小鼠模型中的作用。
1 方法
1.1 實驗動物
NS-Pten KO小鼠在之前的研究中已詳細闡述。通過繁育雜合子獲得同胎野生型(Wild-type，WT)和NS-Pten KO型小鼠。所有實驗使用的小鼠均包含雌雄兩個性別。動物保護和使用遵循美國國立衛生研究所實驗動物管理和使用指南，研究通過貝勒醫學院動物管理和使用委員會同意。
1.2 雷帕霉素使用
雷帕霉素(LC Laboratories, 沃本, 馬薩諸塞州, 美國)溶解在4%乙醇，5%聚乙二醇400和5%吐溫80的載體溶劑中。13只NS-Pten KO和11只WT小鼠出生后第9周開始接受每周5 d的腹腔注射雷帕霉素治療(10 mg/kg體重)。14只NS-Pten KO和10只WT小鼠同時接受載體治療。15只NS-Pten KO和11只WT小鼠未接受任何治療作為空白對照。空白對照和載體組小鼠基因型差異無統計學差異(數據未列出)，因此通過概略地平衡空白對照和載體組動物只數將兩組合并為對照組(將分別與WT或NS-Pten KO對照)。治療組的小鼠一半采用video-EEG監測而另一半用于免疫蛋白印跡(Western blotting, WB)。
1.3 免疫蛋白印跡
海馬組織WB操作如前述。所有免疫反應條帶的灰度值以肌動蛋白(actin)水平為內參進行校準。磷酸化蛋白水平隨后以總蛋白水平進行校準。結果以表達量占8~9周WT小鼠或對照組WT小鼠百分比表示。
1.4 免疫組織化學
采用免疫組織化學法對多聚甲醛固定的腦組織切片進行染色，操作方法同之前研究描述。細胞核通過標準尼氏染色法進行染色。采用LSM700激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, 索恩伍德, 紐約, 美國)或者BX51光學顯微鏡(Olympus, 中心谷, 賓夕法尼亞州, 美國)進行圖像采集。所有的圖片統一進行比較。
1.5 統計學分析
采用Prism 5軟件(GraphPad，拉荷亞，加利福尼亞州，美國)分析。數據以均數±標準差表示，符合正態分布的數據進行參數檢驗，非正態分布數據進行非參數檢驗。特殊檢驗在圖例中標注。P值＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 NS-Pten KO小鼠癲癇隨著年齡增加而惡化
NS-Pten KO小鼠表現為異常腦電圖(EEG)電活動和自發癇性發作。為了進一步表現癲癇表型的進展，我們在出生后3周采用VEEG連續數周監測NS-Pten KO和WT小鼠。癲癇樣活動表現為棘波，重復棘波和多棘波活動，且NS-Pten KO小鼠早期表現為癇性發作并隨著年齡增加而頻繁發作。相比之下，WT小鼠在任何年齡下均未表現異常EEG電活動(圖 1a)。EEG電活動量化分析結果顯示NS-Pten KO小鼠出生后9周的異常電活動明顯高于4周，差異有統計學意義(P＜0.001，圖 1b)。在9周及更大的NS-Pten KO小鼠中，亞臨床多棘波和癇性發作幾乎持續整個記錄周期(圖 1c)。除了亞臨床癲癇樣活動，NS-Pten KO小鼠也表現出間斷的運動性發作，包括肌陣攣抽搐、前肢強直陣攣、亂跑、失去平衡。EEG顯示，運動性發作時棘波頻率和波幅均增加，進而發展為持續10 s的棘慢復合波和發作后EEG電活動抑制(圖 1d)。在出生后8~11周運動性發作頻率較3~6周時明顯增加(P=0.045，圖 1e)。總之，結果顯示NS-Pten KO小鼠癲癇表型逐漸惡化。
圖1
NS-Pten KO小鼠癲癇隨年齡增加而進展性惡化
a. 9周WT和4、6、9周NS-
NS-Pten KO小鼠mTORC1和mTORC2信號通路異常活化隨年齡而增加。因為mTOR信號通路異常在NS-Pten KO小鼠癲癇發作中發揮重要作用，我們探究癲癇表型進展是否跟mTOR異常程度有關(圖 1)。由于特異性的敲除海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)顆粒細胞的Pten基因，我們將研究集中在海馬結構，并且癇性發作被證實起源于NS-Pten KO小鼠的海馬和皮質。此外，NS-Pten KO小鼠的Pten基因敲除和癇性發作與海馬畸形有關，包括明顯的組織破壞、發育不良、巨大細胞和異常苔蘚纖維發芽。在出生后2、4、6和8~9周取小鼠海馬組織，采用免疫蛋白印跡檢測NS-Pten KO和WT小鼠mTOR活化水平隨時間變化。磷酸化S6核糖體蛋白水平(phosphorylation of S6 ribosomal protein, p-S6(S240/244))和p-AKT (S473)分別作為mTORC1和mTORC2激活的標志。同時采用免疫組織化學比較6周時NS-Pten KO和WT小鼠p-S6和p-AKT分布情況。
出生后2周NS-Pten KO和WT小鼠海馬p-S6水平顯著高于出生后8~9周成年WT小鼠(P＜0.001)。在WT小鼠中，p-S6水平隨年齡增加而下降，與之前研究結果相符。然而，在NS-Pten KO小鼠中，p-S6水平在整個監測時間點均持續升高。在出生后6周和8~9周，NS-Pten KO小鼠p-S6水平顯著高于年齡匹配的WT小鼠(P＜0.001，圖 2a)。WT小鼠海馬p-AKT水平在出生后2周至8~9周期間均不變化，但是在NS-Pten KO小鼠中隨年齡增加。在出生后4周，NS-Pten KO小鼠p-AKT水平顯著高于年齡匹配的WT小鼠(P＜0.05)，且差異在出生后6周和8~9周變大(P＜0.001，圖 2 b)。
圖2
NS-Pten KO小鼠異常mTORC1 and mTORC2信號通路隨年齡增長而增加
a、b.出生后2、4、6和8~9周NS-
6周大的WT小鼠p-S6染色陽性細胞見于CA1和CA3區椎體細胞層，同時見于DG顆粒細胞層，但染色強度較弱(圖 2c左側第一行)。但在NS-Pten KO小鼠中DG顆粒細胞層p-S6染色明顯增強。與WT小鼠相比，NS-Pten KO小鼠CA3區p-S6相對較弱，但在CA1區兩者染色程度未見明顯差異(圖 2 c左側第二行)。在NS-Pten KO和WT小鼠中，p-S6和神經元標志物NeuN共定位顯示p-S6均在DG顆粒細胞層富集。NS-Pten KO小鼠的DG顆粒細胞明顯增大，與之前的研究一致(圖 2 c右側列)。p-AKT染色陽性細胞見于WT小鼠的CA1，CA3和DG細胞層，且CA3區最明顯(圖 2 d左側第一行)。而NS-Pten KO小鼠p-AKT染色在DG區分子和顆粒細胞層更明顯(圖 2 d左側第二行)。與WT小鼠相比，NS-Pten KO小鼠p-AKT染色在CA3區相對較弱，但CA1區染色兩組差異無統計學意義。在NS-Pten KO和WT小鼠的DG顆粒細胞均可見p-AKT染色陽性(圖 2 d右側列)。
總的來說，結果顯示在NS-Pten KO小鼠海馬區mTORC1和mTORC2異常調節隨年齡增加而增加，伴有癲癇表型惡化。而且mTORC1和mTORC2異常激活主要集中在DG區，既往研究表明該區Pten缺失。
2.2 NS-Pten KO小鼠膠質標記物隨年齡而增加
因為mTOR信號通路在很多膠質細胞特性和海馬膠質細胞增生發揮重要作用，與癇性發作和癲癇相關。對出生后2、4、6和8~9周的NS-Pten KO和WT小鼠海馬組織進行WB檢測，評估星形膠質細胞標志物膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質細胞標志物鈣離子接頭蛋白-1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA1)。NS-Pten KO和WT小鼠出生后2、4周時GFAP表達水平無統計學差異。然而在出生后6和8~9周，NS-Pten KO小鼠GFAP水平明顯高于同齡的WT小鼠(P＜0.001，圖 3 a)。同樣的，IBA1水平在出生后2、4和6周NS-Pten KO和WT小鼠差異無統計學意義，但在8~9周，NS-Pten KO小鼠IBA1水平明顯高于WT小鼠，差異有統計學意義(P＜0.05, 圖 3 b)。
圖3
NS-Pten KO小鼠神經膠質標志物隨年齡增長而增加
a、b.出生后2、4、6和8~9周NS-
免疫組織化學結果顯示7~9周NS-Pten KO和WT小鼠海馬遍布GFAP標記的星形膠質細胞和IBA1標記的小膠質細胞，但是在NS-Pten KO小鼠中染色更強(圖 3c、d)。值得一提的是，NS-Pten KO小鼠CA1區小膠質細胞增大且呈阿米巴樣，而WT小鼠小膠質細胞表現為分枝狀。
總之，結果顯示年長NS-Pten KO小鼠比年幼小鼠星形膠質細胞和小膠質細胞明顯增多，表明年齡依賴性的膠質增生同時伴有癲癇惡化和mTOR異常活化。并且，小膠質細胞形態的變化與小膠質細胞激活一致，在NS-Pten KO小鼠中更常見，表明反應性的小膠質細胞增生。
2.3 雷帕霉素治療抑制伴有嚴重癲癇的NS-Pten KO小鼠的癲癇樣活動并改善基線腦電活動
在之前的研究中，我們發現在NS-Pten KO小鼠出生后4周開始使用雷帕霉素治療能夠抑制癲癇樣活動并防止癲癇進展。為了探究mTOR抑制劑在病理晚期能否抑制NS-Pten KO小鼠癲癇樣活動，我們將雷帕霉素治療時間推遲至出生后9周(圖 4a)。在這個年齡，癲癇表型已建立并嚴重，表現為持續性的亞臨床癲癇樣電活動和運動性發作(圖 1)。盡管在對照組和雷帕霉素治療WT小鼠中未檢測到異常EEG活動，但在NS-Pten KO小鼠中癲癇樣電活動隨雷帕霉素治療而減少(圖 4 b)。雷帕霉素治療后3~4周EEG活動定量分析結果顯示，治療組NS-Pten KO小鼠出生后12~13周明顯低于同齡對照NS-Pten KO小鼠(P=0.008，圖 4c)。對雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠進一步組內分析結果顯示EEG癲癇樣活動在治療后顯著減少(P=0.005)。而對照組NS-Pten KO小鼠EEG電活動未見明顯異常(圖 4 d)。與對照組NS-Pten KO小鼠相比，雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠棘波和運動性發作顯著減少(P=0.0043；P=0.026，圖 4e、f)，進一步支持雷帕霉素改善癲癇樣電活動。
圖4
雷帕霉素治療抑制癲癇樣活動并改善伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠基線腦電活動
a. VEEG監測和雷帕霉素治療的時間軸。出生8~13周，每周采用vEEG監測小鼠活動，出生后9周開始進行雷帕霉素治療直到死亡，所有EEG分析均在出生后12~13周，即治療后3~4周開始，而運動性發作頻率在出生后9~13周均進行評估；b.典型的EEG示對照和雷帕霉素治療WT小鼠正常腦電活動，對照NS-
總的來說，研究結果顯示雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠晚期病理階段能夠抑制癲癇表型。
出生后8周的EEG結果顯示NS-Pten KO小鼠和WT小鼠基線電活動差異無統計學意義。然而，在出生后12~13周，WT小鼠總能量顯著下降(P＜0.001)，NS-Pten KO小鼠顯著升高(P＜0.05)。出生后12~13周，治療組NS-Pten KO小鼠異常總能量比對照組NS-Pten KO小鼠顯著增高，但是治療組NS-Pten KO小鼠和對照組WT小鼠差異無統計學意義(圖 4g)。這些結果提示雷帕霉素治療也能改善NS-Pten KO小鼠基線EEG電活動。
2.4 雷帕霉素治療提高伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠的存活率
NS-Pten KO小鼠死亡較早，平均壽命為(10.7±1.9)周。研究發現早期使用雷帕霉素能夠延長NS-Pten KO小鼠的壽命，我們探究晚期使用雷帕霉素是否也能改善存活率。研究中對照組NS-Pten KO小鼠僅有33%(4/12)存活至出生后16周。雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠存活率明顯高于對照組NS-Pten KO小鼠(P=0.034)，86%(6/7)存活至出生后16周。相比之下，所有對照組和雷帕霉素治療組WT小鼠均存活超過16周(圖 5)。
圖5
雷帕霉素治療提高伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠存活率
對照組和雷帕霉素治療組NS-
總的來說，結果顯示晚期雷帕霉素治療伴嚴重癲癇的NS-Pten KO小鼠能有效延長生存率。
2.5 雷帕霉素治療抑制伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠的mTORC1和mTORC2信號通路和膠質增生
因為長期雷帕霉素治療可能影響mTORC1和mTORC2信號通路，我們評估了雷帕霉素長期治療NS-Pten KO和WT小鼠的信號通路變化。雷帕霉素治療NS-Pten KO和WT小鼠后，WB分析顯示其海馬p-S6水平低于對照組WT水平(P＜0.05，圖 6 a)。WT小鼠接受雷帕霉素治療后海馬p-AKT水平變化無明顯差異，但治療組NS-Pten KO小鼠p-AKT水平顯著低于對照組NS-Pten KO小鼠(P＜0.001，圖 6 b)。
圖6
雷帕霉素治療抑制伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠mTORC1、mTORC2信號通路和神經膠質標志物
a~d.出生后11周對照及雷帕霉素治療NS-
因為NS-Pten KO小鼠海馬GFAP和IBA1水平改變(圖 3)且mTOR活化能調節神經膠質活動，我們也檢測了雷帕霉素治療對NS-Pten KO和WT小鼠海馬GFAP和IBA1水平影響。雷帕霉素治療對WT小鼠海馬GFAP和IBA1水平沒有顯著影響。然而NS-Pten KO小鼠異常升高的GFAP和IBA1水平隨著雷帕霉素治療而顯著降低(P＜0.05；P＜0.01，圖 6 c、d)。治療組NS-Pten KO小鼠GFAP水平顯著低于對照組NS-Pten KO小鼠(P＜0.05)，但仍顯著高于對照組WT小鼠(P＜0.05)，證明雷帕霉素有部分抑制作用(圖 6c)。治療組NS-Pten KO小鼠IBA1水平明顯降低，接近對照組WT小鼠(圖 6 d)。
總的來說，結果證明，晚期雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠能夠抑制mTORC1和mTORC2信號通路，并且能降低海馬GFAP和IBA1水平，證明mTOR抑制劑能降低NS-Pten KO小鼠神經膠質標志物表達。
3 討論
mTOR抑制劑已經成為癲癇治療的新方式，目前很多研究正努力探究其在mTOR信號通路疾病例如CD和TSC的臨床效能。在本研究中，我們探究mTOR抑制劑雷帕霉素在嚴重病理改變已形成的NS-Pten KO小鼠CD模型中是否能抑制癲癇發作。我們發現NS-Pten KO小鼠隨著年齡增加癲癇樣電活動惡化同時伴有mTOR信號通路異常，星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生。并且，我們也證明在晚期病理階段使用雷帕霉素能減弱癲癇樣電活動，降低神經膠質標志物異常水平并延長小鼠的壽命。總之，研究結果提示雷帕霉素治療是該模型慢性癲癇的有效治療手段。而且我們的研究證明NS-Pten KO小鼠星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生能夠被雷帕霉素治療抑制，成為該模型癲癇治療的新方向。
NS-Pten KO小鼠的癲癇表型與神經元Pten敲除和mTOR過度活化有關。NS-Pten KO小鼠由出生后4周的偶爾棘波活動進展到成年后持續性的多棘波和癇性活動，證明該模型小鼠有持續進展性癲癇發生過程。除了癲癇程度的惡化，我們也發現年長NS-Pten KO小鼠反復運動性發作頻率增加。然而，這一分析的敏感性可能因間斷性的記錄而降低，其實際發作頻率可能更好。因為癇性發作多變且成簇發作，更長的記錄時間可能會提供更準確的結果。
因為mTOR信號通路參與神經元過度興奮和癲癇發展，NS-Pten KO小鼠癲癇表型的惡化可能跟mTOR信號通路異常活化的持續性增加有關。因為化學致癇藥物誘導的TLE模型中mTOR信號通路因癇性發作誘導而增加，NS-Pten KO小鼠mTOR信號通路活化持續增加也可能是癇性發作本身誘導異常信號通路調節。這反過來可導致癇性發作惡化，mTOR異常調節，形成惡性循環。因為該模型大多數Pten基因敲除發生在神經發生的DG區，另一種假說是出生后新生的神經元增加Pten陰性神經元mTOR異常激活，因此加劇了mTOR異常調節和癲癇。研究也證實小部分DG區顆粒細胞Pten敲除可使mTOR過度活化而導致癲癇。今后的研究需進一步評估該模型出生后生成的神經元是否為Pten陰性，以及與mTOR過度活化程度和癲癇嚴重度的關系。
癲癇表型的惡化也可能是由于導致癇性發作的繼發機制所致。考慮到神經膠質參與神經元過度興奮和癲癇發生過程，NS-Pten KO小鼠的星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生可能導致癲癇惡化。盡管神經膠質標志物水平升高可能是神經元Pten敲除的間接效應，但其水平增高發生在癇性發作明顯之后，表明該現象是繼發于癇性發作。并且雖然mTOR異常激活主要集中在DG區，而在CA1和CA3區比較少見，星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生彌漫整個海馬。由于星形膠質細胞和小膠質細胞在大腦炎癥和癲癇炎性介質中的作用，探究星形膠質細胞介導的大腦炎性反應是否存在于NS-Pten KO小鼠及其對癲癇進展的作用將很有意義。
在該模型及其他相關遺傳性癲癇模型中，在癲癇發生早期使用mTOR抑制劑干預能夠成功防止癲癇發作，因此mTOR抑制劑已經成為mTOR信號通路突變有關癲癇的潛在改善病情的藥物。在近期的臨床試驗中，依維莫司(雷帕霉素衍生物)治療能有效減少超過50%(12/20)伴難治性癲癇TSC患者的癇性發作。然而一些患者對治療無反應，這使得研究者提出干預時機是否導致陽性結果的關鍵點。在TSC KO小鼠和另外一個NS-Pten KO小鼠模型中，雷帕霉素能成功抑制癲癇發作，但治療均是在癲癇開始后立即進行。因此為了探究雷帕霉素治療是否能夠治療已完全建立的癲癇，我們在開始治療前等待較長時間。在本研究中雷帕霉素開始使用時，NS-Pten KO小鼠表現為嚴重的mTOR異常調節和慢性癲癇樣活動。我們發現即使在病理已完全建立后再使用雷帕霉素治療仍能有效抑制mTORC1和mTORC2過度活化。這與其他研究一致，提示mTOR在癲癇維持中發揮重要作用，并且是一些癲癇的重要抗癲癇靶點。有趣的是，雷帕霉素治療也能夠降低NS-Pten KO小鼠膠質標志物異常增高水平，可能是通過該藥的免疫抑制特性。因此雷帕霉素介導的抑制作用也會改善NS-Pten KO小鼠的癲癇發作。
NS-Pten KO小鼠平均在出生后10~11周即過早死亡。在之前的研究中，早期單次雷帕霉素治療不能改善小鼠存活率。然而間歇性治療能顯著改善小鼠壽命。我們的研究發現雷帕霉素治療也能夠提高NS-Pten KO小鼠生存率，提示盡管雷帕霉素需要反復使用，但不需要早期進行。
之前對癲癇動物模型的研究都主要集中在mTORC1，因為其對雷帕霉素敏感。然而本研究及既往研究均顯示雷帕霉素治療也能夠影響mTORC2。mTORC2調控肌動蛋白細胞骨架動力，參與神經元形態和突觸功能，因此mTORC2信號通路異常調節可能是癲癇的重要病因。因此，雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠部分效應可能是由于mTORC2被抑制。mTORC1和mTORC2在癲癇病理中的作用仍需進一步探究，但由于缺乏mTORC2特異性抑制劑而具有挑戰性。
總之，本研究證明雷帕霉素成功治療NS-Pten KO的CD小鼠模型癲癇發作有較寬時間窗。盡管mTOR信號通路下游參與構建癲癇神經網絡的分子靶點仍需進一步研究，本研究為mTOR抑制劑治療遺傳性CD模型提供了臨床前證據。
譯自：Nguyen LH, Brewster AL, Clark ME, et al. mTOR inhibition suppresses established epilepsy in a mouse model of cortical dysplasia. Epilepsia, 2015, 56(4): 636-646.
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皮質發育不良(Cortical dysplasia, CD)是一種皮質發育畸形，目前為兒童難治性癲癇的常見病因。CD與編碼哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路(mammalian target of rapamycin, mTOR)調控蛋白的基因突變有關，包括結節性硬化復合物1(Tuberous sclerosis complex1，TSC1)，結節性硬化復合物2(Tuberous sclerosis complex2，TSC2)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-kinase，PI3K)，蛋白激酶(Protein kinase B，AKT)，mTOR和STE-20相關激酶調節亞基α(STE20-related kinase adaptor alpha, STRADA)，提示mTOR信號通路在CD和相關癲癇表型的病理生理機制中發揮重要作用。
mTOR信號通路調控包括細胞生長、增殖、蛋白分泌、神經元形態和皮質發育等多種重要神經功能，近期逐漸成為癲癇的新型潛在治療靶點。在基因小鼠模型中，mTOR信號通路因缺乏上游調控子同源性磷酸酶-張力蛋白(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)和結節性硬化復合物(Tuberous sclerosis complex，TSC)而過度活化，被證明與皮質畸形和癲癇發生有關。在一些獲得性顳葉癲癇(Temporal lobeepilepsy，TLE)嚙齒動物模型中，mTOR信號通路異常在癲癇發生和維持中發揮重要作用。mTOR已被證實在CD4，TSC和TLE患者腦組織中過度活化。
mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過兩個不同的復合物發揮作用：mTORC1和mTORC2。mTORC1特異性地使mTOR和Raptor結合，是一種雷帕霉素敏感的復合物，通過激活翻譯過程調節蛋白分泌。mTORC2對雷帕霉素不敏感，使mTOR和Rictor結合，參與細胞存活、代謝和肌動蛋白動力。盡管mTORC2對急性雷帕霉素暴露不敏感，但可以被長期雷帕霉素治療抑制。
為了研究mTOR信號通路在癲癇和CD中的作用，我們前期建立了神經元特異性Pten基因敲除(Neuronsubset-specific Pten knockout, NS-Pten KO)小鼠模型，呈現mTOR信號通路過度激活和CD患者特征，包括神經元過度肥大，皮質和海馬組織破壞，異常苔蘚纖維發芽和癲癇。這些異常表現在出生后4~6周明顯并隨著年齡增長惡化。有趣的是，在出生后第4、5周采用mTOR抑制劑雷帕霉素治療能短期抑制癲癇樣活動，神經元過度肥大和苔蘚纖維發芽。雷帕霉素治療2周后停藥4周可長期抑制癲癇樣活動。未接受治療的小鼠癲癇加重且過早死亡。在既往研究中，雷帕霉素治療均在癲癇發生前開始，即癲癇樣活動和病理改變未完全建立前。由此，mTOR抑制劑在大腦神經元回路異常連接和癲癇建立后是否有效這一重要問題仍未被回答。因此在本研究中，我們探究mTOR抑制劑在伴有嚴重慢性癲癇和神經病理的成年NS-Pten KO小鼠模型中的作用。
1 方法
1.1 實驗動物
NS-Pten KO小鼠在之前的研究中已詳細闡述。通過繁育雜合子獲得同胎野生型(Wild-type，WT)和NS-Pten KO型小鼠。所有實驗使用的小鼠均包含雌雄兩個性別。動物保護和使用遵循美國國立衛生研究所實驗動物管理和使用指南，研究通過貝勒醫學院動物管理和使用委員會同意。
1.2 雷帕霉素使用
雷帕霉素(LC Laboratories, 沃本, 馬薩諸塞州, 美國)溶解在4%乙醇，5%聚乙二醇400和5%吐溫80的載體溶劑中。13只NS-Pten KO和11只WT小鼠出生后第9周開始接受每周5 d的腹腔注射雷帕霉素治療(10 mg/kg體重)。14只NS-Pten KO和10只WT小鼠同時接受載體治療。15只NS-Pten KO和11只WT小鼠未接受任何治療作為空白對照。空白對照和載體組小鼠基因型差異無統計學差異(數據未列出)，因此通過概略地平衡空白對照和載體組動物只數將兩組合并為對照組(將分別與WT或NS-Pten KO對照)。治療組的小鼠一半采用video-EEG監測而另一半用于免疫蛋白印跡(Western blotting, WB)。
1.3 免疫蛋白印跡
海馬組織WB操作如前述。所有免疫反應條帶的灰度值以肌動蛋白(actin)水平為內參進行校準。磷酸化蛋白水平隨后以總蛋白水平進行校準。結果以表達量占8~9周WT小鼠或對照組WT小鼠百分比表示。
1.4 免疫組織化學
采用免疫組織化學法對多聚甲醛固定的腦組織切片進行染色，操作方法同之前研究描述。細胞核通過標準尼氏染色法進行染色。采用LSM700激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, 索恩伍德, 紐約, 美國)或者BX51光學顯微鏡(Olympus, 中心谷, 賓夕法尼亞州, 美國)進行圖像采集。所有的圖片統一進行比較。
1.5 統計學分析
采用Prism 5軟件(GraphPad，拉荷亞，加利福尼亞州，美國)分析。數據以均數±標準差表示，符合正態分布的數據進行參數檢驗，非正態分布數據進行非參數檢驗。特殊檢驗在圖例中標注。P值＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 NS-Pten KO小鼠癲癇隨著年齡增加而惡化
NS-Pten KO小鼠表現為異常腦電圖(EEG)電活動和自發癇性發作。為了進一步表現癲癇表型的進展，我們在出生后3周采用VEEG連續數周監測NS-Pten KO和WT小鼠。癲癇樣活動表現為棘波，重復棘波和多棘波活動，且NS-Pten KO小鼠早期表現為癇性發作并隨著年齡增加而頻繁發作。相比之下，WT小鼠在任何年齡下均未表現異常EEG電活動(圖 1a)。EEG電活動量化分析結果顯示NS-Pten KO小鼠出生后9周的異常電活動明顯高于4周，差異有統計學意義(P＜0.001，圖 1b)。在9周及更大的NS-Pten KO小鼠中，亞臨床多棘波和癇性發作幾乎持續整個記錄周期(圖 1c)。除了亞臨床癲癇樣活動，NS-Pten KO小鼠也表現出間斷的運動性發作，包括肌陣攣抽搐、前肢強直陣攣、亂跑、失去平衡。EEG顯示，運動性發作時棘波頻率和波幅均增加，進而發展為持續10 s的棘慢復合波和發作后EEG電活動抑制(圖 1d)。在出生后8~11周運動性發作頻率較3~6周時明顯增加(P=0.045，圖 1e)。總之，結果顯示NS-Pten KO小鼠癲癇表型逐漸惡化。
圖1
NS-Pten KO小鼠癲癇隨年齡增加而進展性惡化
a. 9周WT和4、6、9周NS-
NS-Pten KO小鼠mTORC1和mTORC2信號通路異常活化隨年齡而增加。因為mTOR信號通路異常在NS-Pten KO小鼠癲癇發作中發揮重要作用，我們探究癲癇表型進展是否跟mTOR異常程度有關(圖 1)。由于特異性的敲除海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)顆粒細胞的Pten基因，我們將研究集中在海馬結構，并且癇性發作被證實起源于NS-Pten KO小鼠的海馬和皮質。此外，NS-Pten KO小鼠的Pten基因敲除和癇性發作與海馬畸形有關，包括明顯的組織破壞、發育不良、巨大細胞和異常苔蘚纖維發芽。在出生后2、4、6和8~9周取小鼠海馬組織，采用免疫蛋白印跡檢測NS-Pten KO和WT小鼠mTOR活化水平隨時間變化。磷酸化S6核糖體蛋白水平(phosphorylation of S6 ribosomal protein, p-S6(S240/244))和p-AKT (S473)分別作為mTORC1和mTORC2激活的標志。同時采用免疫組織化學比較6周時NS-Pten KO和WT小鼠p-S6和p-AKT分布情況。
出生后2周NS-Pten KO和WT小鼠海馬p-S6水平顯著高于出生后8~9周成年WT小鼠(P＜0.001)。在WT小鼠中，p-S6水平隨年齡增加而下降，與之前研究結果相符。然而，在NS-Pten KO小鼠中，p-S6水平在整個監測時間點均持續升高。在出生后6周和8~9周，NS-Pten KO小鼠p-S6水平顯著高于年齡匹配的WT小鼠(P＜0.001，圖 2a)。WT小鼠海馬p-AKT水平在出生后2周至8~9周期間均不變化，但是在NS-Pten KO小鼠中隨年齡增加。在出生后4周，NS-Pten KO小鼠p-AKT水平顯著高于年齡匹配的WT小鼠(P＜0.05)，且差異在出生后6周和8~9周變大(P＜0.001，圖 2 b)。
圖2
NS-Pten KO小鼠異常mTORC1 and mTORC2信號通路隨年齡增長而增加
a、b.出生后2、4、6和8~9周NS-
6周大的WT小鼠p-S6染色陽性細胞見于CA1和CA3區椎體細胞層，同時見于DG顆粒細胞層，但染色強度較弱(圖 2c左側第一行)。但在NS-Pten KO小鼠中DG顆粒細胞層p-S6染色明顯增強。與WT小鼠相比，NS-Pten KO小鼠CA3區p-S6相對較弱，但在CA1區兩者染色程度未見明顯差異(圖 2 c左側第二行)。在NS-Pten KO和WT小鼠中，p-S6和神經元標志物NeuN共定位顯示p-S6均在DG顆粒細胞層富集。NS-Pten KO小鼠的DG顆粒細胞明顯增大，與之前的研究一致(圖 2 c右側列)。p-AKT染色陽性細胞見于WT小鼠的CA1，CA3和DG細胞層，且CA3區最明顯(圖 2 d左側第一行)。而NS-Pten KO小鼠p-AKT染色在DG區分子和顆粒細胞層更明顯(圖 2 d左側第二行)。與WT小鼠相比，NS-Pten KO小鼠p-AKT染色在CA3區相對較弱，但CA1區染色兩組差異無統計學意義。在NS-Pten KO和WT小鼠的DG顆粒細胞均可見p-AKT染色陽性(圖 2 d右側列)。
總的來說，結果顯示在NS-Pten KO小鼠海馬區mTORC1和mTORC2異常調節隨年齡增加而增加，伴有癲癇表型惡化。而且mTORC1和mTORC2異常激活主要集中在DG區，既往研究表明該區Pten缺失。
2.2 NS-Pten KO小鼠膠質標記物隨年齡而增加
因為mTOR信號通路在很多膠質細胞特性和海馬膠質細胞增生發揮重要作用，與癇性發作和癲癇相關。對出生后2、4、6和8~9周的NS-Pten KO和WT小鼠海馬組織進行WB檢測，評估星形膠質細胞標志物膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質細胞標志物鈣離子接頭蛋白-1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA1)。NS-Pten KO和WT小鼠出生后2、4周時GFAP表達水平無統計學差異。然而在出生后6和8~9周，NS-Pten KO小鼠GFAP水平明顯高于同齡的WT小鼠(P＜0.001，圖 3 a)。同樣的，IBA1水平在出生后2、4和6周NS-Pten KO和WT小鼠差異無統計學意義，但在8~9周，NS-Pten KO小鼠IBA1水平明顯高于WT小鼠，差異有統計學意義(P＜0.05, 圖 3 b)。
圖3
NS-Pten KO小鼠神經膠質標志物隨年齡增長而增加
a、b.出生后2、4、6和8~9周NS-
免疫組織化學結果顯示7~9周NS-Pten KO和WT小鼠海馬遍布GFAP標記的星形膠質細胞和IBA1標記的小膠質細胞，但是在NS-Pten KO小鼠中染色更強(圖 3c、d)。值得一提的是，NS-Pten KO小鼠CA1區小膠質細胞增大且呈阿米巴樣，而WT小鼠小膠質細胞表現為分枝狀。
總之，結果顯示年長NS-Pten KO小鼠比年幼小鼠星形膠質細胞和小膠質細胞明顯增多，表明年齡依賴性的膠質增生同時伴有癲癇惡化和mTOR異常活化。并且，小膠質細胞形態的變化與小膠質細胞激活一致，在NS-Pten KO小鼠中更常見，表明反應性的小膠質細胞增生。
2.3 雷帕霉素治療抑制伴有嚴重癲癇的NS-Pten KO小鼠的癲癇樣活動并改善基線腦電活動
在之前的研究中，我們發現在NS-Pten KO小鼠出生后4周開始使用雷帕霉素治療能夠抑制癲癇樣活動并防止癲癇進展。為了探究mTOR抑制劑在病理晚期能否抑制NS-Pten KO小鼠癲癇樣活動，我們將雷帕霉素治療時間推遲至出生后9周(圖 4a)。在這個年齡，癲癇表型已建立并嚴重，表現為持續性的亞臨床癲癇樣電活動和運動性發作(圖 1)。盡管在對照組和雷帕霉素治療WT小鼠中未檢測到異常EEG活動，但在NS-Pten KO小鼠中癲癇樣電活動隨雷帕霉素治療而減少(圖 4 b)。雷帕霉素治療后3~4周EEG活動定量分析結果顯示，治療組NS-Pten KO小鼠出生后12~13周明顯低于同齡對照NS-Pten KO小鼠(P=0.008，圖 4c)。對雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠進一步組內分析結果顯示EEG癲癇樣活動在治療后顯著減少(P=0.005)。而對照組NS-Pten KO小鼠EEG電活動未見明顯異常(圖 4 d)。與對照組NS-Pten KO小鼠相比，雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠棘波和運動性發作顯著減少(P=0.0043；P=0.026，圖 4e、f)，進一步支持雷帕霉素改善癲癇樣電活動。
圖4
雷帕霉素治療抑制癲癇樣活動并改善伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠基線腦電活動
a. VEEG監測和雷帕霉素治療的時間軸。出生8~13周，每周采用vEEG監測小鼠活動，出生后9周開始進行雷帕霉素治療直到死亡，所有EEG分析均在出生后12~13周，即治療后3~4周開始，而運動性發作頻率在出生后9~13周均進行評估；b.典型的EEG示對照和雷帕霉素治療WT小鼠正常腦電活動，對照NS-
總的來說，研究結果顯示雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠晚期病理階段能夠抑制癲癇表型。
出生后8周的EEG結果顯示NS-Pten KO小鼠和WT小鼠基線電活動差異無統計學意義。然而，在出生后12~13周，WT小鼠總能量顯著下降(P＜0.001)，NS-Pten KO小鼠顯著升高(P＜0.05)。出生后12~13周，治療組NS-Pten KO小鼠異常總能量比對照組NS-Pten KO小鼠顯著增高，但是治療組NS-Pten KO小鼠和對照組WT小鼠差異無統計學意義(圖 4g)。這些結果提示雷帕霉素治療也能改善NS-Pten KO小鼠基線EEG電活動。
2.4 雷帕霉素治療提高伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠的存活率
NS-Pten KO小鼠死亡較早，平均壽命為(10.7±1.9)周。研究發現早期使用雷帕霉素能夠延長NS-Pten KO小鼠的壽命，我們探究晚期使用雷帕霉素是否也能改善存活率。研究中對照組NS-Pten KO小鼠僅有33%(4/12)存活至出生后16周。雷帕霉素治療組NS-Pten KO小鼠存活率明顯高于對照組NS-Pten KO小鼠(P=0.034)，86%(6/7)存活至出生后16周。相比之下，所有對照組和雷帕霉素治療組WT小鼠均存活超過16周(圖 5)。
圖5
雷帕霉素治療提高伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠存活率
對照組和雷帕霉素治療組NS-
總的來說，結果顯示晚期雷帕霉素治療伴嚴重癲癇的NS-Pten KO小鼠能有效延長生存率。
2.5 雷帕霉素治療抑制伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠的mTORC1和mTORC2信號通路和膠質增生
因為長期雷帕霉素治療可能影響mTORC1和mTORC2信號通路，我們評估了雷帕霉素長期治療NS-Pten KO和WT小鼠的信號通路變化。雷帕霉素治療NS-Pten KO和WT小鼠后，WB分析顯示其海馬p-S6水平低于對照組WT水平(P＜0.05，圖 6 a)。WT小鼠接受雷帕霉素治療后海馬p-AKT水平變化無明顯差異，但治療組NS-Pten KO小鼠p-AKT水平顯著低于對照組NS-Pten KO小鼠(P＜0.001，圖 6 b)。
圖6
雷帕霉素治療抑制伴嚴重癲癇NS-Pten KO小鼠mTORC1、mTORC2信號通路和神經膠質標志物
a~d.出生后11周對照及雷帕霉素治療NS-
因為NS-Pten KO小鼠海馬GFAP和IBA1水平改變(圖 3)且mTOR活化能調節神經膠質活動，我們也檢測了雷帕霉素治療對NS-Pten KO和WT小鼠海馬GFAP和IBA1水平影響。雷帕霉素治療對WT小鼠海馬GFAP和IBA1水平沒有顯著影響。然而NS-Pten KO小鼠異常升高的GFAP和IBA1水平隨著雷帕霉素治療而顯著降低(P＜0.05；P＜0.01，圖 6 c、d)。治療組NS-Pten KO小鼠GFAP水平顯著低于對照組NS-Pten KO小鼠(P＜0.05)，但仍顯著高于對照組WT小鼠(P＜0.05)，證明雷帕霉素有部分抑制作用(圖 6c)。治療組NS-Pten KO小鼠IBA1水平明顯降低，接近對照組WT小鼠(圖 6 d)。
總的來說，結果證明，晚期雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠能夠抑制mTORC1和mTORC2信號通路，并且能降低海馬GFAP和IBA1水平，證明mTOR抑制劑能降低NS-Pten KO小鼠神經膠質標志物表達。
3 討論
mTOR抑制劑已經成為癲癇治療的新方式，目前很多研究正努力探究其在mTOR信號通路疾病例如CD和TSC的臨床效能。在本研究中，我們探究mTOR抑制劑雷帕霉素在嚴重病理改變已形成的NS-Pten KO小鼠CD模型中是否能抑制癲癇發作。我們發現NS-Pten KO小鼠隨著年齡增加癲癇樣電活動惡化同時伴有mTOR信號通路異常，星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生。并且，我們也證明在晚期病理階段使用雷帕霉素能減弱癲癇樣電活動，降低神經膠質標志物異常水平并延長小鼠的壽命。總之，研究結果提示雷帕霉素治療是該模型慢性癲癇的有效治療手段。而且我們的研究證明NS-Pten KO小鼠星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生能夠被雷帕霉素治療抑制，成為該模型癲癇治療的新方向。
NS-Pten KO小鼠的癲癇表型與神經元Pten敲除和mTOR過度活化有關。NS-Pten KO小鼠由出生后4周的偶爾棘波活動進展到成年后持續性的多棘波和癇性活動，證明該模型小鼠有持續進展性癲癇發生過程。除了癲癇程度的惡化，我們也發現年長NS-Pten KO小鼠反復運動性發作頻率增加。然而，這一分析的敏感性可能因間斷性的記錄而降低，其實際發作頻率可能更好。因為癇性發作多變且成簇發作，更長的記錄時間可能會提供更準確的結果。
因為mTOR信號通路參與神經元過度興奮和癲癇發展，NS-Pten KO小鼠癲癇表型的惡化可能跟mTOR信號通路異常活化的持續性增加有關。因為化學致癇藥物誘導的TLE模型中mTOR信號通路因癇性發作誘導而增加，NS-Pten KO小鼠mTOR信號通路活化持續增加也可能是癇性發作本身誘導異常信號通路調節。這反過來可導致癇性發作惡化，mTOR異常調節，形成惡性循環。因為該模型大多數Pten基因敲除發生在神經發生的DG區，另一種假說是出生后新生的神經元增加Pten陰性神經元mTOR異常激活，因此加劇了mTOR異常調節和癲癇。研究也證實小部分DG區顆粒細胞Pten敲除可使mTOR過度活化而導致癲癇。今后的研究需進一步評估該模型出生后生成的神經元是否為Pten陰性，以及與mTOR過度活化程度和癲癇嚴重度的關系。
癲癇表型的惡化也可能是由于導致癇性發作的繼發機制所致。考慮到神經膠質參與神經元過度興奮和癲癇發生過程，NS-Pten KO小鼠的星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生可能導致癲癇惡化。盡管神經膠質標志物水平升高可能是神經元Pten敲除的間接效應，但其水平增高發生在癇性發作明顯之后，表明該現象是繼發于癇性發作。并且雖然mTOR異常激活主要集中在DG區，而在CA1和CA3區比較少見，星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生彌漫整個海馬。由于星形膠質細胞和小膠質細胞在大腦炎癥和癲癇炎性介質中的作用，探究星形膠質細胞介導的大腦炎性反應是否存在于NS-Pten KO小鼠及其對癲癇進展的作用將很有意義。
在該模型及其他相關遺傳性癲癇模型中，在癲癇發生早期使用mTOR抑制劑干預能夠成功防止癲癇發作，因此mTOR抑制劑已經成為mTOR信號通路突變有關癲癇的潛在改善病情的藥物。在近期的臨床試驗中，依維莫司(雷帕霉素衍生物)治療能有效減少超過50%(12/20)伴難治性癲癇TSC患者的癇性發作。然而一些患者對治療無反應，這使得研究者提出干預時機是否導致陽性結果的關鍵點。在TSC KO小鼠和另外一個NS-Pten KO小鼠模型中，雷帕霉素能成功抑制癲癇發作，但治療均是在癲癇開始后立即進行。因此為了探究雷帕霉素治療是否能夠治療已完全建立的癲癇，我們在開始治療前等待較長時間。在本研究中雷帕霉素開始使用時，NS-Pten KO小鼠表現為嚴重的mTOR異常調節和慢性癲癇樣活動。我們發現即使在病理已完全建立后再使用雷帕霉素治療仍能有效抑制mTORC1和mTORC2過度活化。這與其他研究一致，提示mTOR在癲癇維持中發揮重要作用，并且是一些癲癇的重要抗癲癇靶點。有趣的是，雷帕霉素治療也能夠降低NS-Pten KO小鼠膠質標志物異常增高水平，可能是通過該藥的免疫抑制特性。因此雷帕霉素介導的抑制作用也會改善NS-Pten KO小鼠的癲癇發作。
NS-Pten KO小鼠平均在出生后10~11周即過早死亡。在之前的研究中，早期單次雷帕霉素治療不能改善小鼠存活率。然而間歇性治療能顯著改善小鼠壽命。我們的研究發現雷帕霉素治療也能夠提高NS-Pten KO小鼠生存率，提示盡管雷帕霉素需要反復使用，但不需要早期進行。
之前對癲癇動物模型的研究都主要集中在mTORC1，因為其對雷帕霉素敏感。然而本研究及既往研究均顯示雷帕霉素治療也能夠影響mTORC2。mTORC2調控肌動蛋白細胞骨架動力，參與神經元形態和突觸功能，因此mTORC2信號通路異常調節可能是癲癇的重要病因。因此，雷帕霉素治療NS-Pten KO小鼠部分效應可能是由于mTORC2被抑制。mTORC1和mTORC2在癲癇病理中的作用仍需進一步探究，但由于缺乏mTORC2特異性抑制劑而具有挑戰性。
總之，本研究證明雷帕霉素成功治療NS-Pten KO的CD小鼠模型癲癇發作有較寬時間窗。盡管mTOR信號通路下游參與構建癲癇神經網絡的分子靶點仍需進一步研究，本研究為mTOR抑制劑治療遺傳性CD模型提供了臨床前證據。
譯自：Nguyen LH, Brewster AL, Clark ME, et al. mTOR inhibition suppresses established epilepsy in a mouse model of cortical dysplasia. Epilepsia, 2015, 56(4): 636-646.
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