引用本文： 卓木清, 王林淦, 翟瓊香, 張宇昕, 陳志紅, 郭予雄, 陳奕珊, 王春. GPR98基因突變的癲癇患兒臨床表型與神經發育商的研究. 癲癇雜志, 2015, 1(2): 106-111. doi: 10.7507/2096-0247.20150015 復制
癲癇是最常見的慢性腦部疾病之一，由多種因素引起大腦神經元異常同步放電，導致反復的發作性和短暫性的中樞神經系統功能異常。世界衛生組織(WHO)估計全世界癲癇患者總數約為7 000萬人[1]，目前我國癲癇患者的患病率可高達4‰～7‰，據不完全統計，我國癲癇患者人數約900萬，其中2/3為兒童癲癇患者[2]。反復的癲癇發作可加重患者神經系統的損傷，影響患者的認知、智力、發育及生活質量等方面，甚至可致殘或危及生命。近年來，研究表明遺傳因素是癲癇的主要病因之一，但特異性基因突變被證實僅存在于小部分癲癇綜合征。本研究擬對65個癲癇家系應用二代測序加目標區域靶向捕獲技術進行癲癇相關基因突變分析，并了解其基因型、臨床表型及神經發育商(Developmen-tal quotient，DQ)之間的關系。
資料與方法
1 病例資料來源
根據1981年及1989年國際抗癲癇聯盟對癲癇及癲癇綜合征的分類的診斷標準，征集了2013年1月-2015年6月就診于廣東省人民醫院小兒癲癇專科門診及病房診治的65個癲癇家系，收集先證者65人及家系成員138人的臨床資料及血標本。先證者中男43例，女22例；年齡為2個月~13歲。應用二代測序加目標區域靶向捕獲技術進行癲癇相關基因突變分析，發現7例先證者存在GPR98基因突變，其癲癇發作形式表現為全面性發作6例，部分性發作1例。
排除標準：①神經系統進行性或變性疾病、遺傳代謝病；②有心、肝、腎、血液系統等重要臟器疾病。所有研究對象或其法定監護人均簽署知情同意書，整個研究過程由廣東省人民醫院倫理委員會批準。
2 方法
2.1 二代測序加目標區域靶向捕獲技術
2.1.1 血樣的采集、DNA提取及濃度測定
采集65個癲癇家系先證者及138人家系成員靜脈血2 mL，置于含乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝試管中，采用FlexiGene DNA Kit提取試劑盒(德國Qiagen公司)置于-80℃保存待用。DNA提取操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定DNA含量。
2.1.2 目標基因的選取及探針設計
參考數據庫OMIM以及HGMD，我們選取了與各類遺傳性癲癇相關的共計485個基因，利用Agilent(美國Agilent公司)SureDesign在線設計工具，設計針對目標基因外顯子及側翼序列(+-10 bp)的靶向捕獲探針，定制專門的目標基因捕獲試劑盒，共有60 605條捕獲探針，總大小為1.961Mbp。
2.1.3 目標片段富集、文庫質量鑒定及上機測序
采用Agilent SureSelect Target Enrichment System Kit目標序列富集試劑盒(美國Agilent公司)對1例疑似遺傳性癲癇患者的DNA樣本制備目標基因捕獲文庫，操作步驟嚴格按照說明書進行，實驗過程包括超聲破碎DNA片段、文庫構建、雜交捕獲、捕獲文庫擴增和純化等。最后使用Agilent Bioanalyzer 2100儀器(美國Agilent公司)對測序文庫的DNA樣本進行檢測，試劑為DNA chips(美國Agilent公司)和DNA 1000 Reagent(美國Agilent公司)。然后，再按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測序深度要求，應用NEXTSEQ 500測序儀(美國Illumina公司)上機測序，操作步驟嚴格按照儀器廠商提供的操作說明進行。
2.1.4 數據分析、變異解釋及驗證
測序平臺產生的原始數據Fastq文件經RTA software (real-time analysis, Illumina)、CASAVA software v1.8.2 (Illumina)、BWA、Genome Analysis Toolkit (GATK)生物信息學軟件分析后，評估測序質量。評估參數包括總reads數、與人類基因組序列相匹配的reads比例、位于目標基因靶序列以內的reads比例、平均測序深度、測序深度＞20×區域的比例及覆蓋度均一性分析等，并生成單核苷酸變異(Singlenucleotide variation，SNV)報告(VCF格式變異信息)。然后，運用PolyPhen-2.2.2軟件、ANNOVAR軟件、HGMD數據庫、dbSNP數據庫、1000 Genome數據庫進行變異注釋。最后，采用Sanger法對候選變異進行驗證。
2.2 PCR產物測序方法
從NCBI GenBank獲取基因組全序列(NC_000002), 采用Primer Premier V5.0軟件設計合適引物特異性擴增GPR98基因全部外顯子, 確保所有外顯子序列及剪切位點序列被測出，全部引物由Sigma公司合成。擴增200例健康自愿對照(對照組)者相關GPR98基因片斷進行比對，排除該位點的基因多態性。
2.3 Gesell發育量表的測評方法
GPR98基因突變癲癇患兒7例為試驗組，30例健康兒童為對照組(本院門診健康體健小兒)。評估內容包括粗大運動、精細運動、適應性、語言及個人-社交5個能區，每個能區的測試結果以發育商(DQ)表示。發育齡(DA)=∑(周齡或月齡×n)/∑n，其中n代表(+)號的個數；DQ=DA/CA(實際年齡)×100；總體平均發育商=5個能區所得分數相加之和/5。DQ≥86分為正常，76~85分為邊緣水平，DQ＜76分考慮有發育遲緩。以上評估指標均有受過專業訓練的人員進行測試。
3 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P值＜0.05為有統計學意義。
結??果
1 癲癇基因篩查
本研究在65個癲癇家系中發現了7例先證者存在GPR98基因不同位點的突變，結合家系成員內及200例對照組的GPR98基因突變篩查結果，排除以上基因突變位點為單核苷酸多態性(SNP)，并且先證者的父母其中一方攜帶與之相同的GPR98基因點突變，見表 1，圖 1、2。
表1
GPR98基因不同位點突變篩查及驗證結果
圖1
7例GPR98基因突變家系圖
注：□健康男性, ○健康女性，■男性患者，●女性患者，
圖2
7例先證者的GPR98基因點突變測序圖
2 GPR98基因突變癲癇患兒的臨床資料
在7例先證者中男3例，女4例；年齡為2~4歲。其中6例患兒均以無熱性驚厥為初始癥狀，1例發病初期表現為熱性驚厥；發作形式表現為全面性發作為主，且有5例同時伴有精神運動發育遲緩，2例有熱性驚厥家族史，表 2。
表2
GPR98基因突變癲癇患兒的臨床資料
3 GPR98基因突變癲癇患兒與正常對照兒童的不同能區DQ值比較
本研究采用Gesell發育量表對7例GPR98基因突變癲癇患兒及30例正常兒童進行發育商測試，2例GPR98基因突變癲癇患兒的各個能區DQ結果均在正常水平，余5例患兒的DQ測試結果提示有發育發育遲緩。GPR98基因突變癲癇患兒的5個能區及總體DQ平均值分別與正常兒童比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見表 3。
表3
GPR98基因突變癲癇患兒與正常對照兒童的不同能區評分比較(討??論
GPR98基因(也稱ADGRV1基因或VLGR1基因)屬于編碼G蛋白偶聯受體超家族基因中的一員，編碼的蛋白質是目前已知最大的G蛋白偶聯受體(Very large GPCR1，VLGR1)，其含有一個7跨膜受體結構域，表達于中樞神經系統，可與鈣結合[3]。目前研究發現，GPR98基因突變與Usher綜合征(Usher syndrome，遺傳性耳聾-視網膜色素變性綜合征)2型、家族性熱性驚厥以及聽源性癲癇(Audiogenic seizure，AGS)有關[4, 5]。
本研究采用二代測序加目標區域靶向捕獲技術對65個癲癇家系進行癲癇基因篩查，在7例先證者上新發現了7個GPR98基因不同位點的突變，男3例，女4例，年齡為2~4歲；其中6個突變位點為雜合錯義變異(分別為c.6083C＞T、c.1969A＞C、c.17531C＞T、c.9069G＞C、c.6661G＞A和c.18496A＞C)，1個突變位點為無義變異(c.14224G＞T)。這新發現的7個基因突變位點分別在家系內成員及200例對照組進行驗證，發現患兒的父母親其中一方攜帶與其相同的突變位點，對照組均未見以上基因突變位點。Nakayama等[6]應用全基因組連鎖分析方法對一個家族性熱性驚厥大家系篩查，并且在39個核心家系進一步驗證，發現標記物D5S644、D5S652和D5S2079與家族性熱性驚厥存在顯著的連鎖不平衡性，提示在染色體5q14-q15上可能存在一個熱性驚厥易感基因，并將其稱為FEB4基因。后續研究發現單基因聽源性驚厥易感基因1(Monogenic Audiogenic Seizure Susceptibility 1 gene，MASS1)即為FEB4基因，并且其是VLGR1基因第5-39外顯子轉錄片段[7]。Deprez等[8]應用全基因組連鎖分析方法對一個多代同堂的熱性驚厥和癲癇的大家系研究，首次發現染色體5q14-q23片段在特發性癲癇起著一定的作用，該區域與家族性熱性驚厥FEB4基因存在重疊區域。在本研究中，6例患兒是以無熱性驚厥為初始癥狀，1例初始癥狀表現為熱性驚厥，發作形式以全面性發作為主，但患兒的父/母親攜帶與其同一GPR98基因突變缺乏有熱/無熱性驚厥臨床表型，提示新發現的7個GPR98基因突變可能與患兒的癲癇全面性發作有關，它們是否具有致病性仍需進一步功能研究驗證。隨后，Nakayama等[4]對48個家族性熱性驚厥家系進行MASS1基因篩查，發現9個錯義多態性等位基因與熱性驚厥之間無統計學差異，但無義突變S2652X可導致C端的126氨基酸缺失，推測其功能缺失可能與驚厥發作的表型相關。同樣，Yagi等[9, 10]應用VLGR1基因敲除小鼠發現了VLGR1蛋白功能缺失可導致小鼠出現聽源性癲癇發作。本研究中有1例患兒GPR98基因突變為無義突變(c.14224G＞T)，該變異導致編譯第4742號氨基酸谷氨酸(Glu)的密碼子變為終止密碼子(Ter)，從而使肽鏈合成提前終止，導致翻譯后的肽鏈明顯縮短，對蛋白質的三級結構產生嚴重的影響，可引起翻譯后的GPR98蛋白功能缺失。結合以上的文獻報道，我們推測GPR98基因突變c.14224G＞T可能導致癲癇發作。
在本研究中，7例GPR98基因突變的癲癇患兒中有5例同時合并精神運動發育遲緩，以語言發育遲緩較為顯著。目前許多研究表明，GPR98基因突變與Usher綜合征2型有關[11]。Usher綜合征2型為先天性重度感音性耳聾，聽力呈下降趨勢，可引起語言發育遲緩，但該病病情進展緩慢且遺傳方式呈常染色體隱性遺傳[12, 13]。本研究中的GPR98基因突變癲癇患兒缺乏聽力受損臨床癥狀，因此我們推測患兒的精神運動發育遲緩可能與GPR98基因突變有關。
我們同時采用Gesell發育量表對7例GPR98基因突變癲癇患兒及30例正常兒童進行發育商測試，GPR98基因突變癲癇患兒的5個能區及總體DQ平均值分別與正常兒童之間的差異均有統計學意義(P＜0.01)。
綜上所述，本研究在65個癲癇家系中發現了7個新GPR98基因點突變，結合先證者的臨床資料分析，我們發現GPR98基因突變患兒的癲癇發作形式以全面性發作為主，其精神運動發育遲緩可能與GPR98基因突變有關，但以上新發現的GPR98基因突變位點的致病性仍需進一步功能實驗進行驗證。
癲癇是最常見的慢性腦部疾病之一，由多種因素引起大腦神經元異常同步放電，導致反復的發作性和短暫性的中樞神經系統功能異常。世界衛生組織(WHO)估計全世界癲癇患者總數約為7 000萬人[1]，目前我國癲癇患者的患病率可高達4‰～7‰，據不完全統計，我國癲癇患者人數約900萬，其中2/3為兒童癲癇患者[2]。反復的癲癇發作可加重患者神經系統的損傷，影響患者的認知、智力、發育及生活質量等方面，甚至可致殘或危及生命。近年來，研究表明遺傳因素是癲癇的主要病因之一，但特異性基因突變被證實僅存在于小部分癲癇綜合征。本研究擬對65個癲癇家系應用二代測序加目標區域靶向捕獲技術進行癲癇相關基因突變分析，并了解其基因型、臨床表型及神經發育商(Developmen-tal quotient，DQ)之間的關系。
資料與方法
1 病例資料來源
根據1981年及1989年國際抗癲癇聯盟對癲癇及癲癇綜合征的分類的診斷標準，征集了2013年1月-2015年6月就診于廣東省人民醫院小兒癲癇專科門診及病房診治的65個癲癇家系，收集先證者65人及家系成員138人的臨床資料及血標本。先證者中男43例，女22例；年齡為2個月~13歲。應用二代測序加目標區域靶向捕獲技術進行癲癇相關基因突變分析，發現7例先證者存在GPR98基因突變，其癲癇發作形式表現為全面性發作6例，部分性發作1例。
排除標準：①神經系統進行性或變性疾病、遺傳代謝病；②有心、肝、腎、血液系統等重要臟器疾病。所有研究對象或其法定監護人均簽署知情同意書，整個研究過程由廣東省人民醫院倫理委員會批準。
2 方法
2.1 二代測序加目標區域靶向捕獲技術
2.1.1 血樣的采集、DNA提取及濃度測定
采集65個癲癇家系先證者及138人家系成員靜脈血2 mL，置于含乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝試管中，采用FlexiGene DNA Kit提取試劑盒(德國Qiagen公司)置于-80℃保存待用。DNA提取操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定DNA含量。
2.1.2 目標基因的選取及探針設計
參考數據庫OMIM以及HGMD，我們選取了與各類遺傳性癲癇相關的共計485個基因，利用Agilent(美國Agilent公司)SureDesign在線設計工具，設計針對目標基因外顯子及側翼序列(+-10 bp)的靶向捕獲探針，定制專門的目標基因捕獲試劑盒，共有60 605條捕獲探針，總大小為1.961Mbp。
2.1.3 目標片段富集、文庫質量鑒定及上機測序
采用Agilent SureSelect Target Enrichment System Kit目標序列富集試劑盒(美國Agilent公司)對1例疑似遺傳性癲癇患者的DNA樣本制備目標基因捕獲文庫，操作步驟嚴格按照說明書進行，實驗過程包括超聲破碎DNA片段、文庫構建、雜交捕獲、捕獲文庫擴增和純化等。最后使用Agilent Bioanalyzer 2100儀器(美國Agilent公司)對測序文庫的DNA樣本進行檢測，試劑為DNA chips(美國Agilent公司)和DNA 1000 Reagent(美國Agilent公司)。然后，再按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測序深度要求，應用NEXTSEQ 500測序儀(美國Illumina公司)上機測序，操作步驟嚴格按照儀器廠商提供的操作說明進行。
2.1.4 數據分析、變異解釋及驗證
測序平臺產生的原始數據Fastq文件經RTA software (real-time analysis, Illumina)、CASAVA software v1.8.2 (Illumina)、BWA、Genome Analysis Toolkit (GATK)生物信息學軟件分析后，評估測序質量。評估參數包括總reads數、與人類基因組序列相匹配的reads比例、位于目標基因靶序列以內的reads比例、平均測序深度、測序深度＞20×區域的比例及覆蓋度均一性分析等，并生成單核苷酸變異(Singlenucleotide variation，SNV)報告(VCF格式變異信息)。然后，運用PolyPhen-2.2.2軟件、ANNOVAR軟件、HGMD數據庫、dbSNP數據庫、1000 Genome數據庫進行變異注釋。最后，采用Sanger法對候選變異進行驗證。
2.2 PCR產物測序方法
從NCBI GenBank獲取基因組全序列(NC_000002), 采用Primer Premier V5.0軟件設計合適引物特異性擴增GPR98基因全部外顯子, 確保所有外顯子序列及剪切位點序列被測出，全部引物由Sigma公司合成。擴增200例健康自愿對照(對照組)者相關GPR98基因片斷進行比對，排除該位點的基因多態性。
2.3 Gesell發育量表的測評方法
GPR98基因突變癲癇患兒7例為試驗組，30例健康兒童為對照組(本院門診健康體健小兒)。評估內容包括粗大運動、精細運動、適應性、語言及個人-社交5個能區，每個能區的測試結果以發育商(DQ)表示。發育齡(DA)=∑(周齡或月齡×n)/∑n，其中n代表(+)號的個數；DQ=DA/CA(實際年齡)×100；總體平均發育商=5個能區所得分數相加之和/5。DQ≥86分為正常，76~85分為邊緣水平，DQ＜76分考慮有發育遲緩。以上評估指標均有受過專業訓練的人員進行測試。
3 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P值＜0.05為有統計學意義。
結??果
1 癲癇基因篩查
本研究在65個癲癇家系中發現了7例先證者存在GPR98基因不同位點的突變，結合家系成員內及200例對照組的GPR98基因突變篩查結果，排除以上基因突變位點為單核苷酸多態性(SNP)，并且先證者的父母其中一方攜帶與之相同的GPR98基因點突變，見表 1，圖 1、2。
表1
GPR98基因不同位點突變篩查及驗證結果
圖1
7例GPR98基因突變家系圖
注：□健康男性, ○健康女性，■男性患者，●女性患者，
圖2
7例先證者的GPR98基因點突變測序圖
2 GPR98基因突變癲癇患兒的臨床資料
在7例先證者中男3例，女4例；年齡為2~4歲。其中6例患兒均以無熱性驚厥為初始癥狀，1例發病初期表現為熱性驚厥；發作形式表現為全面性發作為主，且有5例同時伴有精神運動發育遲緩，2例有熱性驚厥家族史，表 2。
表2
GPR98基因突變癲癇患兒的臨床資料
3 GPR98基因突變癲癇患兒與正常對照兒童的不同能區DQ值比較
本研究采用Gesell發育量表對7例GPR98基因突變癲癇患兒及30例正常兒童進行發育商測試，2例GPR98基因突變癲癇患兒的各個能區DQ結果均在正常水平，余5例患兒的DQ測試結果提示有發育發育遲緩。GPR98基因突變癲癇患兒的5個能區及總體DQ平均值分別與正常兒童比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見表 3。
表3
GPR98基因突變癲癇患兒與正常對照兒童的不同能區評分比較(討??論
GPR98基因(也稱ADGRV1基因或VLGR1基因)屬于編碼G蛋白偶聯受體超家族基因中的一員，編碼的蛋白質是目前已知最大的G蛋白偶聯受體(Very large GPCR1，VLGR1)，其含有一個7跨膜受體結構域，表達于中樞神經系統，可與鈣結合[3]。目前研究發現，GPR98基因突變與Usher綜合征(Usher syndrome，遺傳性耳聾-視網膜色素變性綜合征)2型、家族性熱性驚厥以及聽源性癲癇(Audiogenic seizure，AGS)有關[4, 5]。
本研究采用二代測序加目標區域靶向捕獲技術對65個癲癇家系進行癲癇基因篩查，在7例先證者上新發現了7個GPR98基因不同位點的突變，男3例，女4例，年齡為2~4歲；其中6個突變位點為雜合錯義變異(分別為c.6083C＞T、c.1969A＞C、c.17531C＞T、c.9069G＞C、c.6661G＞A和c.18496A＞C)，1個突變位點為無義變異(c.14224G＞T)。這新發現的7個基因突變位點分別在家系內成員及200例對照組進行驗證，發現患兒的父母親其中一方攜帶與其相同的突變位點，對照組均未見以上基因突變位點。Nakayama等[6]應用全基因組連鎖分析方法對一個家族性熱性驚厥大家系篩查，并且在39個核心家系進一步驗證，發現標記物D5S644、D5S652和D5S2079與家族性熱性驚厥存在顯著的連鎖不平衡性，提示在染色體5q14-q15上可能存在一個熱性驚厥易感基因，并將其稱為FEB4基因。后續研究發現單基因聽源性驚厥易感基因1(Monogenic Audiogenic Seizure Susceptibility 1 gene，MASS1)即為FEB4基因，并且其是VLGR1基因第5-39外顯子轉錄片段[7]。Deprez等[8]應用全基因組連鎖分析方法對一個多代同堂的熱性驚厥和癲癇的大家系研究，首次發現染色體5q14-q23片段在特發性癲癇起著一定的作用，該區域與家族性熱性驚厥FEB4基因存在重疊區域。在本研究中，6例患兒是以無熱性驚厥為初始癥狀，1例初始癥狀表現為熱性驚厥，發作形式以全面性發作為主，但患兒的父/母親攜帶與其同一GPR98基因突變缺乏有熱/無熱性驚厥臨床表型，提示新發現的7個GPR98基因突變可能與患兒的癲癇全面性發作有關，它們是否具有致病性仍需進一步功能研究驗證。隨后，Nakayama等[4]對48個家族性熱性驚厥家系進行MASS1基因篩查，發現9個錯義多態性等位基因與熱性驚厥之間無統計學差異，但無義突變S2652X可導致C端的126氨基酸缺失，推測其功能缺失可能與驚厥發作的表型相關。同樣，Yagi等[9, 10]應用VLGR1基因敲除小鼠發現了VLGR1蛋白功能缺失可導致小鼠出現聽源性癲癇發作。本研究中有1例患兒GPR98基因突變為無義突變(c.14224G＞T)，該變異導致編譯第4742號氨基酸谷氨酸(Glu)的密碼子變為終止密碼子(Ter)，從而使肽鏈合成提前終止，導致翻譯后的肽鏈明顯縮短，對蛋白質的三級結構產生嚴重的影響，可引起翻譯后的GPR98蛋白功能缺失。結合以上的文獻報道，我們推測GPR98基因突變c.14224G＞T可能導致癲癇發作。
在本研究中，7例GPR98基因突變的癲癇患兒中有5例同時合并精神運動發育遲緩，以語言發育遲緩較為顯著。目前許多研究表明，GPR98基因突變與Usher綜合征2型有關[11]。Usher綜合征2型為先天性重度感音性耳聾，聽力呈下降趨勢，可引起語言發育遲緩，但該病病情進展緩慢且遺傳方式呈常染色體隱性遺傳[12, 13]。本研究中的GPR98基因突變癲癇患兒缺乏聽力受損臨床癥狀，因此我們推測患兒的精神運動發育遲緩可能與GPR98基因突變有關。
我們同時采用Gesell發育量表對7例GPR98基因突變癲癇患兒及30例正常兒童進行發育商測試，GPR98基因突變癲癇患兒的5個能區及總體DQ平均值分別與正常兒童之間的差異均有統計學意義(P＜0.01)。
綜上所述，本研究在65個癲癇家系中發現了7個新GPR98基因點突變，結合先證者的臨床資料分析，我們發現GPR98基因突變患兒的癲癇發作形式以全面性發作為主，其精神運動發育遲緩可能與GPR98基因突變有關，但以上新發現的GPR98基因突變位點的致病性仍需進一步功能實驗進行驗證。
