引用本文： 李萍, 郭廣玲, 董斯睿, 趙淑穎, 張超. 臍帶間充質干細胞移植治療卵巢早衰有效性動物實驗的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2022, 22(9): 1041-1047. doi: 10.7507/1672-2531.202110138 復制
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是婦科內分泌領域的常見病，且近年來發病率呈上升趨勢。其在普通婦女中的發病率約為1%，在原發性閉經婦女中高達10%～28%，繼發性閉經婦女中高達4%～18%[1]。POF是指女性在40歲以前由于遺傳性、自身免疫性、醫源性、環境和心理因素等引起的卵巢功能衰退，以血清促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）濃度升高及雌二醇（estradiol，E2）濃度降低為特征，導致患者出現更年期綜合征、月經不調、雌孕激素水平降低、閉經、不孕等各類癥狀，且對神經、心腦血管、內分泌、骨骼等全身多器官系統構成影響，嚴重影響患者的身心健康。
目前治療POF的主要措施包括激素補充治療、中醫藥治療、免疫調節、卵泡體外激活、卵巢組織凍存移植、胚胎凍存移植等[2]，但療效均不確切，部分治療方法存在倫理爭議和潛在不良反應。近年來，國內外對干細胞移植治療多種疾病的研究日趨熱烈，目前已有多種干細胞制劑用于治療移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性關節炎等[3-4]，且都取得了很好的臨床效果。同時已有多種間充質干細胞應用于POF治療，包括骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、胎盤間充質干細胞和臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）等[5-7]，為POF的治療帶來可能。人UCMSCs具有取材方便、來源廣泛、相對純凈、較為原始及分化能力強等特點，具有自我更新和向多組織細胞分化潛能，此外，其不表達主要組織相容性復合物Ⅱ型或低表達主要組織相容性復合物Ⅰ型特征，使其免疫原性低，減弱了同種異體移植免疫排斥反應，適宜于不同個體間的移植治療[8]，具有廣闊的應用前景。本研究系統評價UCMSCs治療POF有效性動物實驗，以期為后續研究與臨床應用提供間接依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
隨機或半隨機的動物實驗。
1.1.2 研究對象
POF造模成功的鼠。
1.1.3 干預措施
實驗組采用UCMSCs尾靜脈或卵巢原位移植治療；對照組采用空白對照、生理鹽水或PBS緩沖液。
1.1.4 結局指標
① 始基卵泡數目；② 初級卵泡數目；③ 次級卵泡數目；④ 竇狀卵泡數目；⑤ E2濃度；⑥ FSH濃度。
1.1.5 排除標準
① 重復發表的文獻；② 非中、英文文獻；③ 無原始數據或數據不全，無法進行分析的研究；④ UCMSCs聯合使用其他治療方法。
1.2 文獻檢索策略
計算機檢索CNKI、WanFang Data、SinoMed、PubMed和EMbase數據庫，搜集關于UCMSCs治療POF的動物實驗，檢索時限均從建庫起至2021年9月17日。檢索采用主題詞與自由詞相結合的方式進行，并根據各數據庫特點進行調整。同時檢索納入研究的參考文獻，以補充獲取相關資料。英文檢索詞包括：premature ovarian failure、primary ovarian insufficiency、premature menopause、ovarian dysgenesis、human umbilical cord mesenchymal stem cells、POF等；中文檢索詞包括：卵巢早衰、原發性卵巢功能不全、過早絕經、卵巢發育不全、臍帶間充質干細胞等。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
圖
1.3 文獻篩選與資料提取
由2名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論或與第三方協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文以確定是否納入。如有需要，通過郵件、電話聯系原始研究作者獲取未確定但對本研究非常重要的信息。資料提取內容包括：① 納入研究的基本信息：研究題目、第一作者、發表期刊等；② 研究動物種屬、例數和干預措施；③ 偏倚風險評價的關鍵要素；④ 所關注的結局指標和結果測量數據。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由2名研究者獨立評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對結果。動物實驗偏倚風險評價采用SYRCLE偏倚風險評價工具[9]。
1.5 統計分析
采用RevMan 5.4.1軟件進行Meta分析。連續性變量采用標準化均數差（standardized mean difference，SMD）[10]為效應分析統計量，并提供其95%可信區間（confidence interval，CI）。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準為α=0.1），同時結合I2定量判斷異質性大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行Meta分析。Meta分析的水準設為α=0.05。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法進行處理，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻篩選流程及結果
初檢共獲得相關文獻477篇，經逐層篩選，最終納入9個研究[11-19]。文獻篩選流程及結果見圖1。
圖1
文獻篩選流程及結果
*所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：CNKI（
2.2 納入研究的基本特征及偏倚風險評價結果
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價結果
2.3 Meta分析結果
2.3.1 始基卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對始基卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高始基卵泡數目［SMD=1.51，95%CI（0.80，2.22），P<0.000 1］（表3）。
表3
臍帶間充質干細胞移植治療卵巢早衰有效性的Meta分析結果
2.3.2 初級卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對初級卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高初級卵泡數目［SMD=1.43，95%CI（0.76，2.09），P<0.000 1］（表3）。
2.3.3 次級卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對次級卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高次級卵泡數目［SMD=1.39，95%CI（0.78，2.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.4 竇狀卵泡數目
共5個研究[11-14,16]報道了UCMSCs移植對竇狀卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高竇狀卵泡數目［SMD=1.15，95%CI（0.49，1.82），P=0.000 7］（表3）。
2.3.5 E2濃度
共6個研究[11-13,15,17,19]報道了UCMSCs移植對E2濃度的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高E2濃度［SMD=2.38，95%CI（1.75，3.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.6 FSH濃度
共6個研究[11-13,15,17,19]報道了UCMSCs移植對FSH濃度的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可降低FSH濃度［SMD=?1.98，95%CI（?2.80，?1.17），P<0.000 01］（表3）。
2.3.7 亞組分析結果
由于納入研究間存在較大異質性，故按移植部位、體重、移植時機和干細胞濃度進行亞組分析，結果顯示大部分亞組的合并結果未發生方向性改變，但異質性仍較高（表3）。
3 討論
POF是婦科常見病及疑難病，其發病率呈逐漸升高和年輕化趨勢。POF發病原因及發病機理十分復雜，且尚未明確。最新研究發現，無論何種原因導致的POF，均伴有顆粒細胞凋亡[20]，說明顆粒細胞異常與POF有直接關系。許多基因發生突變也可能會導致POF的發生，例如脆性X智力障礙基因、抗苗勒管激素基因（anti Mullerian hormonegene，AMH）[21]、生長分化因子9基因、叉頭框因子-1基因和LRPPRC基因等[22]。另外，線粒體功能異常也可能通過影響mtDNA的復制而導致POF[23]。
近年來采用間充質干細胞移植進行POF治療并取得了一定效果。其機制可能與間充質干細胞能分泌多種細胞因子，如VEGF、IGF-1、HGF、TGF-β和GM-CSF等，通過旁分泌途徑參與卵巢顆粒細胞生長調節過程，抑制其凋亡有關[24]。此外，間充質干細胞促進損傷卵巢功能修復的機制可能是其通過腹腔血管進入血液循環到達損傷卵巢，利用其多向分化潛能[25]在體內選擇性遷移和停留在機體受損傷的組織，通過MSCs表面表達的生長因子、細胞因子和細胞外基質受體驅使移植的間充質干細胞遷移到炎癥部位[26]，分化發育成各級卵泡，分泌多種細胞外基質，促進損傷卵巢功能的修復。但目前采用UCMSCs移植治療POF的臨床研究仍然很少，因此本研究對相關動物實驗進行Meta分析，為臨床研究的開展提供間接依據。
本研究以各階段卵泡（始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇狀卵泡）數目和E2、FSH濃度作為評價指標，并按照小鼠的體重、干細胞濃度、移植部位和移植時機進行亞組分析，Meta分析結果顯示：UCMSCs移植治療后，各級卵泡數目增加，E2濃度上升，FSH濃度降低，說明UCMSCs移植能修復卵巢組織，改善卵巢內分泌功能。其治療機制可能為UCMSCs濃聚于卵巢局部，使得UCMSCs分泌的抗凋亡因子在局部形成較高水平，抑制顆粒細胞的凋亡[11]；UCMSCs中表達的血紅素加氧酶-1通過激活JNK/Bcl-2信號通路，激活卵巢顆粒細胞自噬，增強其自身形成[27]；另外，UCMSCs還能分化為顆粒細胞和卵子細胞，促進卵巢表面上皮細胞增殖，重新修復白膜[28]，從而促進卵泡的形成，分泌性激素。亞組分析結果顯示，尾靜脈移植效果更好，可能因為其能使UCMSCs分布于全身多個器官，通過歸巢效應[29]，到達損傷的卵巢部位進行修復，且尾靜脈移植損傷更小，而卵巢表面覆蓋著密集而交織的毛細血管網，卵巢注射時很容易導致其損傷出血，加劇卵巢炎癥反應[19]。在移植時機方面，可能由于在造模早期，藥物對鼠的卵巢組織損害較輕，故而移植時機≤造模后1天組的療效明顯優于移植時機>造模后1天組，提示早期治療可能對POF更有效。
本研究的局限性：① 僅檢索了中英文文獻，存在符合納入條件的其他語種文獻未被納入的可能，可能存在選擇性偏倚；② 部分納入研究未交待隨機方法，所有研究均未描述分配隱藏和盲法實施，可能存在選擇和實施偏倚；③ 納入小鼠的基線特征水平不一致，導致部分結局指標可比性降低；④ 合并分析時存在較大異質性，亞組分析未能明顯降低異質性，可能影響結果的準確性。
綜上所述，當前證據顯示，UCMSCs移植可修復小鼠卵巢組織，改善卵巢內分泌功能。受納入研究數量和質量的限制，上述結論尚待更多高質量研究予以驗證。
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是婦科內分泌領域的常見病，且近年來發病率呈上升趨勢。其在普通婦女中的發病率約為1%，在原發性閉經婦女中高達10%～28%，繼發性閉經婦女中高達4%～18%[1]。POF是指女性在40歲以前由于遺傳性、自身免疫性、醫源性、環境和心理因素等引起的卵巢功能衰退，以血清促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）濃度升高及雌二醇（estradiol，E2）濃度降低為特征，導致患者出現更年期綜合征、月經不調、雌孕激素水平降低、閉經、不孕等各類癥狀，且對神經、心腦血管、內分泌、骨骼等全身多器官系統構成影響，嚴重影響患者的身心健康。
目前治療POF的主要措施包括激素補充治療、中醫藥治療、免疫調節、卵泡體外激活、卵巢組織凍存移植、胚胎凍存移植等[2]，但療效均不確切，部分治療方法存在倫理爭議和潛在不良反應。近年來，國內外對干細胞移植治療多種疾病的研究日趨熱烈，目前已有多種干細胞制劑用于治療移植物抗宿主病、急性心肌梗死、骨性關節炎等[3-4]，且都取得了很好的臨床效果。同時已有多種間充質干細胞應用于POF治療，包括骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、胎盤間充質干細胞和臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）等[5-7]，為POF的治療帶來可能。人UCMSCs具有取材方便、來源廣泛、相對純凈、較為原始及分化能力強等特點，具有自我更新和向多組織細胞分化潛能，此外，其不表達主要組織相容性復合物Ⅱ型或低表達主要組織相容性復合物Ⅰ型特征，使其免疫原性低，減弱了同種異體移植免疫排斥反應，適宜于不同個體間的移植治療[8]，具有廣闊的應用前景。本研究系統評價UCMSCs治療POF有效性動物實驗，以期為后續研究與臨床應用提供間接依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
隨機或半隨機的動物實驗。
1.1.2 研究對象
POF造模成功的鼠。
1.1.3 干預措施
實驗組采用UCMSCs尾靜脈或卵巢原位移植治療；對照組采用空白對照、生理鹽水或PBS緩沖液。
1.1.4 結局指標
① 始基卵泡數目；② 初級卵泡數目；③ 次級卵泡數目；④ 竇狀卵泡數目；⑤ E2濃度；⑥ FSH濃度。
1.1.5 排除標準
① 重復發表的文獻；② 非中、英文文獻；③ 無原始數據或數據不全，無法進行分析的研究；④ UCMSCs聯合使用其他治療方法。
1.2 文獻檢索策略
計算機檢索CNKI、WanFang Data、SinoMed、PubMed和EMbase數據庫，搜集關于UCMSCs治療POF的動物實驗，檢索時限均從建庫起至2021年9月17日。檢索采用主題詞與自由詞相結合的方式進行，并根據各數據庫特點進行調整。同時檢索納入研究的參考文獻，以補充獲取相關資料。英文檢索詞包括：premature ovarian failure、primary ovarian insufficiency、premature menopause、ovarian dysgenesis、human umbilical cord mesenchymal stem cells、POF等；中文檢索詞包括：卵巢早衰、原發性卵巢功能不全、過早絕經、卵巢發育不全、臍帶間充質干細胞等。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
圖
1.3 文獻篩選與資料提取
由2名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論或與第三方協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文以確定是否納入。如有需要，通過郵件、電話聯系原始研究作者獲取未確定但對本研究非常重要的信息。資料提取內容包括：① 納入研究的基本信息：研究題目、第一作者、發表期刊等；② 研究動物種屬、例數和干預措施；③ 偏倚風險評價的關鍵要素；④ 所關注的結局指標和結果測量數據。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由2名研究者獨立評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對結果。動物實驗偏倚風險評價采用SYRCLE偏倚風險評價工具[9]。
1.5 統計分析
采用RevMan 5.4.1軟件進行Meta分析。連續性變量采用標準化均數差（standardized mean difference，SMD）[10]為效應分析統計量，并提供其95%可信區間（confidence interval，CI）。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準為α=0.1），同時結合I2定量判斷異質性大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行Meta分析。Meta分析的水準設為α=0.05。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法進行處理，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻篩選流程及結果
初檢共獲得相關文獻477篇，經逐層篩選，最終納入9個研究[11-19]。文獻篩選流程及結果見圖1。
圖1
文獻篩選流程及結果
*所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：CNKI（
2.2 納入研究的基本特征及偏倚風險評價結果
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價結果
2.3 Meta分析結果
2.3.1 始基卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對始基卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高始基卵泡數目［SMD=1.51，95%CI（0.80，2.22），P<0.000 1］（表3）。
表3
臍帶間充質干細胞移植治療卵巢早衰有效性的Meta分析結果
2.3.2 初級卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對初級卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高初級卵泡數目［SMD=1.43，95%CI（0.76，2.09），P<0.000 1］（表3）。
2.3.3 次級卵泡數目
共6個研究[11-14,16,18]報道了UCMSCs移植對次級卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高次級卵泡數目［SMD=1.39，95%CI（0.78，2.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.4 竇狀卵泡數目
共5個研究[11-14,16]報道了UCMSCs移植對竇狀卵泡數目的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高竇狀卵泡數目［SMD=1.15，95%CI（0.49，1.82），P=0.000 7］（表3）。
2.3.5 E2濃度
共6個研究[11-13,15,17,19]報道了UCMSCs移植對E2濃度的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可提高E2濃度［SMD=2.38，95%CI（1.75，3.01），P<0.000 01］（表3）。
2.3.6 FSH濃度
共6個研究[11-13,15,17,19]報道了UCMSCs移植對FSH濃度的影響。隨機效應模型Meta分析結果顯示：UCMSCs移植可降低FSH濃度［SMD=?1.98，95%CI（?2.80，?1.17），P<0.000 01］（表3）。
2.3.7 亞組分析結果
由于納入研究間存在較大異質性，故按移植部位、體重、移植時機和干細胞濃度進行亞組分析，結果顯示大部分亞組的合并結果未發生方向性改變，但異質性仍較高（表3）。
3 討論
POF是婦科常見病及疑難病，其發病率呈逐漸升高和年輕化趨勢。POF發病原因及發病機理十分復雜，且尚未明確。最新研究發現，無論何種原因導致的POF，均伴有顆粒細胞凋亡[20]，說明顆粒細胞異常與POF有直接關系。許多基因發生突變也可能會導致POF的發生，例如脆性X智力障礙基因、抗苗勒管激素基因（anti Mullerian hormonegene，AMH）[21]、生長分化因子9基因、叉頭框因子-1基因和LRPPRC基因等[22]。另外，線粒體功能異常也可能通過影響mtDNA的復制而導致POF[23]。
近年來采用間充質干細胞移植進行POF治療并取得了一定效果。其機制可能與間充質干細胞能分泌多種細胞因子，如VEGF、IGF-1、HGF、TGF-β和GM-CSF等，通過旁分泌途徑參與卵巢顆粒細胞生長調節過程，抑制其凋亡有關[24]。此外，間充質干細胞促進損傷卵巢功能修復的機制可能是其通過腹腔血管進入血液循環到達損傷卵巢，利用其多向分化潛能[25]在體內選擇性遷移和停留在機體受損傷的組織，通過MSCs表面表達的生長因子、細胞因子和細胞外基質受體驅使移植的間充質干細胞遷移到炎癥部位[26]，分化發育成各級卵泡，分泌多種細胞外基質，促進損傷卵巢功能的修復。但目前采用UCMSCs移植治療POF的臨床研究仍然很少，因此本研究對相關動物實驗進行Meta分析，為臨床研究的開展提供間接依據。
本研究以各階段卵泡（始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡及竇狀卵泡）數目和E2、FSH濃度作為評價指標，并按照小鼠的體重、干細胞濃度、移植部位和移植時機進行亞組分析，Meta分析結果顯示：UCMSCs移植治療后，各級卵泡數目增加，E2濃度上升，FSH濃度降低，說明UCMSCs移植能修復卵巢組織，改善卵巢內分泌功能。其治療機制可能為UCMSCs濃聚于卵巢局部，使得UCMSCs分泌的抗凋亡因子在局部形成較高水平，抑制顆粒細胞的凋亡[11]；UCMSCs中表達的血紅素加氧酶-1通過激活JNK/Bcl-2信號通路，激活卵巢顆粒細胞自噬，增強其自身形成[27]；另外，UCMSCs還能分化為顆粒細胞和卵子細胞，促進卵巢表面上皮細胞增殖，重新修復白膜[28]，從而促進卵泡的形成，分泌性激素。亞組分析結果顯示，尾靜脈移植效果更好，可能因為其能使UCMSCs分布于全身多個器官，通過歸巢效應[29]，到達損傷的卵巢部位進行修復，且尾靜脈移植損傷更小，而卵巢表面覆蓋著密集而交織的毛細血管網，卵巢注射時很容易導致其損傷出血，加劇卵巢炎癥反應[19]。在移植時機方面，可能由于在造模早期，藥物對鼠的卵巢組織損害較輕，故而移植時機≤造模后1天組的療效明顯優于移植時機>造模后1天組，提示早期治療可能對POF更有效。
本研究的局限性：① 僅檢索了中英文文獻，存在符合納入條件的其他語種文獻未被納入的可能，可能存在選擇性偏倚；② 部分納入研究未交待隨機方法，所有研究均未描述分配隱藏和盲法實施，可能存在選擇和實施偏倚；③ 納入小鼠的基線特征水平不一致，導致部分結局指標可比性降低；④ 合并分析時存在較大異質性，亞組分析未能明顯降低異質性，可能影響結果的準確性。
綜上所述，當前證據顯示，UCMSCs移植可修復小鼠卵巢組織，改善卵巢內分泌功能。受納入研究數量和質量的限制，上述結論尚待更多高質量研究予以驗證。
