引用本文： 樊春筍, 朱健, 王宇婷, 季沈杰, 嚴永鋒, 陸健泉, 陳陶陽, 曲春楓. 基于啟東的中國農村原發性肝癌發病危險因素及高危人群篩選分析的隊列研究. 中國循證醫學雜志, 2018, 18(5): 428-433. doi: 10.7507/1672-2531.201802031 復制
目前，我國仍有大量的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人群，他們是原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）發病的高風險人群[1, 2]。根據在肝癌高發區積累的肝癌篩查經驗，我國農村肝癌早診早治項目對 35～64 歲成年人采用乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）結合甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和肝膽超聲初篩，對 HBsAg 陽性者進行一年兩次的 HBsAg、AFP 和肝膽超聲復查[3]，多年實施結果發現這種篩查模式存在一定局限性，基于社區的 HBsAg 攜帶人群的肝癌發病風險差異較大[4]，如能從農村 HBsAg 攜帶人群中篩選出更高危肝癌發病的亞組，可進一步提高后續篩查效力。本研究在啟東建立 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列，探索與 PLC 發病相關的常規臨床指標，以及利用這些常規臨床指標進行肝癌高危人群進一步篩選的可能性。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入標準：① 2011 年 6 月 16 日至 2013 年 6 月 30 日在啟東市人民醫院檢驗科行 HBV 感染標志物檢測時發現的 HBsAg 陽性者（包括體檢中心體檢對象中接受 HBsAg 檢測人員、門診及病區所有接受 HBsAg 檢測人員），年齡 13 周歲及以上。排除標準：① 原發性或轉移性肝癌現患病人；② 患其他惡性腫瘤或其他嚴重疾病不能參與隨訪者；③ 所有人員接受半年內 HBsAg 復檢，HBsAg 復檢結果轉為陰性者；④ 高齡體弱者。所有研究對象在進入本隊列研究前均做到知情同意并簽署知情同意書（未成年對象由監護人簽署知情同意），且本隊列研究事先經啟東市人民醫院/啟東肝癌防治研究所倫理委員會討論并審核通過。
1.2 研究指標
基線調查內容包括：① 人口社會學信息，如身份證號碼、常住地址、婚姻狀況、職業、教育程度和聯系方式等；② 疾病相關信息如肝癌家族史、抗 HBV 藥物治療史等；③ HBV 病毒學指標，全體對象采用酶聯免疫法（艾迪康 ELISA600）行乙肝兩對半檢測，部分對象接受 HBV DNA 檢測；④ 肝生化指標，包括谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、血清總蛋白（total protein，TP）、血清白蛋白（albumin，ALB）、γ-谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP），檢測方法為速率法等（貝克曼 AU5800）。
1.3 結局指標
研究結局為新發肝癌，肝癌發病數據來自啟東腫瘤登記處并與啟東生命統計處的全死因數據進行核對。采用身份證號碼為主，結合研究對象姓名、年齡及所屬鄉鎮核對的方式進行數據鏈接。PLC 的 ICD-10 代碼為 C22.0，PLC 病例的相關變量主要為發病日期和死亡日期（如死亡），同時獲取其他腫瘤的發病、死亡信息（包括腫瘤名稱、ICD 代碼、發病日期、死亡日期）及其他疾病的死因信息（包括疾病名稱、ICD 代碼、死亡日期）。
1.4 統計分析
采用 SAS 9.3 軟件進行統計分析。符合或近似符合正態分布的連續變量采用均數±標準差表示，明顯偏態分布的連續變量采用中位數（四分位間距）表示，分類變量采用頻數及構成比表示。解釋變量采用逐步法（stepwise method）進入多因素 Cox 比例風險回歸模型，計算危險比（hazard ratio，HR）及 95% 可信區間（confidence interval，CI），獨立危險因素組合對肝癌發病的區分能力評估采用 ROC 曲線。所有假設檢驗均為雙側，設定 P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 啟東 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列基線情況
2011 年 6 月 16 日至 2013 年 6 月 30 日，在啟東市人民醫院檢驗科簽署了知情同意書的初次 HBsAg 檢測結果陽性者共 1 390 名，剔除現患肝癌（肝癌發病日期早于基線日期及基線日期后半年內肝癌發病者）69 名，隨后進一步剔除 3 個月內死亡的研究對象 5 名以及半年內第二次 HBsAg 檢測結果陰性者 20 名，最終確定納入啟東 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列的研究人群共 1 296 例，其中男性 686 例，平均年齡為 45.73±11.58 歲，女性 610 例，平均年齡為 45.67±12.33 歲。詳細的基線指標分布情況見表 1。
表1
納入隊列的對象的基線特征
2.2 基線指標與肝癌發病關聯的單因素 Cox 比例風險回歸分析
截止 2017 年 10 月 1 日，經過 5.5 年的平均隨訪期，1 296 名研究對象隨訪總人年為 7 111 人年，共確認新發肝癌 43 例，肝癌人年發病率為 60.5 百萬人年。單因素 Cox 比例風險回歸分析的結果顯示：年齡（連續變量）、男性（相對于女性）、有肝癌家族史（相對于無）、HBV e 抗原陽性（相對于陰性）、基線 AST 升高（相對于正常值上限及以下）、基線 GGT 升高（相對于正常值上限及以下）與肝癌發病相關（P 值均<0.05），詳見表 2 所示。
表2
與肝癌結局關聯的單因素 Cox 比例風險回歸模型
2.3 肝癌發病的獨立危險因素
進一步多因素 Cox 比例風險回歸分析的結果顯示：年齡、男性、具有肝癌家族史、HBeAg 陽性及基線 GGT 異常升高是肝癌發病的獨立危險因素（P 值均<0.05），詳見表 3所示。
表3
多因素 Cox 回歸分析計算肝癌發病的獨立危險因素
2.4 危險因素組合預測肝癌發病的 ROC 曲線分析
ROC 曲線的結果顯示，年齡、性別、肝癌家族史、HBeAg 狀態、基線 GGT 水平五個指標區分肝癌 3 年及 5 年發病的 ROC 曲線下面積分別為 0.796（0.694，0.898）和 0.779（0.709，0.849），P 值<0.05。不同危險因素組合預測肝癌發病的 ROC 曲線比較見圖 1 所示。5個指標預測 3 年和 5 年肝癌發病的 ROC 曲線下面積均大于 0.7，并且接近 0.8 的優良水平，說明上述五項臨床常規指標可應用于 HBsAg 攜帶者中肝癌高危人群的進一步篩選。
圖1
常規指標組合篩選肝癌發病高危人群的 ROC 曲線分析
3 討論
在我國農村的 HBsAg 攜帶者人群中，年齡增長、男性以及具有肝癌家族史是 PLC 發病的三個常見宿主危險因素。本研究結果顯示，年齡（連續變量）與肝癌發病關聯的危險比為 1.055，表明年齡每增加1歲，肝癌發病風險增加 5.5%。男性肝癌發病風險約為女性的 3 倍（HR=3.263），與中國人群肝癌導致的 DALYs 疾病負擔分析得出的結果一致[5]。具有肝癌家族史的 HBsAg 攜帶者的肝癌發病風險約為無肝癌家族史對象的 2 倍（HR=2.315）。年齡、性別及肝癌家族史三項指標為恒定不可逆的危險因素，對于 HBsAg 攜帶者人群中肝癌風險的進一步辨識非常重要[6, 7]。本研究還顯示年齡、性別、肝癌家族史三項指標區分肝癌 3 年和 5 年發病風險的 ROC 曲線下面積分別為 0.79 和 0.75，均大于 0.7，說明區分能力良好。本研究未詢問患者肝炎史，因在隊列問卷調查實施過程中，相較于詢問研究對象的自身及家族肝炎史，詢問直系親屬肝癌家族史受回憶偏倚影響更小，回饋信息更為可靠。
本研究發現基線 GGT 升高是 HBsAg 攜帶者肝癌發病的獨立危險因素（HR=2.721），與我國臺灣地區的隊列研究結果一致[8]。臺灣的 HBsAg 攜帶者隊列研究還發現基線 ALT 為肝癌發病的獨立危險因素[9]，而我國香港以及韓國的 HBsAg 攜帶者隊列研究未發現基線 ALT 升高是肝癌發病的獨立危險因素[10, 11]。本研究也顯示基線 ALT 或 AST 升高不是肝癌發病的獨立危險因素，說明一次基線 ALT 或不適宜作為肝癌發病的一個預測指標。后續我們將對本隊列的縱向多次 ALT、AST 和 GGT 等數據進行分析，有望闡明常規肝功指標動態變化與肝癌發病間的關聯。
HBeAg 是 HBV 慢性感染的主要病毒學指標之一，基線 HBeAg 陽性已經被國內外的 HBsAg 攜帶者隊列研究反復證實為肝癌發病的獨立危險因素，但其權重有下降的趨勢[12, 13]。本研究得出 HBeAg 陽性者相對于陰性者，肝癌發病的 HR 為 2.367。HBeAg 陽性與肝癌發病關聯強度的下降說明進入廣泛的抗 HBV 藥物治療時代后，不僅 HBV DNA 載量在抗病毒治療后顯著下降，HBeAg 的轉陰率也更高，更多的 HBeAg 陰性亞組對象發生肝癌。我們認為在目前農村肝癌篩查技術規范中，在檢測 HBsAg 的同時行 HBeAg 和 GGT 等指標檢測，對于篩選肝癌更高危人群將有較大幫助。
本研究的不足：受限于經費等實際困難，未能與同期建立的江蘇省另一 HBV 慢性感染隊列一樣，實現隊列研究對象基線 HBV DNA 檢測的全覆蓋[14]。本隊列的研究對象來自檢驗科臨床檢驗中發現的所有 HBsAg 陽性者，相較于慢乙肝臨床治療隊列[15]抗病毒治療率低，且基線問卷顯示隊列例抗病毒治療不規范，不利于構建抗病毒治療亞隊列研究；而本隊列研究相比于農村肝癌早診早治隊列[16]的優點是基線指標更加齊全，缺點是肝膽超聲檢查率較低，從而無法有效評估肝硬化狀態，同時也需要解決基線臨床指標缺失的問題。目前本隊列已進入國家重點研發計劃精準醫學專項肝病隊列研究，后續將以更嚴格的質控來彌補上述缺點。
目前我國肝癌篩查模式的效力屢受質疑[17, 18]，如能在 HBsAg 攜帶者中進一步明確高危亞組，則可在恰當時機、給予更恰當間隔，更準確的血清學檢測和/或影像學檢查[19]。反之，如能確認無需頻繁篩查的低危人群，則可讓篩查的成本效益最大化[20]。綜上所述，通過對啟東現場 1 296 名 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列的隨訪，本研究確認了臨床常規指標可用作 HBsAg 攜帶者人群肝癌發病風險的進一步區分，有助于我國農村地區肝癌篩查策略的優化。
目前，我國仍有大量的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染人群，他們是原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）發病的高風險人群[1, 2]。根據在肝癌高發區積累的肝癌篩查經驗，我國農村肝癌早診早治項目對 35～64 歲成年人采用乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）結合甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和肝膽超聲初篩，對 HBsAg 陽性者進行一年兩次的 HBsAg、AFP 和肝膽超聲復查[3]，多年實施結果發現這種篩查模式存在一定局限性，基于社區的 HBsAg 攜帶人群的肝癌發病風險差異較大[4]，如能從農村 HBsAg 攜帶人群中篩選出更高危肝癌發病的亞組，可進一步提高后續篩查效力。本研究在啟東建立 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列，探索與 PLC 發病相關的常規臨床指標，以及利用這些常規臨床指標進行肝癌高危人群進一步篩選的可能性。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入標準：① 2011 年 6 月 16 日至 2013 年 6 月 30 日在啟東市人民醫院檢驗科行 HBV 感染標志物檢測時發現的 HBsAg 陽性者（包括體檢中心體檢對象中接受 HBsAg 檢測人員、門診及病區所有接受 HBsAg 檢測人員），年齡 13 周歲及以上。排除標準：① 原發性或轉移性肝癌現患病人；② 患其他惡性腫瘤或其他嚴重疾病不能參與隨訪者；③ 所有人員接受半年內 HBsAg 復檢，HBsAg 復檢結果轉為陰性者；④ 高齡體弱者。所有研究對象在進入本隊列研究前均做到知情同意并簽署知情同意書（未成年對象由監護人簽署知情同意），且本隊列研究事先經啟東市人民醫院/啟東肝癌防治研究所倫理委員會討論并審核通過。
1.2 研究指標
基線調查內容包括：① 人口社會學信息，如身份證號碼、常住地址、婚姻狀況、職業、教育程度和聯系方式等；② 疾病相關信息如肝癌家族史、抗 HBV 藥物治療史等；③ HBV 病毒學指標，全體對象采用酶聯免疫法（艾迪康 ELISA600）行乙肝兩對半檢測，部分對象接受 HBV DNA 檢測；④ 肝生化指標，包括谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、血清總蛋白（total protein，TP）、血清白蛋白（albumin，ALB）、γ-谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP），檢測方法為速率法等（貝克曼 AU5800）。
1.3 結局指標
研究結局為新發肝癌，肝癌發病數據來自啟東腫瘤登記處并與啟東生命統計處的全死因數據進行核對。采用身份證號碼為主，結合研究對象姓名、年齡及所屬鄉鎮核對的方式進行數據鏈接。PLC 的 ICD-10 代碼為 C22.0，PLC 病例的相關變量主要為發病日期和死亡日期（如死亡），同時獲取其他腫瘤的發病、死亡信息（包括腫瘤名稱、ICD 代碼、發病日期、死亡日期）及其他疾病的死因信息（包括疾病名稱、ICD 代碼、死亡日期）。
1.4 統計分析
采用 SAS 9.3 軟件進行統計分析。符合或近似符合正態分布的連續變量采用均數±標準差表示，明顯偏態分布的連續變量采用中位數（四分位間距）表示，分類變量采用頻數及構成比表示。解釋變量采用逐步法（stepwise method）進入多因素 Cox 比例風險回歸模型，計算危險比（hazard ratio，HR）及 95% 可信區間（confidence interval，CI），獨立危險因素組合對肝癌發病的區分能力評估采用 ROC 曲線。所有假設檢驗均為雙側，設定 P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 啟東 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列基線情況
2011 年 6 月 16 日至 2013 年 6 月 30 日，在啟東市人民醫院檢驗科簽署了知情同意書的初次 HBsAg 檢測結果陽性者共 1 390 名，剔除現患肝癌（肝癌發病日期早于基線日期及基線日期后半年內肝癌發病者）69 名，隨后進一步剔除 3 個月內死亡的研究對象 5 名以及半年內第二次 HBsAg 檢測結果陰性者 20 名，最終確定納入啟東 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列的研究人群共 1 296 例，其中男性 686 例，平均年齡為 45.73±11.58 歲，女性 610 例，平均年齡為 45.67±12.33 歲。詳細的基線指標分布情況見表 1。
表1
納入隊列的對象的基線特征
2.2 基線指標與肝癌發病關聯的單因素 Cox 比例風險回歸分析
截止 2017 年 10 月 1 日，經過 5.5 年的平均隨訪期，1 296 名研究對象隨訪總人年為 7 111 人年，共確認新發肝癌 43 例，肝癌人年發病率為 60.5 百萬人年。單因素 Cox 比例風險回歸分析的結果顯示：年齡（連續變量）、男性（相對于女性）、有肝癌家族史（相對于無）、HBV e 抗原陽性（相對于陰性）、基線 AST 升高（相對于正常值上限及以下）、基線 GGT 升高（相對于正常值上限及以下）與肝癌發病相關（P 值均<0.05），詳見表 2 所示。
表2
與肝癌結局關聯的單因素 Cox 比例風險回歸模型
2.3 肝癌發病的獨立危險因素
進一步多因素 Cox 比例風險回歸分析的結果顯示：年齡、男性、具有肝癌家族史、HBeAg 陽性及基線 GGT 異常升高是肝癌發病的獨立危險因素（P 值均<0.05），詳見表 3所示。
表3
多因素 Cox 回歸分析計算肝癌發病的獨立危險因素
2.4 危險因素組合預測肝癌發病的 ROC 曲線分析
ROC 曲線的結果顯示，年齡、性別、肝癌家族史、HBeAg 狀態、基線 GGT 水平五個指標區分肝癌 3 年及 5 年發病的 ROC 曲線下面積分別為 0.796（0.694，0.898）和 0.779（0.709，0.849），P 值<0.05。不同危險因素組合預測肝癌發病的 ROC 曲線比較見圖 1 所示。5個指標預測 3 年和 5 年肝癌發病的 ROC 曲線下面積均大于 0.7，并且接近 0.8 的優良水平，說明上述五項臨床常規指標可應用于 HBsAg 攜帶者中肝癌高危人群的進一步篩選。
圖1
常規指標組合篩選肝癌發病高危人群的 ROC 曲線分析
3 討論
在我國農村的 HBsAg 攜帶者人群中，年齡增長、男性以及具有肝癌家族史是 PLC 發病的三個常見宿主危險因素。本研究結果顯示，年齡（連續變量）與肝癌發病關聯的危險比為 1.055，表明年齡每增加1歲，肝癌發病風險增加 5.5%。男性肝癌發病風險約為女性的 3 倍（HR=3.263），與中國人群肝癌導致的 DALYs 疾病負擔分析得出的結果一致[5]。具有肝癌家族史的 HBsAg 攜帶者的肝癌發病風險約為無肝癌家族史對象的 2 倍（HR=2.315）。年齡、性別及肝癌家族史三項指標為恒定不可逆的危險因素，對于 HBsAg 攜帶者人群中肝癌風險的進一步辨識非常重要[6, 7]。本研究還顯示年齡、性別、肝癌家族史三項指標區分肝癌 3 年和 5 年發病風險的 ROC 曲線下面積分別為 0.79 和 0.75，均大于 0.7，說明區分能力良好。本研究未詢問患者肝炎史，因在隊列問卷調查實施過程中，相較于詢問研究對象的自身及家族肝炎史，詢問直系親屬肝癌家族史受回憶偏倚影響更小，回饋信息更為可靠。
本研究發現基線 GGT 升高是 HBsAg 攜帶者肝癌發病的獨立危險因素（HR=2.721），與我國臺灣地區的隊列研究結果一致[8]。臺灣的 HBsAg 攜帶者隊列研究還發現基線 ALT 為肝癌發病的獨立危險因素[9]，而我國香港以及韓國的 HBsAg 攜帶者隊列研究未發現基線 ALT 升高是肝癌發病的獨立危險因素[10, 11]。本研究也顯示基線 ALT 或 AST 升高不是肝癌發病的獨立危險因素，說明一次基線 ALT 或不適宜作為肝癌發病的一個預測指標。后續我們將對本隊列的縱向多次 ALT、AST 和 GGT 等數據進行分析，有望闡明常規肝功指標動態變化與肝癌發病間的關聯。
HBeAg 是 HBV 慢性感染的主要病毒學指標之一，基線 HBeAg 陽性已經被國內外的 HBsAg 攜帶者隊列研究反復證實為肝癌發病的獨立危險因素，但其權重有下降的趨勢[12, 13]。本研究得出 HBeAg 陽性者相對于陰性者，肝癌發病的 HR 為 2.367。HBeAg 陽性與肝癌發病關聯強度的下降說明進入廣泛的抗 HBV 藥物治療時代后，不僅 HBV DNA 載量在抗病毒治療后顯著下降，HBeAg 的轉陰率也更高，更多的 HBeAg 陰性亞組對象發生肝癌。我們認為在目前農村肝癌篩查技術規范中，在檢測 HBsAg 的同時行 HBeAg 和 GGT 等指標檢測，對于篩選肝癌更高危人群將有較大幫助。
本研究的不足：受限于經費等實際困難，未能與同期建立的江蘇省另一 HBV 慢性感染隊列一樣，實現隊列研究對象基線 HBV DNA 檢測的全覆蓋[14]。本隊列的研究對象來自檢驗科臨床檢驗中發現的所有 HBsAg 陽性者，相較于慢乙肝臨床治療隊列[15]抗病毒治療率低，且基線問卷顯示隊列例抗病毒治療不規范，不利于構建抗病毒治療亞隊列研究；而本隊列研究相比于農村肝癌早診早治隊列[16]的優點是基線指標更加齊全，缺點是肝膽超聲檢查率較低，從而無法有效評估肝硬化狀態，同時也需要解決基線臨床指標缺失的問題。目前本隊列已進入國家重點研發計劃精準醫學專項肝病隊列研究，后續將以更嚴格的質控來彌補上述缺點。
目前我國肝癌篩查模式的效力屢受質疑[17, 18]，如能在 HBsAg 攜帶者中進一步明確高危亞組，則可在恰當時機、給予更恰當間隔，更準確的血清學檢測和/或影像學檢查[19]。反之，如能確認無需頻繁篩查的低危人群，則可讓篩查的成本效益最大化[20]。綜上所述，通過對啟東現場 1 296 名 HBsAg 攜帶者臨床檢驗隊列的隨訪，本研究確認了臨床常規指標可用作 HBsAg 攜帶者人群肝癌發病風險的進一步區分，有助于我國農村地區肝癌篩查策略的優化。
